Stabilizácia mitochondriálnej membrány pomocou polysacharidu Angelica Sinensis pri myšej aplastickej anémii

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Abstraktné

Aby sa preskúmal mechanizmus stabilizácie mitochondriálnej membrány pomocou polysacharidu Angelica Sinensis (ASP) u myší s aplastickou anémiou (AA) ICR, myši boli náhodne rozdelené do kontrolných skupín. Skupiny liečené AA a ASP Myši skupiny AA boli liečené 60Co Y a intraperitoneálnymi injekciami cyklofosfamidu a chloramfenikolu. Kontrolné zvieratá boli ošetrené ožarovaním s oloveným tienením a injekciou fyziologického roztoku. Ošetrené AA myši boli kŕmené ASP počas 2 týždňov. Mitochondriálna ultraštruktúra kostnej drene bola pozorovaná transmisnou elektrónovou mikroskopiou a transmembránový potenciál buniek s jadrom kostnej drene (BMNC) bol skúmaný fluorescenčnou spektrofotometriou. Obsahy Cox a MDH v médiu boli tiež študované v troch skupinách. Počet mitochondrií a transmembránový potenciál BMNC v kostnej dreni sa znížili v skupine AA v porovnaní s kontrolnou skupinou, ale zlepšili sa v skupine liečenej ASP v porovnaní s skupina AA. Kompletné mitochondriálne štiepenie v skupine liečenej ASP bolo významne oneskorené (P< 0.05)="" as="" compared="" to="" the="" aa="" group.="" we="" conclude="" that="" asp="" might="" improve="" mitochondrial="" membrane="" stabilization,="" and="" suppress="" the="" downregulation="" of="" transmembrane="" potential="" and="" apoptosis="" of="" bmnc="" in="">

Kľúčové slová: aplastická anémia, polysacharid Angelica Sinensis, mitochondrie, membránový potenciál, ICR myši

extrakt z cistanche: podporuje tvorbu kostí a zvyšuje hustotu kostí

Pozadie

Aplastická anémia (AA) je ochorenie krvi, pri ktorom je poškodená kostná dreň a súvisiace krvné kmeňové bunky, čo spôsobuje nedostatok červených krviniek, bielych krviniek a krvných doštičiek. Tieto nedostatky sú individuálne známe ako anémia, leukopénia a trombocytopénia a súhrnne známe ako pancytopénia. Vystavenie chemikáliám, liekom, žiareniu, rádioaktívnym materiálom, zariadeniam produkujúcim žiarenie, infekcia. imunitné ochorenie, dedičnosť (v 50 percentách prípadov) a neznáma etiológia môžu tiež viesť k rozvoju AA.

Mitochondrie sú považované za „elektrárne bunky“, pretože produkujú adenozíntrifosfát (ATP) systematickým získavaním energie z molekúl živín (substrátov)[1]. Okrem toho sa mtDNA replikuje s vysokou rýchlosťou mutácií, pretože jej chýbajú ochranné históny a účinný systém opravy DNA. Mutácie v mtDNA sú spojené s hematologickými ochoreniami, ako je získaná sideroblastická anémia, myelodysplastické syndrómy a získaná AA [2-4]. Naša predchádzajúca štúdia 5] ukázala, že funkčné poškodenie mitochondriálneho dýchacieho reťazca vyvolané mutáciami sa môže podieľať na zlyhaní hematopoézy u pacientov s AA. Bez ohľadu na morfologické znaky konečného štádia bunkovej smrti (apoptotické, nekrotické, autofagické alebo mitotické), permeabilizácia mitochondriálnej membrány (MMP) je často rozhodujúcou udalosťou medzi prežitím a smrťou [6].

Podľa tradičnej čínskej medicíny Angelica Sinensis pomáha pri zjednocovaní krvi a podpore jej cirkulácie [7]. Nedávne štúdie ukázali, že extrakty z Angelica Sinensis majú antioxidačné a neuroprotektívne účinky [8,9]. Antioxidačná funkcia ASP však zostáva nejasná. Táto štúdia skúmala skoré poškodenie buniek pomocou časovej krivky mitochondriálnej lýzy a účinku ASP na stabilizáciu mitochondriálnej membrány v AA.

Doplnok cistanche zvyšuje hustotu kostí a podporuje tvorbu kostí

Materiály a metódy

Zoskupovanie zvierat

Zdravé samce myší ICR s hmotnosťou 18-22 g, vo veku 6-8 týždňov, boli poskytnuté Experimentálnym zvieracím centrom univerzity Shandong (Čína). Zvieratá boli umiestnené v teplom, tichom prostredí s voľným prístupom k potrave a vode. a aklimatizovali sa jeden týždeň pred začiatkom experimentov.

Myši boli náhodne rozdelené do troch skupín: normálna skupina, AA skupina a liečená skupina. Model aplastickej anémie bol vytvorený tak, ako bolo opísané vyššie [10].

V stručnosti, myši boli ožiarené 2.0Gy 60Coy a potom liečené dennými intraperitoneálnymi injekciami 40 mg/kg/deň cyklofosfamidu a 50 mg/kg/deň chloramfenikolu počas nasledujúcich troch dní. Liečená skupina bola intragastricky kŕmená ASP (200 mg/kg/deň, podľa Čínskeho lekárskeho slovníka). Kontrolná skupina a myši skupiny AA boli intragastricky kŕmené fyziologickým soľným roztokom (10 ml/kg/d) doplnenou stravou. Okrem toho všetky myši počas štúdie dostávali štandardnú stravu. Po ošetrení ASP alebo fyziologickým roztokom počas 2 týždňov boli myši usmrtené cervikálnou dislokáciou.

Hematologické vyšetrenie

Vzorky krvi z chvosta z troch skupín sa odoberali v prvý a štrnásty deň. Vo vzorkách periférnej krvi sa spočítali WBC a krvné doštičky a stanovili sa hladiny Hb. Po dokončení experimentov boli myši usmrtené a stehenné stery boli pripravené na diferenciálne počítanie buniek s jadrom kostnej drene (BMNC) (obrázok 1).

Transmisná elektrónová mikroskopia

Stehenná dreň bola rozmazaná a narezaná na ultratenké rezy. Mitochondrie hematopoetických buniek vo femorálnej dreni boli analyzované a spočítané pomocou transmisnej elektrónovej mikroskopie (JEM{0}}EX, Japonsko) v 50 zorných poliach.

Časová krivka mitochondriálnej lýzy

Mitochondrie boli extrahované z myších BMNC podľa protokolu výrobcu súpravy na izoláciu mitochondrií (Pierce Biotechnology Inc., USA). Koncentrácia monoaminooxidázy (MAO) označuje koncentráciu mitochondrií a bola stanovená s použitím 200 U/ml mitochondriálnych suspenzií z 20 sérových kultúr v priebehu 12 hodín v rôznych časových bodoch (30 minútové intervaly). Stanovili sa aj obsahy cytochróm oxidázy (Cox) a malátdehydrogenázy (MDH) v médiu. Analýza času píku mitochondriálnej membrány a krivky závislosti koncentrácie enzýmu od času matrice ukázali rozsah lýzy mitochondriálnej membrány.

Mitochondriálny membránový potenciál

Po predinkubácii s MAO alebo ASP boli izolované mitochondrie z troch skupín resuspendované v 0,5 ml fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku (Wuhan Boster Biotechnology, Ltd., Čína) a 10 ul pracovného roztoku rodamínu 123 ( Sigma-Aldrich, USA) a inkubované pri 37 °C v 5 percentách CO2 počas 15 minút Potenciál mitochondriálnej membrány sa analyzoval prietokovou cytometriou s použitím excitačnej vlnovej dĺžky 490 nm a emisnej vlnovej dĺžky 520 nm.

Štatistická analýza

Štatistická analýza bola vykonaná pomocou softvéru SPSS 19.0. Údaje sú vyjadrené ako priemery a štandardné odchýlky. Na porovnanie rôznych skupín bol použitý študentský t-test. P < 0,05="" sa="" považovalo="" za="" štatisticky="">

bylina cistanche: pre lepšiu kvalitu kostí

Výsledky

Počty periférnej krvi a BMC

Pomocou plne automatického analyzátora krviniek sa zistilo, že počet periférnych krviniek a BMC u AA myší sa výrazne znížil (P<0.05), indicating="" that="" the="" aa="" mouse="" model="" was="" successfully="" established="" (table="">

Mitochondriálna ultraštruktúra u myší s aplastickou anémiou

Transmisná elektrónová mikroskopia kostnej drene AA myší ukázala, že mitochondriálna ultraštruktúra sa významne zlepšila s ASP v liečenej skupine (tabuľka 2 a obrázok 1), čo naznačuje, že ASP stabilizuje mitochondrie u AA myší. Veľkosť a tvar mitochondrií kontrolnej skupiny boli normálne. Na rozdiel od toho. mitochondrie skupiny AA mali zväčšené globulárne štruktúry spolu s narušením alebo vymiznutím krístok (obrázok 1A-C).

Mitochondriálny membránový potenciál (MMP) u myší s aplastickou anémiou

Keďže transmisná elektrónová mikroskopia odhalila mitochondriálne poškodenie, určili sme účinok ASP na MMP u AA myší meraním relatívnych rozdielov vo fluorescencii Rh 123 medzi tromi skupinami pomocou fluorescenčného spektrofotometra.

Výsledky ukázali, že Rh 123 fluorescencia buniek kostnej drene v skupine AA (19,6±3,03) bola nižšia ako v kontrolnej skupine (31,7±2,59, P<0.0). however,="" the="" rh="" 123="" fluorescence="" of="" the="" asp-treated="" aa="" group="" was="" higher="" than="" that="" in="" the="" aa="" group=""><0.0i)(table 2="" and="" figure="" 2),="" indicating="" that="" asp="" facilitated="" the="" recovery="" of="" the="" mmp="" in="" aa="">

Časová krivka mitochondriálnej lýzy skorého poškodenia buniek

V kontrolnej skupine trvalo obsahu mitochondriálnej in vitro kultúry Cox a MDH 3,5 hodiny, kým dosiahol vrchol. Obsah MAO v kultúre sa v priebehu času výrazne nemenil, ale obsahy COX a MDH sa s časom postupne zvyšovali, dosiahli vrchol a potom postupne klesali. Úplnému mitochondriálnemu obsahu uvoľnenému bunkami teda trvalo asi 3,5 hodiny, kým dosiahol vrchol štiepenia.

Píky COX a MDH v skupine AA sa objavili pri 1,5 hodine, 1,375 U/, resp. 36,732 U/l. Píky COX a MDH v liečenej skupine sa objavili po 5,5 hodine, 6,5 hodine, 1,341 U/l, 33,994 U/. Na štatistickú analýzu sa v každom časovom bode použili dva súbory údajov. Po 1,5 hodine boli hladiny COX a MDH v skupine AA významne vyššie ako v skupine liečenej (P < 0.05).="" kompletné="" mitochondriálne="" štiepenie="" v="" sére="" sa="" preto="" po="" pridaní="" asp="" významne="" oneskorilo="" (p="">< 0,05)="" s="" miernym="" poklesom="" vrcholu="" (obrázok="">

Diskusia

Aplastická anémia (AA) je syndróm zlyhania kostnej drene charakterizovaný periférnou pancytopéniou a hypopláziou drene. Mutácie a nestabilita mtDNA boli preukázané pri viacerých ochoreniach. Mitochondriálna dysfunkcia a zníženie počtu mitochondrií môže viesť k redukcii mtDNA. Získané delécie mtDNA v hematopoetickom kompartmente sa vyskytujú pri ťažkej pancytopénii a retikulocytopénii [11]. Na základe nášho predchádzajúceho výskumu [5] sme skúmali, či ASP môže stabilizovať mitochondriálnu membránu AA myší.

Angelica Sinensis polysacharid-železo komplex (APIC) má nielen vynikajúci terapeutický účinok na IDA, ale aj na doplnenie krvi a podporu krvného obehu [12]. ASP môže byť užitočná na liečbu chorôb vyvolaných nadmernou expresiou hepcidínu prevenciou Janus-kinázy (JAK), syna matiek proti extracelulárnej dekapentaplegickej (SMAD) a dráhe kinázy regulovanej 1 signálom (ERK), aby sa znížila expresia hepcidínu u potkanov IDA [13 ]. Qin J zistil, že ASP môže zlepšiť syntézu proteoglykánu (PG) v chondrocytoch v potkanom modeli OA in vivo a IL-1B-stimulovaných chondrocytoch in vitro podporou expresie agrekanu a GT zapojených do syntézy PG [14].

V našej štúdii bol myšací model AA indukovaný kombináciou acetylfenylhydrazínu, röntgenových lúčov a cyklofosfamidu. AA myši vykazovali štatisticky významné zníženie počtu leukocytov v periférnej krvi, Hb a krvných doštičiek (tabuľka 1) a výrazné zníženie počtu buniek humerálnej drene a progenitorových buniek zapojených do kostnej drene, čo sú klinické charakteristiky AA. AA myši liečené ASP vykazovali progresívny nárast BM buniek v porovnaní so skupinou AA. Okrem toho bol ovplyvnený aj počet mitochondrií v hematopoetických bunkách. ASP viedla k významne vyššiemu počtu mitochondrií v liečenej skupine v porovnaní so skupinou AA (obrázok 1). Tieto výsledky ukázali, že ASP môže podporovať proliferáciu buniek s jadrom drene, zvýšiť počet mitochondrií a stabilizovať mitochondriálnu membránu u AA myší.

Mitochondriálne poškodenie sa prejavuje poškodením mtDNA a poklesom hladín transkriptov mtRNA, syntézy proteínov a mitochondriálnej funkcie, čo môže viesť k zníženiu bunkovej energie, narušeniu bunkovej signalizácie a interferencii s bunkovou diferenciáciou a apoptózou. Okrem toho nedostatočná mitochondriálna produkcia ATP môže podporovať chromozomálnu nestabilitu [15]. Keďže mtDNA kóduje zložky štyroch z piatich mitochondriálnych respiračných komplexov, zmeny v mtDNA vedú k mitochondriálnej chorobe [16-18]. Okrem mitochondriálnej choroby sú mutácie v mtDNA spojené s rakovinou, cukrovkou. srdcovo-cievne ochorenia. neurodegeneratívne poruchy, hematologické ochorenia, ako je leukémia, ako aj normálny proces starnutia [19]. Dôležité je, že mutácie mtDNA, ako aj zníženie počtu kópií mtDNA, môžu byť patogénne [20, 21]. Pochopenie bunkových mechanizmov na udržanie integrity mtDNA a počtu kópií je nanajvýš dôležité, pretože môže poskytnúť ciele pre klinické intervencie zamerané na prevenciu a liečbu hematologických ochorení, ako je AA. Tieto faktory môžu tiež viesť k zníženiu energetického metabolizmu, čo ovplyvní samoobnovu a diferenciáciu hematopoetických kmeňových buniek.

Zistenia tejto štúdie ukazujú, že ASP môže zlepšiť mitochondriálnu ultraštruktúru a potlačiť downreguláciu transmembránového potenciálu a apoptózu myeloidných prvkov na vyliečenie zlyhania kostnej drene.

Cistanche a extrakt z cistanche: vhodné pre kosti

Referencie

1 Chinnery PF, Schon EA. Mitochondrie. J Neurol Neurosurg Psychiatry 2003, 74: 1188-1199.

2. Gattermann N. Mutácie mitochondriálnej DNA v hematopoetickom systéme. Leukémia 2004, 18:18-22.

3. Gattermann N, Retzlaff S, Wang YL a kol. Heteroplazmatické bodové mutácie mitochondriálnej DNA ovplyvňujúce podjednotku I cytochróm c oxidázy u dvoch pacientov so získanou idiopatickou sideroblastickou anémiou.Blood 1997,90:4961-4972.

Kim HR, Shin MG, Kim MJ a kol. Mitochondriálny

4. DNA aberácie buniek kostnej drene od pacientov s aplastickou anémiou. Korean Med Sci 2008, 23:1062-1067. X Cui, JO Wang, ZG Cai a kol. Kompletná sekvencia

5. analýza mitochondriálnej DNA a dĺžky telomér pri aplastickej anémii. Int J Mol Med 2014.34:1309-1314.

6. Chiu TL, Su CC. Tanshinon IA indukuje apoptózu v ľudských bunkách rakoviny pľúc A549 prostredníctvom indukcie reaktívnych foriem kyslíka a zníženia potenciálu mitochondriálnej membrány. Int J Mol Med 2010, 25:231-236.

7. Liu PJ. Hsieh WT. Huang SH a kol. Hematopoetický účinok vo vode rozpustných polysacharidov z Angelica Sinensis na myši s akútnou stratou krvi. Exp Hematol 2010, 38: 437-445.

8. Kuang X, Yao Y, Du JR a kol. Neuroprotektívna úloha 8F Z-ligustilidu proti ischemickému poškodeniu predného mozgu u myší ICR. Brain Res 2006, 1102:145-153.

9. Xin J. Zhang J. Yang Y, et al. Radi Angelica Sinensis, ktorý obsahuje zložku Z-ligustilid, podporuje neurogenézu dospelých s cieľom sprostredkovať zotavenie z kognitívnej poruchy Curr Neurovasc Res 203, 10:304-315.

10. Chen YF, Wu ZM, Xie C, et al. Úroveň expresie IL-6 vylučovaného stromálnymi bunkami kostnej drene u myší s aplastickou anémiou.ISRN Hematol 2013:986219.

11. Hatfill SJ, LaCock CJ, Laubscher R, et al. Arole pre mitochondriálnu DNA v patogenéze radiáciou indukovanej myelodysplázie a sekundárnej leukémie. Leuk Res 1993,17:907-913.

12. Wang PP, Zhang Y, Dai LQ a kol. Účinok komplexu polysacharid-železo Angelica Sinensis na anémiu z nedostatku železa u potkanov. Chin J Integr Med 2007, 13:297-300.

13. Zhang Y, Cheng Y, Wang N, a kol. Účinok signálnych dráh JAK, SMAD a ERK na supresiu hepcidínu polysacharidmi z Angelica Sinensis u potkanov s anémiou z nedostatku železa. Food Funct2014.5: 1381-1388.

14. Qin J, Liu YS, Liu J a kol. Účinok polysacharidov Angelica Sinensis na osteoartritídu in vivo a in vitro: možný mechanizmus na podporu syntézy proteoglykánov. Evid Based Complement Alternat Med 2013,79476.

15. Gattermann N. Mutácie mitochondriálnej DNA v hematopoetickom systéme. Leukémia 2004, 18:18-22.

16. Holt IJ, Harding AE, Morgan-Hughes JA. Delécie svalovej mitochondriálnej DNA u pacientov s mitochondriálnymi myopatiami. Nature 1988, 331:717-719.

17. Lestienne P, Ponsot G Kearns-Sayreov syndróm s deléciou svalovej mitochondriálnej DNA. Lancet 1988, 1:885.

18. Wallace DC, Singh G, Lott MT a kol. Mutácia mitochondriálnej DNA spojená s Leberovou dedičnou neuropatiou zrakového nervu.Science 1988, 242:1427-1430.

19. Wallace DC. Mitochondriálna paradigma metabolických a degeneratívnych chorôb, starnutia a rakoviny: úsvit evolučnej medicíny. Annu Rev Genet 2005, 39: 359-407.

20. Clay Montier LL, Deng JJ, Bai Y. Počet záleží: kontrola počtu mitochondriálnych kópií DNA cicavcov. J Genet Genomics 2009,36:125-131.

21. Rötig A, Poulton J. Genetické príčiny deplécie mitochondriálnej DNA u ľudí. Biochim Biophys Acta 2009, 1792:1103-1108.

extrakt z cistanche: podporuje tvorbu kostí a zvyšuje hustotu kostí