MTHFD2 je metabolický kontrolný bod kontrolujúci efektor a regulačný osud a funkciu T buniek

Grafický abstrakt

Autori:

Ayaka Sugiura, Gabriela Andrejeva, Kelsey Voss, ..., Ashutosh K. Mangalam, Joshua D. Rabinowitz, Jeffrey C. Rathmell

Korešpondencia:

jeff.rathmell@vumc.org

V skratke:

Na podporu rýchlej proliferácie T buniek je potrebná syntéza nukleotidov. Sugiura a kol. ukazujú, že de novo metabolizmus purínov signalizuje priamu diferenciáciu a funkciu T buniek a identifikujú MTHFD2 ako metabolický kontrolný bod a terapeutický cieľ pre zápalové ochorenia.

Zvýraznenie

• MTHFD2 je kritický pre aktivované CD4 T bunky na udržanie de novo syntézy purínov

• Nedostatočný MTHFD2 podporuje fenotypy a metabolizmus podobné bunkám Treg v bunkách Th17 d Inhibícia MTHFD2 potláča signalizáciu mTORC1 a mení metyláciu histónov

• MTHFD2 môže byť zameraný na ochranu pred zápalom a autoimunitou in vivo

MTHFD2 je metabolický kontrolný bod kontrolujúci osud a funkciu efektorových a regulačných T buniek

Ayaka Sugiura,¹Gabriela Andrejeva,¹Kelsey Voss,¹Darren R. Heintzman,¹Xincheng Xu,⁵Matthew Z. Madden,¹Xiang Ye,¹Katherine L. Beier,¹Nowrin U. Chowdhury,²Melissa M. Wolfová,²Arissa C. Youngová,¹Dalton L. Greenwood,¹Allison E. Sewellová,¹Shailesh K. Shahi,³Samantha N. Freedman,³Alanna M. Cameron,⁴Patrik Foerch,⁴Tim Bourne,⁴Juan C. Garcia-Canaveras,⁵John Karijolich,¹Dawn C. Newcomb,²Ashutosh K. Mangalam,³Joshua D. Rabinowitz,⁵a Jeffrey C. Rathmell^1,6,*

¹Vanderbilt Center for Immunobiology, Department of Patology, Microbiology and Immunology, Vanderbilt University Medical Center, Nashville, TN 37232, USA

²Department of Medicine, Division of Hematology and Onkology, Vanderbilt University Medical Center, Nashville, TN 37232, USA

³Katedra patológie, University of Iowa, Iowa City, IA 52242, USA

⁴Sitryx Therapeutics Limited, Magdalen Centre, Oxford Science Park, Oxford, UK

⁵Katedra chémie, Ludwig Cancer Research Institute, Princeton Branch, Lewis-Sigler Institute for Integrative Genomics, Princeton University, Princeton, NJ 08544, USA6Vedúci kontakt

* Korešpondencia: jeff.rathmell@vumc.org

https://doi.org/10.1016/j.immuni.2021.10.011

SÚHRN

Antigénna stimulácia podporuje metabolické preprogramovanie T buniek, aby sa splnili zvýšené biosyntetické, bioenergetické a signalizačné požiadavky. Ukázali sme, že enzým metabolizmu jedného uhlíka (1C) metyléntetrahydrofolátdehydrogenáza 2 (MTHFD2) reguluje de novo syntézu purínov a signalizáciu v aktivovaných T bunkách, aby podporil proliferáciu a produkciu zápalových cytokínov. V patogénnych T pomocných -17 (Th17) bunkách MTHFD2 zabránil aberantnej upregulácii transkripčného faktora FoxP3 spolu s nevhodným ziskom supresívnej kapacity. Nedostatok MTHFD2 tiež podporoval diferenciáciu regulačných T (Treg) buniek. Mechanicky viedla inhibícia MTHFD2 k vyčerpaniu purínových zásob, akumulácii purínových biosyntetických medziproduktov a zníženiu signalizácie mTORC1 senzora živín. MTHFD2 bol tiež rozhodujúci pre reguláciu metylácie DNA a histónu v bunkách Th17. Dôležité je, že nedostatok MTHFD2 znížil závažnosť ochorenia vo viacerých modeloch zápalových ochorení in vivo. MTHFD2 je teda metabolickým kontrolným bodom na integráciu purínového metabolizmu so signalizáciou patogénnych efektorových buniek a je potenciálnym terapeutickým cieľom v rámci metabolických dráh 1C.

ÚVOD

Účinná mobilizácia adaptívnej imunitnej odpovede vyžaduje silnú aktiváciu CD4 plus T buniek, aby prešli rýchlym bunkovým rastom a proliferáciou. To zahŕňa metabolické preprogramovanie riadené nutričným senzorom mTORC1 z katabolického pokojového stavu do anabolického rastového stavu so zvýšenými biosyntetickými, bioenergetickými a signalizačnými požiadavkami. V závislosti od cytokínového prostredia sa CD4 plus T bunky diferencujú na efektorové, ako aj regulačné podskupiny, ktoré majú odlišné metabolické programy, ktoré riadia ich efektorové funkcie (Bantug a kol., 2018; Buck a kol., 2015). Rovnováha týchto podskupín je rozhodujúca pre normálnu imunitu pri prevencii zápalových a autoimunitných ochorení. Napríklad roztrúsená skleróza (MS) je charakterizovaná zvýšenými T pomocnými -17 (Th17) bunkami produkujúcimi interleukín-17 (IL- 17) a zníženými alebo neúčinnými supresívnymi regulačnými T (Treg) bunkami (Dendrou et al., 2015). Zameranie sa na špecifické metabolické programy týchto podskupín T buniek ponúka alternatívny prístup k imunoterapii.

Terapia založená na bunkovom metabolizme sa začala v roku 1948, keď sa ukázalo, že antifolátové chemoterapeutiká sú účinné u detí s akútnou lymfoblastickou leukémiou (Farber et al., 1948). Folát prispieva k metabolizmu jedného uhlíka (1C) pri biosyntéze purínov, tvorbe metylových donorov a udržiavaní bunkovej redoxnej rovnováhy (Ducker a Rabinowitz, 2017; Yang a Vousden, 2016). Odvtedy bolo vyvinutých mnoho liekov, vrátane metotrexátu (MTX), fluóruracilu (5-FU) a merkaptopurínu (6-MP), aby sa zamerali na túto dráhu. Rýchlo proliferujúce bunky, vrátane rakovinových buniek a aktivovaných T buniek, zdieľajú závislosť na týchto dráhach pri syntéze DNA a RNA. MTX sa naďalej bežne používa na liečbu autoimunitných ochorení, ako je reumatoidná artritída (RA) (Brown et al., 2016). Avšak kvôli širokej expresii cieľových enzýmov sú tieto terapeutické činidlá spojené s bežnými a potenciálne závažnými nepriaznivými účinkami. Identifikácia cieľových metabolických enzýmov, ktoré sú selektívne dôležité v požadovaných bunkových populáciách, by mohla viesť k vývoju bezpečnejších a účinnejších imunoterapií.

Metabolizmus 1C zahŕňa cykly folátov a metionínu s prenosom jednotlivých uhlíkových jednotiek. Serín slúži ako donor 1C na aktiváciu tetrahydrofolátu (THF) na 5,10-metylénTHF so súčasnou produkciou glycínu. 5,10-metylénTHF sa potom môže oxidovať pomocou NAD(P) za vzniku purínového prekurzora 10- formylTHF. Alternatívne sa 10-formylTHF môže syntetizovať z formiátu a THF spôsobom závislým od ATP. V cytosolickej dráhe je produkcia 10-fomylTHF sprostredkovaná metylénTHF dehydrogenázou 1 (MTHFD1). Strata MTHFD1 hladuje bunky pre cytosolický 10-formylTHF, ablácia purínovej biosyntetickej kapacity a mutácie v MTHFD1 spôsobujú ťažkú ​​kombinovanú imunodeficienciu (SCID) (Field et al., 2015). Mitochondriálna dráha sa opiera o mitochondriálne MTHFD2 a MTHFD1-podobné (MTHFD1L).

Obrázok 1. Metabolizmus 1C a MTHFD2 sú upregulované v aktivovanom CD4^plusT buniek a v kontexte EAE

(A) Zmena druhov metabolizmu nukleotidov v in vitro diferencovanom CD4^plusPodskupiny T buniek v porovnaní s naivnými bunkami meranými hmotnostnou spektrometriou (n=3 biologických replikátov).

(B) Pracovný postup pre cielený skríning CRISPR v modeli zápalu pľúc in vivo.

(C) Zmena množstva gRNA z in vivo skríningu CRISPR zacieleného na metabolizmus 1C v primárnom CD4^plusT bunky (štatistická analýza vykonaná pomocou MAGECK, n=3 biologických replikátov).

(D) Expresia mRNA génov identifikovaných v (C) počas vývoja a aktivácie T buniek (údaje z prehliadača údajov ImmGen RNA-seq).

(E) Proteínová expresia génov identifikovaných v (C) v naivnom a aktivovanom CD4^plusT bunky (údaje z Immunological Proteome Resource [ImmPRes]).

(F) Expresia mRNA génov identifikovaných v (C) v plnej krvi jedincov s uvedenými zápalovými poruchami v porovnaní so zdravými kontrolnými jedincami (Aune et al., 2017). RA-MTX, RA pri liečbe MTX; SLE, systémový lupus erythematosus; MS-Tx naivná, SM bez predchádzajúcej liečby v čase diagnózy; MS-etablovaná, MS v liečbe a v remisii ochorenia; n=3 – 8 darcov.

(G) IHC ukazujúce farbenie CD3 a MTHFD2 v segmente cauda equina miechy myší so symptomatickou EAE pri zväčšení 2003 (hore; stupnica, 100 mm) a 4003 (dole; stĺpec stupnice, 50 mm) (údaje sú reprezentatívne dvoch nezávislých experimentov).

(H a I) Relatívna (H) stredná intenzita fluorescencie (MFI) a (I) mRNA expresia MTHFD2 v CD4^plusT bunky zo sleziny a miechy myší so symptomatickou EAE a sleziny kontrolných myší (priemer ± SD, jednosmerná ANOVA, údaje sú reprezentatívne pre dva nezávislé experimenty so 6 celkovými biologickými replikátmi).

(J) Expresia mRNA MTHFD2 v nediferencovanom CD4^plusT bunky 0, 5 a 24 hodín po aktivácii protilátkami anti-CD3 a anti-CD28 (priemer ± SD, jednosmerná ANOVA, n=3 biologických replikátov).

(K) Relatívna MTHFD2 MFI počas 5 dní po aktivácii v podskupinách CD4 plus T buniek, normalizovaná na pokojové bunky (priemer ± SD, n=3 biologických replikátov). Pozri tiež obrázok S1. Štatisticky významné výsledky sú označené (* p < 0.05,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p="">< 0,001,="" ****="" p="" percent="">

MTHFD2 je jedným z najviac indukovaných a nadmerne exprimovaných génov vo všetkých nádoroch (Nilsson et al., 2014). Aj keď je počas embryogenézy značne upregulovaný, MTHFD2 má malú alebo žiadnu expresiu vo väčšine dospelých tkanív (Nilsson et al., 2014). Pri protirakovinovej terapii (Zhu a Leung, 2020) môže inhibícia MTHFD2 viesť k zvýšenému oxidačnému stresu (Ju et al., 2019; Wan et al., 2020), závislosti od glycínu (Koufaris et al., 2016) a nedostatočnému syntéza purínov (Ben-Sahra et al., 2016; Pikman et al., 2016). Nedostatok MTHFD2 môže tiež potlačiť aktivitu mTORC1 prostredníctvom viacerých mechanizmov, vrátane deplécie guanínu a následnej inhibície mTORC1-aktivujúcej GTPázu Rheb (Emmanuel et al., 2017). Nedostatok MTHFD2 tiež spôsobuje akumuláciu medziproduktov dráhy syntézy purínov, vrátane analógu adenozínmonofosfátu (AMP) 5-aminoimidazolkarboxamidribonukleotidu (AICAR) (Ducker et al., 2016), ktorý môže aktivovať proteínkinázu aktivovanú AMP (AMPK) na inhibíciu mTORC1 (Su et al., 2019).

Pretože metabolizmus 1C integruje viaceré vstupy živín a je terapeuticky ovládateľný, skúmali sme úlohu 1Cmetabolizmu v CD4^plusPodskupiny buniek T efektor (Teff) a Treg. Prostredníctvom nezaujatého cieleného skríningu in vivo CRISPR-Cas{1}} v primárnych myších T bunkách sme identifikovali MTHFD2 ako zásah, ktorý bol tiež dôsledne upregulovaný u jedincov so zápalovými poruchami. Najmä nedostatok MTHFD2 zhoršil proliferáciu a funkciu buniek Teff. Nedostatok MTHFD2 tiež podporoval aberantnú expresiu FoxP3 a supresívnu aktivitu v bunkách Th17 a zároveň podporoval diferenciáciu buniek Treg. Tieto účinky boli spojené s akumuláciou AICAR, zníženými koncentráciami purínov, downreguláciou signalizácie mTORC1, zvýšeným mitochondriálnym metabolizmom a zmenenou metyláciou DNA a histónov. In vivo zacielenie na MTHFD2 chránilo pred viacerými modelmi zápalových ochorení. Tieto údaje ukazujú, že MTHFD2 slúži ako metabolický kontrolný bod v Th17 a Treg bunkách a zdôrazňujú potenciál tohto enzýmu ako cieľa protizápalovej imunoterapie.

VÝSLEDKY

Metabolizmus 1C a syntéza purínov sú v CD4 rozdielne aktívne^plusPodskupiny T buniek

Predpokladali sme, že syntéza nukleotidov sa môže v rámci CD4 líšiť^plusPodskupiny T buniek. CD4^plusT bunky sa diferencovali in vitro na bunky Th1, Th17 a Treg a po 72 hodinách sa zozbierali na hmotnostnú spektrometriu. Množstvo druhov nukleotidov bolo vo všeobecnosti zvýšené vo všetkých podskupinách v porovnaní s naivnými bunkami (obrázok 1A). Je pozoruhodné, že medziprodukty syntézy purínov boli rôzne bohaté, s najvyššou akumuláciou glycínamid ribonukleotidu (GAR), 1- (fosforibozyl) imidazolkarboxamidu (SAICAR) a AICAR v Th17 bunkách (obrázok S1A).

Testovať závislosť CD4^plusT bunky na enzýmoch v metabolizme 1C sme vykonali in vivo skríning CRISPR-Cas9-v primárnom CD4^plusT bunky (obrázok 1B). Vlastná knižnica vodiacej RNA (gRNA) bola skonštruovaná na zacielenie enzýmov v metabolizme 1C spolu s komplexom tuberóznej sklerózy 2 (TSC2) ako pozitívna kontrola a necielené negatívne kontroly (NTC). CD4^plusT bunky izolované z ovalbumínového (OVA) špecifického T bunkového receptora (TCR) transgénnych OT-II Cas9 dvojito transgénnych myší boli transdukované touto knižnicou a intravenózne prenesené do Rag1^{__ /__}hostiteľov. Myši sa potom imunizovali intranazálnym OVA na vyvolanie zápalu pľúc. T bunky získané z pľúc týchto myší boli sekvenované a bolo stanovené obohatenie alebo deplécia gRNA vzhľadom na vstupné frekvencie. TSC2 gRNA bola obohatená, čo podporuje inhibičnú úlohu tohto proteínu v T bunkách. Naopak, gRNA PPAT, AHCY, MAT2A a MTHFD1 sa výrazne vyčerpali a gRNA GART, DHFR, DNMT1, MTRR, MTR, SHMT2 a MTHFD2 sa znížili v menšej miere, čo naznačuje, že tieto gény prispievajú k proliferácii T buniek a zápalovej funkcii. in vivo (obrázky 1C a S1B).

Ďalej sme skúmali profil expresie génov identifikovaných zo skríningu. Hoci všetky boli pri vývoji tymocytov koordinovane upregulované, mRNA a proteín MTHFD2 boli najsilnejšie indukované v stimulovaných periférnych T bunkách (obrázky 1D a 1E). Okrem toho v samostatne publikovanom súbore údajov o sekvenovaní RNA (RNA-seq) z celej krvi jedincov s rôznymi zápalovými a autoimunitnými ochoreniami (Aune et al., 2017) bol MTHFD2 konzistentne nadmerne exprimovaný vo viacerých stavoch, vrátane ulceróznej kolitídy, Crohnovej choroby. celiakia, RA, systémový lupus erythematosus (SLE), psoriáza, psoriatická artritída, Sjo¨ Grenov syndróm a SM (obrázok 1F). Je pozoruhodné, že jedinci s nedávno diagnostikovanou SM mali významne zvýšenú expresiu MTHFD2 v porovnaní so zdravými darcami alebo jedincami s SM, ktorí podstúpili liečbu s remisiou ochorenia (obrázok S1C). Teda CD4^plusProliferácia a prežitie T buniek sú závislé od určitých génov metabolizmu 1C a expresia týchto génov sa líši v závislosti od štádií vývoja, aktivácie a diferenciácie T buniek, ako aj v prostredí patologického zápalu.

Obrázok 2. Nedostatok MTHFD2 zhoršuje CD4^plusProliferácia a funkcia T buniek

(A–D) Proliferácia meraná (A) riedením CellTrace Violet (CTV), (B) životaschopnosť, (C) expresia CD25 a (D) expresia TF v CD4^plusPodskupiny T buniek ošetrené MTHFD2i počas 72 hodín po aktivácii (priemer ± SD, jednosmerná ANOVA, údaje sú reprezentatívne pre tri nezávislé experimenty s 9 celkovými biologickými replikáciami).

MTHFD2 je vysoko upregulovaný v CD4 infiltrujúcom do CNS^plusT bunky pri experimentálnej autoimunitnej encefalomyelitíde (EAE) a pri aktivovanom CD4^plusT bunky in vitro

Regulácia MTHFD2 nebola dobre opísaná v CD4 plus T bunkách. Na meranie expresie MTHFD2 v zápalových léziách in vivo, CD4^plusT bunky z myelín-špecifických TCR transgénnych 2D2 myší boli aktivované a adoptívne prenesené do Rag1^{__ /__}myši na vyvolanie EAE. Keď myši začali vykazovať paralýzu zadnej nohy, segment cauda equina miechy sa analyzoval imunohistochémiou (IHC). Myši, ktoré dostali 2D2 T bunky, vykazovali obohatenie MTHFD2 a CD3^plusbunky, ktoré chýbali v kontrole (obrázok 1G). Ak chcete priamo určiť, či CD4^plusT bunky upregulovali MTHFD2 v zapálených léziách, T bunky zo sleziny a miechy myší podrobených myelínovému oligodendrocytovému glykoproteínu (MOG) a modelu EAE indukovaného toxínom čierneho kašľa (PTX) sa zhromaždili na analýzu. CD4 infiltrujúce do CNS^plusT bunky nadmerne exprimovali MTHFD2 v porovnaní so zodpovedajúcim CD4 sleziny^plusT bunky z kontrolných a EAE myší, ako bolo merané prietokovou cytometriou (obrázok 1H) a qRT-PCR (obrázok 11). Kinetika expresie MTHFD2 v CD4^plusĎalej sa merali T bunky in vitro. Robustná upregulácia MTHFD2 mRNA bola detegovaná po 5 hodinách stimulácie a začala klesať o 24 hodín (obrázok 1J), zatiaľ čo diferencovaný CD4^plusPodskupiny T buniek dosiahli najvyššiu expresiu proteínu MTHFD2 48 hodín po aktivácii (obrázok 1K). Tieto údaje ukazujú, že MTHFD2 je upregulovaný v CD4^plusT bunky s aktiváciou in vitro a v mieste zápalu in vivo.

CD4^plusPodskupiny T buniek rozdielne vyžadujú MTHFD2 na aktiváciu, proliferáciu, prežitie a produkciu cytokínov

Ďalej sme testovali úlohu MTHFD2 v aktivácii, diferenciácii, proliferácii a funkcii podskupiny CD4 plus T buniek. CD4^plusT bunky boli aktivované in vitro v prítomnosti cytokínov pre optimálnu diferenciáciu Th1, Th17 a Treg buniek a vehikula alebo inhibítora MTHFD2 (MTHFD2i; DS18561882) (Kawai et al., 2019). Po 72 hodinách mali všetky podskupiny zníženú proliferáciu (obrázok 2A) a počet živých cyklujúcich buniek (obrázky S2A a S2B). Životaschopnosť bola znížená v Th1 a Th17 bunkách (obrázok 2B) a aktivácia, meraná expresiou CD25, bola znížená vo všetkých podskupinách (obrázok 2C). Expresia transkripčného faktora (TF) charakteristického pre líniu bola znížená v Th1 bunkách (T-bet^plus), ale nezmenené v Th17 bunkách (ROR t^plus) a menili sa minimálne v Treg bunkách (FoxP3^plus) (obrázok 1D). Na meranie funkcie Teffových buniek boli bunky restimulované 12-myristát 13-acetátom (PMA) a ionomycínom. Významne menej buniek Th1 exprimovalo interferón-g (IFNg) a menej buniek Th17 exprimovalo IL-17, keď boli diferencované v prítomnosti MTHFD2i (obrázok 2E). Nebolo to spôsobené zhoršenou počiatočnou aktiváciou, pretože tieto fenotypy sa zachovali, keď sa expozícia lieku oneskorila až do 24 hodín po aktivácii, hoci expresia TF charakterizujúca vek bola v tomto nastavení nezmenená (obrázky S2C – S2F). MTHFD2 je teda potrebný pre maximálny CD4^plusAktivácia T buniek, proliferácia, prežitie a produkcia cytokínov.

Na genetické potvrdenie týchto farmakologických účinkov sme vytvorili Mthfd2^fl/flmyšieho kmeňa a skrížili ho s Cd4- cre transgénnymi myšami, aby sa dosiahlo podmienené genetické vymazanie. Ako sa očakávalo, aktivovaný CD4^plusT bunky z Mthfd2^fl/flCD4-cre plus (CD4^ΔMthfd2) myši mali nižšiu expresiu MTHFD2 v porovnaní s bunkami z Mthfd2^fl/flCD4-cre^plus(divoký typ [WT]) súrodenci (obrázok 2F). Na začiatku mali myši CD4DMthfd2 o niečo menej CD4^plusT bunky v slezine v porovnaní s WT (obrázok 2G). Po in vitro aktivácii a diferenciácii, počtu buniek a životaschopnosti CD4^ΔMthfd2Th17 bunky a v menšej miere Treg bunky boli významne nižšie (obrázok 2H). Okrem toho bola expresia CD25 znížená v Th17 a Treg bunkách a mala nižšiu tendenciu v Th1 bunkách (obrázok 2I). Nakoniec CD4^ΔMthfd2Th1 a Th17 bunky mali nižšiu expresiu T-bet a RORt, v danom poradí. FoxP3 v Treg bunkách však zostal nezmenený (obrázok 2J). Napriek zmenám v expresii TF, bunky Teff, ktoré sa diferencovali, produkovali normálne množstvá cytokínov (obrázok 2K). Rozdiely vo výsledkoch medzi farmakologickým a genetickým prístupom možno pripísať načasovaniu a úplnosti straty funkcie enzýmu počas vývoja a potenciálnym kompenzačným mechanizmom.

MTHFD2i indukuje expresiu FoxP3 v Th17 bunkách a zvyšuje diferenciáciu Treg buniek

Vzhľadom na závislosť Teff buniek od MTHFD2 sme testovali MTHFD2i reguláciu FoxP3 a Treg buniek. Najmä liečba MTHFD2i indukovala aberantnú upreguláciu FoxP3 v Th1 a výraznejšie v Th17 bunkách spôsobom závislým od dávky (obrázok 3A). To sa vyskytlo aj vtedy, keď bola liečba odložená do 24 hodín po aktivácii (obrázok 3B). Podobný trend bol pozorovaný v CD4DMthfd2 Th17 bunkách (obrázok 3C). Táto upregulácia FoxP3 bola funkčná, pretože bunky Th17 ošetrené MTHFD2i získali supresívnu kapacitu pri spoločnej kultivácii s CD8^plusT bunky (obrázok 3D). MTHFD2i tak môže podporovať fenotypy podobné bunkám FoxP3 a Treg v Th17 bunkách. MTHFD2i tiež zvýšil diferenciáciu indukovaných Treg buniek. Treg bunky boli diferencované s radom koncentrácií transformujúceho rastového faktora b (TGF-b) v prítomnosti MTHFD2i. Pri každej testovanej koncentrácii okrem najvyššej sa expresia FoxP3 zvýšila s liečbou MTHFD2i (obrázky 3E a 3F). Tento fenotyp sa udržal aj pri oneskorenom ošetrení MTHFD2i (obrázok 3G).

Obrázok 3. Nedostatok MTHFD2 indukuje expresiu FoxP3 a podporuje posun smerom k oxidatívnej fosforylácii

(A) Expresia FoxP3 v bunkách Th1 a Th17 ošetrených MTHFD2i 72 hodín po aktivácii (priemer ± SD, jednosmerná ANOVA, údaje sú reprezentatívne pre tri nezávislé experimenty s 9 celkovými biologickými replikáciami).

(B) Expresia FoxP3 v Th1 a Th17 bunkách aktivovaná počas 24 hodín a potom ošetrená vehikulom alebo 500 nM MTHFD2i počas 48 hodín (priemer ± SD, nepárový t test, údaje sú reprezentatívne pre tri nezávislé experimenty s 9 celkovými biologickými replikátmi).

(C) Expresia FoxP3 v Th1 a Th17 bunkách od súrodencov WT a CD4DMthfd2 72 hodín po aktivácii (priemer ± SD, nepárový t test, údaje sú reprezentatívne pre tri nezávislé experimenty s 9 celkovými biologickými replikátmi).

(D) Test supresie merajúci aberantnú supresívnu kapacitu Th17 buniek ošetrených MTHFD2i. Vopred ošetrené Th17 bunky boli spoločne kultivované s CTV zafarbenými CD8 plus T bunkami na meranie proliferácie po aktivácii s anti-CD3 a anti-CD28 protilátkami (priemer ± SD, jednosmerná ANOVA, n=3 biologických replikátov) .

(E) Expresia FoxP3 v Treg bunkách diferencovaných s radom koncentrácií TGF-b a ošetrených MTHFD2i (priemer ± SD, nepárový t test, údaje sú reprezentatívne pre tri nezávislé experimenty s 9 celkovými biologickými replikátmi).

(F) Grafy prietokovej cytometrie pre údaje uvedené v (E).

(G) Expresia FoxP3 v bunkách Treg aktivovaná a diferencovaná s nízkymi koncentráciami TGF-b počas 24 hodín a potom ošetrená MTHFD2i počas 48 hodín (priemer ± SD, nepárový t test, údaje sú reprezentatívne pre tri nezávislé experimenty s 9 celkovými biologickými replikátmi ).

(H) Záťažový test Seahorse XF Cell Mito vykonaný na bunkách Th17 a Treg ošetrených MTHFD2i (priemer ± SD, n=3 biologických replikátov). (I) Bazálny ECAR, bazálny OCR, maximálny OCR a bazálny OCR/ECAR pomer meraný v (H) (priemer ± SD, nepárový t test, údaje predstavujú dva nezávislé experimenty so 6 biologickými replikátmi). Štatisticky významné výsledky sú označené (* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001, **** p percentá 0,001).

Treg bunky majú väčší mitochondriálny metabolizmus ako Th17 bunky (Michalek et al., 2011). Aby sa určili metabolické dôsledky liečby MTHFD2i, bunky Th17 a Treg sa hodnotili analýzami extracelulárneho toku. MTHFD2i zvýšil bazálnu a maximálnu rýchlosť spotreby kyslíka (OCR) buniek Th17, čo naznačuje posun smerom k mitochondriálnej respirácii (obrázok 3H). Naopak, bunky Th17 a Treg mali zníženú bazálnu extracelulárnu acidifikáciu (ECAR) s liečbou MTHFD2i, čo naznačuje zníženú glykolýzu (obrázok 3I). Bazálny pomer OCR k ECAR sa významne zvýšil v bunkách Th17 a Treg, pretože MTHFD2i posunul metabolický program z glykolýzy smerom k oxidatívnej fosforylácii. Tieto údaje ukazujú, že MTHFD2i zvyšuje expresiu FoxP3 v Th17 bunkách a Treg bunkách diferencovaných za podmienok nízkeho TGF-b a posúva bunky Th17 k metabolizmu viac podobnému Treg bunkám.

Nedostatok MTHFD2 v ľudských CD4 plus T bunkách znižuje proliferáciu a životaschopnosť buniek Th17, pričom zvyšuje expresiu FOXP3 a tlmí aktivitu mTORC1

Na testovanie preložiteľnosti vyššie uvedených zistení na ľudské bunky, CD4^plusT bunky izolované z periférnej krvi zdravých darcov boli in vitro diferencované na Th1, Th17 a Treg bunky a ošetrené vehikulom alebo MTHFD2i od času aktivácie. Proliferácia sa významne znížila v bunkách Th17 a Treg ošetrených MTHFD2i (obrázok 4A) a bunky Th17 tiež vykazovali zvýšenú apoptózu (obrázok 4B). Znížená proliferácia v Th17 bunkách bola rekapitulovaná genetickým prístupom s použitím malej interferujúcej RNA (siRNA) (obrázky 4C a S2G). Podobne ako u myších buniek bola expresia FOXP3 vyššia v ľudských Th17 bunkách ošetrených MTHFD2i a mala vyššiu tendenciu v ľudských Treg bunkách ošetrených MTHFD2i (obrázky 4D a S2H). Vzhľadom na to, že os mTORC1-AMPK je rozhodujúca pre diferenciáciu buniek Th17 a Treg, merala sa aj fosforylácia cieľového ribozomálneho proteínu mTORC1 S6 (fosfo-S6). To ukázalo zníženú aktivitu mTORC1 v Th17 bunkách s MTHFD2i alebo siMTHFD2 (obrázok 4E). Strata proliferačnej kapacity a indukcia expresie FOXP3 v Th17 a Treg bunkách teda môže byť rekapitulovaná v primárnom ľudskom CD4^plusT bunky.

Obrázok 4. Nedostatok MTHFD2 zhoršuje proliferáciu a indukuje expresiu FOXP3 v ľudských Th17 bunkách

(A) Proliferácia meraná riedením CTV v podskupinách ľudských CD4 plus T buniek ošetrených vehikulom alebo 2 mM MTHFD2i počas 72 hodín po aktivácii protilátkami anti-CD3 a anti-CD28 (párový t test, údaje sú reprezentatívne pre tri nezávislé experimenty s 5 – 6 zdravých darcov).

(B) Apoptóza meraná annexinom V v ľudských CD4 plus T bunkách ošetrených MTHFD2i počas 72 hodín (párový t test, údaje sú reprezentatívne pre tri nezávislé experimenty s 5–6 zdravými darcami).

(C) Ki-67 expresia v ľudských CD4 plus T bunkách transdukovaných NTC alebo siMTHFD2 (párový t test, údaje sú reprezentatívne pre tri nezávislé experimenty so 4 zdravými darcami pacientov).

(D) Expresia FOXP3 v ľudských CD4 plus T bunkách ošetrených MTHFD2i počas 72 hodín (párový t test, údaje sú reprezentatívne pre tri nezávislé experimenty so 6–10 zdravými darcami).

(E) Zmena expresie fosfo-S6 v ľudských CD4 plus T bunkách ošetrených MTHFD2i počas 72 hodín alebo transdukovaných siMTHFD2 (priemer ± SD, jedna vzorka t test, údaje reprezentujúce tri nezávislé experimenty so 4–6 zdravými darcami). Štatisticky významné výsledky sú označené (* p < 0.{{10}}5,="" **="" p="">< 0,01,="" ***="" p="">< 0,001,="" ****="" p="" percent="">

T bunky sa spoliehajú na enzymatickú funkciu MTHFD2 a fenotypy môžu byť zachránené produktom

MTHFD2 je potrebný na udržanie mitochondriálneho formiátu na syntézu purínov (Ma et al., 2017), ale môže hrať aj neenzymatické úlohy. Podpora esenciálnej enzymatickej aktivity viedla liečba MTHFD2i ku kompenzačnému vychytávaniu formiátu z média v podskupinách CD4 plus T buniek (obrázok 5A). Jednotka 1C použitá na syntézu formiátu sa poskytuje konverziou serínu na glycín a intracelulárny serín sa akumuloval, zatiaľ čo glycín bol vyčerpaný liečbou MTHFD2i vo všetkých podskupinách (obrázok 5B). Koncentrácie metionínu sa tiež mierne zvýšili, čo naznačuje inhibíciu cyklu metionínu. Ako sa očakávalo, vzhľadom na to, že krok konverzie serín-glycín je pred MTHFD2, tieto zmeny neboli zachránené poskytnutím mravčanu v médiu.

Obrázok 5. Účinky MTHFD2i na podskupiny T buniek sú zachránené exogénnym mravčanom

(A) Príjem formiátu meraný pomocou 1H-magnetickej rezonančnej spektroskopie (MRS) v podskupinách CD4 plus T buniek ošetrených vehikulom alebo 500 nM MTHFD2i počas 72 hodín po aktivácii (priemer ± SD, nepárový t test, údaje sú reprezentatívne pre dva nezávislé experimenty so 6 celkovými biologickými replikáciami).

(B) Zmena koncentrácií serínu, glycínu a metionínu v CD4 plus T bunkách ošetrených 500 nM MTHFD2i alebo 500 nM MTHFD2i plus 1 mM formiátom počas 4–6 hodín v porovnaní s vehikulom, merané hmotnostnou spektrometriou (priemer ± SD, n { {8}} biologických replikátov).

(C) Počet živých buniek, životaschopnosť a expresia CD25 v CD4 plus T bunkách ošetrených MTHFD2i zachránených 1 mM formiátom alebo 60 mM roztokom adenínu a guanínu purínu počas 72 hodín po aktivácii (priemer ± SD, jednosmerná ANOVA, údaje sú reprezentatívny z troch nezávislých experimentov s celkovým počtom 9 biologických replikátov).

(D) Počet živých buniek, životaschopnosť a expresia CD25 v CD4 plus T bunkách od súrodencov WT alebo CD4DMthfd2 zachránených formiátom alebo purínmi počas 72 hodín po aktivácii (priemer ± SD, jednosmerná ANOVA, n=3 biologických replikátov ).

Ďalej sme testovali, či pridanie mravčanu alebo roztoku adenínu a guanínu purínu môže zachrániť nedostatočnú enzymatickú funkciu a zvrátiť následné účinky nedostatku MTHFD2. 1 mM mravčan skutočne obnovil proliferáciu, životaschopnosť a aktiváciu v bunkách ošetrených MTHFD2i (obrázok 5C). Suplementácia purínov zachránila proliferáciu vo všetkých podskupinách a aktiváciu v Th1 a Th17 bunkách, ale nie životaschopnosť vo všetkých podskupinách a aktiváciu v Treg bunkách. Formiát tiež zachránil proliferáciu, životaschopnosť a aktiváciu v CD4^ΔMthfd2T bunky (obrázok 5D). Zhoršená produkcia cytokínov v Th1 a Th17 bunkách ošetrených MTHFD2i bola obrátená na množstvá vehikula pridaním mravčanu alebo purínu (obrázok 5E). Pozoruhodné je, že aberantná upregulácia FoxP3 v Th17 bunkách bola zachránená pridaním purínu, ale nie formiátu, zatiaľ čo pridanie formiátu a purínu znížilo expresiu FoxP3 na základnú hodnotu v Treg bunkách diferencovaných s nízkymi koncentráciami TGF-b (obrázok 5F). Zdá sa, že fenotypy MTHFD2i sú závislé od udržiavania mitochondriálnych formiátov alebo purínových zásob MTHFD2.

MTHFD2 reguluje aktivitu mTORC1 a metyláciu DNA a histónu v CD4^plusT bunky

V imortalizovaných rakovinových bunkách môže nedostatok MTHFD2 viesť k akumulácii medziproduktov syntézy purínov GAR, SAICAR a AICAR, ktoré sú pred 10-formylTHF-sprostredkovanými krokmi formylácie (Ducker et al., 2016). CD4^plusPodskupiny T buniek sa kultivovali 72 hodín pred expozíciou MTHFD2i počas 4–6 hodín. Tento krátky časový rámec bol zvolený s cieľom vyhnúť sa akýmkoľvek sekundárnym účinkom vrátane kompenzačných zmien. Prechodná liečba MTHFD2i viedla k akumulácii GAR, SAICAR a AICAR vo všetkých podskupinách (obrázok 6A). Tento účinok bol úplne zachránený pridaním 1 mM formiátu, čo podporuje enzymatickú úlohu MTHFD2. Nukleotidy a nukleobázy, vrátane guanínu, boli tiež vyčerpané MTHFD2i a zachránené formiátom v Th17 a Treg bunkách (obrázok 6B).

Obrázok 6. Výsledkom MTHFD2i je akumulácia medziproduktov syntézy purínov, tlmenie aktivity mTORC1 a zmenená metylácia DNA a histónu

(A) Zmena koncentrácií GAR, SAICAR a AICAR v CD4 plus T bunkách ošetrených 500 nM MTHFD2i alebo 500 nM MTHFD2i plus 1 mM formiátom počas 4–6 hodín v porovnaní s vehikulom, merané hmotnostnou spektrometriou (priemer ± SD, jeden- spôsob ANOVA, n=3 biologických replikácií).

(B) Zmena druhov metabolizmu nukleotidov v bunkách Th17 a Treg ošetrených MTHFD2i s alebo bez formiátu počas 4–6 hodín v porovnaní s vehikulom, meraná hmotnostnou spektrometriou (n=3 biologických replikátov).

(C) Imunoblot fosfo-S6, S6, Rheb, fosfo-ACC, ACC, HIF-1a a b-aktínu v CD4 plus T bunkách ošetrených MTHFD2i s alebo bez formiátu počas 72 hodín po aktivácii (údaje reprezentujúci tri nezávislé experimenty s n=3 biologickými replikátmi).

(D) Zmena v metabolitoch cyklu TCA v bunkách Th17 ošetrených MTHFD2i s alebo bez formiátu počas 6 hodín v porovnaní s vehikulom, meraná hmotnostnou spektrometriou (priemer ± SD, jednosmerná ANOVA, n=3 biologických replikátov).

(E) Teplotné mapy pomeru kontroly H3K27me3 ku IgG v ±10-kb oblastiach okolo promótorov známych génov UCSC v bunkách Th17 a Treg ošetrených MTHFD2i, merané pomocou CUT&RUN (údaje zlúčené z 3 biologických replikátov).

(F) Tepelná mapa strednej frekvencie metylácie DNA lokusu Foxp3 podľa miesta CpG v bunkách Th1 a Th17 ošetrených vehikulom alebo 500 nM MTHFD2i a v bunkách nTreg od súrodencov WT alebo CD4DMthfd2 (Moodov test, n=3 biologických replikátov).

(G) Tabuľka (F) podľa proximálneho promótora, distálneho promótora a TSDR (párový t test). Pozri tiež obrázky S3 a S4. Štatisticky významné výsledky sú označené (* p < 0.05,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p="">< 0,001,="" ****="" p="" percent="">

AICAR a nukleotidy sú zavedené regulátory osi mTORC{0}}AMPK (Emmanuel a kol., 2017; Kim a kol., 2016). Expresia fosfo-S6 sa skutočne znížila liečbou MTHFD2i vo všetkých podskupinách a úplne sa obnovila pridaním mravčanu (obrázky 6C a S3A). GTP-viažuci proteín Rheb, povinný aktivátor mTORC1, môže byť citlivý na intracelulárnu dostupnosť guanínu (Emmanuel a kol., 2017) a expresia Rheb bola tlmená liečbou MTHFD2i (obrázky 6C a S3B). AICAR je analóg adenozínu a aktivátor AMPK (Rae a Mairs, 2019; Su et al., 2019). 72 hodín po aktivácii sa však fosforylácia AMPK alebo jej cieľov, acetyl-koenzým A(CoA) karboxylázy (fosfo-ACC) a kinázy aktivujúcej autofágiu (fosfo-ULK1) podobnej Unc{19}}nezmenila pri liečbe MTHFD2i (Obrázky 6C, S3C a S3D). Aktivita mTORC1 podporuje Th17 a čiastočne tlmí diferenciáciu Treg buniek prostredníctvom indukcie HIF-1a-dependentného glykolytického metabolizmu (Shi et al., 2011). V súlade s tým bola expresia HIF{31}} znížená v bunkách Th17 liečených MTHFD2i a CD4DMthfd2 (obrázky 6C, S3E a S3F). Tieto zmeny v aktivite mTORC1 neboli spojené so žiadnymi deficitmi v signalizácii TCR, ako sa meralo expresiou Nur77 s restimuláciou a bez nej (obrázok S3G). Aktivita signálneho prevodníka a aktivátora transkripcie 3 (STAT3), ktorá je kritická pre vývoj buniek Th17, sa pri liečbe MTHFD2i nezmenila alebo sa mierne zvýšila (obrázok S3H). Znížená aktivita mTORC1 a posun od glykolýzy k oxidatívnej fosforylácii s liečbou MTHFD2i naznačujú zmeny v relatívnom množstve metabolitov cyklu trikarboxylových kyselín (TCA). Koncentrácie sukcinátu a fumarátu boli významne znížené pomocou MTHFD2i, ale zachránené mravčanom (obrázok 6D).

Metabolity TCA sú známymi inhibítormi DNA a históndemetyláz (Su et al., 2016) a vyčerpanie zásob sukcinátu a fumarátu môže podporovať hypometylovaný stav. Trimetylácia H3K27 (H3K27me3) naprieč genómom sa merala pomocou sekvenovania CUT&RUN (štiepenie pod cieľmi a uvoľňovanie pomocou nukleázy) (Skene a Henikoff, 2017). Bunky Th17 ošetrené MTHFD2i skutočne znížili H3K27me3 v porovnaní s vehikulom (obrázky 6E a S4A). Metylácia DNA v lokuse Foxp3 sa merala aj bisulfátovým sekvenovaním, aby sa určilo, či diferenciálna metylácia prispela k upregulácii FoxP3 indukovanej MTHFD2i. Aj keď sa niekoľko CpG lokusov líšilo vo frekvencii metylácie medzi vehikulom a podmienkami MTHFD2i, v demetylovanej oblasti špecifickej pre bunky Treg (TSDR) nebol rozlíšiteľný žiadny vzor. Neboli tiež žiadne rozdiely medzi bunkami nTreg (CD4 plus CD25 plus) izolovanými z myší WT a CD4DMthfd2 (obrázok 6F), hoci čistota každej obohatenej populácie bola nízka (obrázok S4B). Došlo však k významnému zníženiu frekvencie metylácie DNA v oblasti proximálneho promótora Foxp3 v bunkách Th17 ošetrených MTHFD2i v porovnaní s vehikulom (obrázok 6G), čo naznačuje možné zvýšenie transkripcie pomocou MTHFD2i.

Okrem udržiavania intracelulárneho fondu mravčanu prispieva aktivita MTHFD2 k bunkovej redoxnej rovnováhe prostredníctvom konverzie NAD^plusna NADH a NADP^plusna NADPH (Shin et al., 2017) a podpora transsulfuračnej dráhy a následnej syntézy glutatiónu. Bunky Th17 ošetrené MTHFD2i mali znížené koncentrácie NAD^plus, NADH, NADP^plusa NADPH, ktorý bol zachránený formiátom (obrázok S4C). Avšak, NAD^plus/NADH a NADP^plusPomery /NADPH sa za podmienok nezmenili. To v kombinácii s nedostatkom zmien v bunkových reaktívnych druhoch kyslíka (ROS) a mitochondriálnom superoxide (obrázok S4D) naznačuje, že zmeny v redoxnom stave pravdepodobne nebudú hlavným prispievateľom k fenotypu MTHFD2i.

Nedostatok MTHFD2 in vivo znižuje závažnosť viacerých zápalových ochorení

Účinnosť MTHFD2 ako terapeutického cieľa bola ďalej testovaná v in vivo modeli oneskoreného typu hypersenzitivity (DTH) závislej od T buniek. Myši boli imunizované a vystavené na uchu hemocyanínom prílipky (KLH) na vyvolanie lokálneho zápalu a liečené perorálnym vehikulom alebo MTHFD2i. Liečba nepreukázala žiadnu zjavnú toxicitu, pretože zvieratá si zachovali svoju hmotnosť (obrázok S5A). Dôležité je, že hrúbka a hmotnosť ucha sa zvýšili u kontrolných myší DTH, ale nie u zvierat liečených inhibítorom, čo naznačuje ochranu pred zápalom po liečbe MTHFD2i (obrázky 7A, 7B a S5B). KLH-špecifický imunoglobulín G (IgG) bol tiež znížený pri najvyššej dávke inhibítora, čo naznačuje potenciálne účinky presahujúce funkciu B buniek (obrázok 7C).

Obrázok 7. Zacielenie na MTHFD2 in vivo znižuje závažnosť ochorenia v modeloch DTH, EAE a IBD

(A a B) Relatívna hrúbka ucha (A) a hmotnosť biopsie (B) 10 deň po imunizácii KLH s CFA a 3 dni po stimulácii KLH na vyvolanie DTH (jednosmerná ANOVA). Myši boli liečené dvakrát denne perorálnou dávkou 0, 100 alebo 300 mg/kg MTHFD2i (priemer ± SEM, n=8 biologických replikátov).

(C) KLH-špecifické IgG koncentrácie na 10. deň KLH-indukovaného DTH (priemer ± SEM, Kruskal-Wallisov test, n=8 biologických replikátov).

(D) Priemerné klinické skóre v priebehu času u súrodencov WT a CD4DMthfd2 imunizovaných MOG s CFA a PTX na vyvolanie EAE (priemer ± SEM, viaceré Mann-Whitneyho testy, údaje sú reprezentatívne pre dva nezávislé experimenty, každý s 5 biologickými replikátmi).

(E) Počet buniek a frekvencia CD4 plus T buniek v mieche myší EAE pri najvyššej závažnosti ochorenia (priemer ± SEM, nepárový t test, údaje sú reprezentatívne pre dva nezávislé experimenty s 9 celkovými biologickými replikáciami).

(F) Expresia CD25 a CD44 v CD4 plus T bunkách z miechy myší EAE (priemer ± SEM, nepárový t test, n=4 biologických replikátov).

(G a H) Počet buniek (G) T-bet plus , RORgt plus , FoxP3 plus , FoxP3 plus /T-bet plus pomer, FoxP3 plus /RORgt plus pomer a (H) IL-17 plus , IFNg plus a IL-17 plus IFNg plus CD4 plus T bunky z miechy myší EAE (priemer ± SEM, nepárový t test, údaje sú reprezentatívne pre dva nezávislé experimenty s 9 celkovými biologickými replikátmi).

(I) Farbenie H&E, anti-CD3 IHC a Luxol Fast Blue (LFB) na myelín v mieche myši WT bez imunizácie a súrodencov WT a CD4DMthfd2 s EAE na vrchole ochorenia (zväčšenie z roku 2003, reprezentatívne pre 5 biologických replikátov ).

(J) Zmena telesnej hmotnosti v priebehu času Rag1^__/__myšiam injikovaným ip WT alebo CD4DMthfd2 naivnými CD4 plus T bunkami na vyvolanie kolitídy IBD (priemer ± SEM, viacnásobné t testy, n=8 biologických replikátov).

(K a L) Počet buniek (K) celkových CD4 plus T buniek a (L) T-bet plus , RORgt plus a FoxP3 plus CD4 plus T buniek z MLN myší IBD (priemer ± SEM, nepárový t test n { {4}} biologických replikátov). Pozri tiež obrázky S5 a S6. Štatisticky významné výsledky sú označené (* p < 0.05,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p="">< 0,001,="" ****="" p="" percent="">

Podobne bol duálny inhibítor MTHFD1/2 LY345899 (Gustafsson et al., 2017) účinný pri zlepšovaní ochorenia v modeli EAE. EAE bola indukovaná MOG a PTX a myši boli liečené denne intraperitoneálnou (ip) injekciou DMSO alebo LY345899. Liečba inhibítorom viedla k významnému zníženiu závažnosti ochorenia a kumulatívnemu klinickému skóre v porovnaní s vehikulom (obrázky S5C a S5D). Myši boli usmrtené v deň 26 a bunky infiltrujúce miechu boli zozbierané na imunitné profilovanie. Je pozoruhodné, že výrazne menej CD45^plus, CD4^plusa CD8^plusbunky infiltrovali miechu myší liečených LY345899- (obrázky S5E–S5G). Vo frekvencii ROR t nedošlo k žiadnym zmenám^plusalebo FoxP3^plusbunky medzi infiltrujúce CD4^plusT bunky (obrázok S5H). Došlo však k zníženiu frekvencie IFNg plus IL -17 plus buniek a zvýšenie IL -17 plus buniek (obrázok S5I), čo naznačuje možný prechod na menej patogénny fenotyp.

Na priame testovanie vnútornej závislosti T buniek na MTHFD2 in vivo sa WT a CD4DMthfd2 súrodenci podrobili trom rôznym modelom: EAE, zápalové ochorenie čriev (IBD) a alergické ochorenie dýchacích ciest. EAE bola opäť indukovaná MOG a PTX a podobne ako v experimente s inhibítorom mali myši CD4DMthfd2 počas 26 dní významne zníženú závažnosť ochorenia (obrázok 7D). Samostatná kohorta bola usmrtená na vrchole ochorenia v deň 15 po indukcii fenotypizácie T buniek (obrázky S6A a S6B). Hoci CD4^plusalebo CD8^plusPočty T buniek sa v slezine nezmenili (obrázok S6C), infiltrácia CD4 plus T buniek do miechy sa významne znížila (obrázok 7E). CD4 plus T bunky infiltrujúce miechu u myší CD4DMthfd2 mali podobnú expresiu CD25 ako WT, ale zníženú expresiu CD44, čo poukazuje na čiastočne zhoršenú aktiváciu (obrázok 7F). Čísla T-betu^plusBunky , RORt plus a FoxP3 plus (obrázok 7G), ako aj bunky IL-17 plus a IFNg plus (obrázok 7H), boli tiež znížené v mieche myší CD4DMthfd2 v porovnaní s WT. Najmä pomery buniek FoxP3 plus k T-bet plus a RORgt plus boli zvýšené u myší CD4DMthfd2 v porovnaní s WT na vrchole ochorenia, čo odráža in vitro zistenia zvýšenej expresie FoxP3 s nedostatkom MTHFD2 (obrázok 7G). Hoci frekvencia buniek exprimujúcich TF medzi infiltrujúcimi bunkami mala celkovo vyššiu tendenciu, frekvencia expresie cytokínov sa nezmenila (obrázky S6D a S6E). Histológia miechy kontrolných myší bez EAE a WT a CD4^ΔMthfd2myši s EAE vykazovali zvýšenú celularitu a CD3 pozitivitu v mieche u WT myší, ktorá bola spojená s demyelinizáciou, ako ukazuje farbenie Luxol Fast Blue (obrázok 7I). Tieto zmeny chýbali v kontrole bez EAE a CD4^ΔMthfd2myši.

Úloha MTHFD2 bola ďalej testovaná na modeloch IBD a alergických ochorení dýchacích ciest. WT a CD4DMthfd2 naivné CD4 plus T bunky boli prenesené do Rag1 / príjemcov na iniciáciu IBD. Hoci myši, ktoré dostávali bunky WT, začali s progresiou IBD chudnúť, príjemcovia CD4DMthfd2 T buniek naďalej priberali (obrázok 7J). V slezinách (obrázok S6F) a mezenterických lymfatických uzlinách (MLN), ktoré odvádzajú hrubé črevo (obrázky 7K a S6G), sa našlo výrazne nižší počet a frekvencia CD4DMthfd2 T buniek. Počty T-bet plus, RORt plus a FoxP3 plus CD4DMthfd2 T buniek sa tiež znížili v MLN, ale frekvencia buniek FoxP3 plus sa zvýšila (obrázky 7L a S6H). V tomto časovom bode neskorej fázy však neboli žiadne rozdiely v pomeroch počtu buniek FoxP3 / T-bet a FoxP3 / RORgt v MLN (obrázok S6I). Podobne ako pri zisteniach MTHFD2 ako mierneho zásahu v in vivo skríningu zápalu dýchacích ciest CRISPR (obrázok 1C), myši CD4DMthfd2 vystavené alergickej chorobe dýchacích ciest vyvolanej Alternáriou mali trend zníženého množstva neutrofilov v tekutine z bronchioalveolárnej laváže (BALF), hoci nie zmeny sa pozorovali v počte lymfocytov, eozinofilov a makrofágov BALF (obrázok S7A).

Nakoniec sa testoval účinok MTHFD2i na všeobecnú imunitnú aktivitu. OVA-špecifický OT-II CD45.2^plusCD4^plusT bunky boli adoptívne prenesené do CD45.1^plusmyši, ktoré boli potom imunizované subkutánne emulziou OVA s kompletným Freundovým adjuvans (CFA) a liečené denne perorálnym vehikulom alebo MTHFD2i. Telesná hmotnosť bola za všetkých podmienok nezmenená (obrázok S7B). Rozšírenie preneseného OT-II CD45.2^plusbunky sa mierne oneskorili u imunizovaných myší liečených MTHFD2i, ale dosiahli počet vehikul do dňa 7 (obrázky S7C – S7E). Frekvencia buniek IFNg plus sa však znížila pri vypúšťaní LN (obrázok S7F). Tieto údaje ukazujú, že in vivo liečba MTHFD2i umožňuje antigénovo špecifickú expanziu T-buniek po akútnej stimulácii, aj keď s tlmenou produkciou zápalových cytokínov.

DISKUSIA

Aktivácia, diferenciácia a funkcia T buniek si vyžadujú vhodné metabolické preprogramovanie, aby sa splnili zvýšené požiadavky buniek na energiu, biosyntetické stavebné bloky a signálne molekuly. V tejto štúdii sme skúmali funkciu metabolizmu 1C v primárnych CD4 plus T bunkách. Pomocou kombinácie in vivo primárnych T-buniek CRISPR skríningu a údajov o génovej expresii bol MTHFD2 identifikovaný ako potenciálny cieľ pre protizápalové terapie. Inhibícia alebo nedostatok MTHFD2 vo všeobecnosti viedli k zníženiu proliferácie CD4 plus T buniek. Predovšetkým to bolo spojené s indukciou expresie FoxP3 a supresívnou funkciou v Th17 bunkách, ako aj so zvýšenou diferenciáciou Treg buniek. Tieto údaje naznačujú, že MTHFD2 môže fungovať ako metabolický kontrolný bod v bunkovej osi Th17-Treg, pričom liečba MTHFD2i posúva rovnováhu z patogénneho na protizápalový fenotyp. Inhibícia MTHFD2 alebo genetická nedostatočnosť skutočne zlepšili závažnosť ochorenia vo viacerých in vivo modeloch autoimunity a precitlivenosti.

Metabolizmus 1C pozostáva z metabolizmu serín-glycínu, folátového cyklu a metionínového cyklu a je ústredným prvkom niekoľkých procesov vrátane de novo syntézy purínov, generovania metylových donorov a redoxnej regulácie (Yang a Vousden, 2016). Metabolizmus 1C je silne zapojený do stimulácie TCR (Tan et al., 2017) a je potrebný na podporu expanzie T buniek (Ma et al., 2017). Folátový cyklus je rozdelený na cytosolické a mitochondriálne zložky. V cytosóle MTHFD1 vzájomne premieňa 5,10-metylénTHF, 10-formylTHF a formiát. V mitochondriách sa rovnaké reakcie uskutočňujú pomocou MTHFD2 a MTHFD1L. Tieto výsledné medziprodukty sa používajú na podporu krokov formylácie v de novo syntéze purínov. MTHFD1 a MTHFD2 môžu tiež modulovať redoxný stav prostredníctvom generácie NAD (H) a NADP (H) (Ducker a Rabinowitz, 2017). Aj keď niektoré typy buniek vykazujú flexibilitu pri prepínaní na cytosolický zdroj v podmienkach dysfunkcie mitochondriálnej dráhy (Ducker et al., 2016), predtým sa predpokladalo, že T bunky závisia prevažne od mitochondriálnej dráhy, aby poskytli jednotky 1C a redukčné druhy (Ron- Harel a kol., 2016). Ukázalo sa tiež, že T bunky sa spoliehajú na vychytávanie serínu a imunitné reakcie in vivo možno modulovať množstvom serínu v potrave. Účinky serínového hladovania sú sprostredkované obmedzením biosyntézy purínov aj v prítomnosti neporušených záchranných ciest a možno ich obísť poskytnutím glycínu a formiátu (Ma et al., 2017). Naše údaje sa pridávajú k týmto zisteniam a poukazujú na MTHFD2 ako na kritický regulátor, ktorý ovplyvňuje CD4^plusProliferácia a diferenciácia T buniek.

Echanicoside

Aj keď metabolizmus 1C hrá širokú úlohu v metabolizme buniek, zistili sme, že niektoré funkcie boli odlišné pre výber podskupín T buniek. Všetky ľudské a myšacie T bunky proliferovali v menšom rozsahu s nedostatkom MTHFD2, čo naznačuje spoločnú funkciu pre MTHFD2 na podporu rastu a delenia T buniek. Účinky deficitu MTHFD2 na diferenciáciu T buniek a efektorovú funkciu sa však v každej testovanej podskupine líšili. Th1 bunky vykazovali zhoršenú diferenciáciu so zníženou indukciou T-bet a zníženou produkciou cytokínov. Bunky Th17 mali tiež zmenenú diferenciáciu a zníženú produkciu cytokínov. Hoci ROR t nebol zmenený, MTHFD2-deficientné Th17 bunky upregulovali Treg bunku TF FoxP3 a získali schopnosť potlačiť proliferáciu aktivovaných CD8 plus T buniek. Treg bunky vykazovali zvýšenú diferenciáciu v podmienkach nízkeho TGF-b. Teraz je dobre známe, že každá z týchto podskupín môže mať odlišné metabolické požiadavky (Bantug a kol., 2018; Buck a kol., 2015). Naše údaje ukazujú, že MTHFD2 je tiež selektívne potrebný pre bunky Teff a zároveň podporuje osud a funkciu Treg buniek. Je pozoruhodné, že tieto výsledky sa líšia od nedostatkov GLUT1, GLS alebo ASCT2, ktoré zhoršujú alebo menia diferenciáciu buniek Teff, pričom majú mierne účinky na priamu podporu diferenciácie buniek Treg alebo transdiferenciácie buniek Th17 na bunky Treg (Johnson et al., 2018; Macintyre et al. ., 2014; Nakaya a kol., 2014).

Zdá sa, že tieto odlišné osudy T buniek závisia od enzymatickej aktivity MTHFD2, pretože účinky deficitu MTHFD2 boli zachránené formiátovými alebo purínovými nukleobázami. Hoci sme nezistili žiadny významný účinok zmenenej redoxnej rovnováhy s nedostatkom MTHFD2, zdá sa, že zmenená de novo syntéza purínu je kritická. Liečba MTHFD2i viedla k zníženiu koncentrácií purínov, najmä guanínu, pričom vyvolala akumuláciu medziproduktov syntézy purínov GAR, SAICAR a AICAR. Tieto medziprodukty vyžadujú formyláciu na ďalšiu biosyntézu a účinky boli zachránené, keď sa do média pridal formiát metabolitu odvodený od MTHFD 2-, čo podporuje cieľový biochemický mechanizmus pre MTHFD2i. De novo syntéza nukleotidov na podporu syntézy DNA a RNA je nevyhnutná pre proliferáciu T buniek (Que' me' neur et al., 2003, 2004). Zdá sa teda, že súčasťou mechanizmu, ktorým MTHFD2i zhoršuje expanziu T buniek, je nedostatočná tvorba nukleotidov.

Flavonoid

Neschopnosť syntetizovať adekvátne nukleotidy môže potlačiť efektorové T bunky prostredníctvom viacerých mechanizmov. AMPK a mTORC1 sú hlavnými hnacími silami metabolického preprogramovania so všeobecne protichodnými úlohami v bunkách Teff a Treg (Bantug a kol., 2018; Buck a kol., 2015). Ukazujeme, že liečba MTHFD2i v T bunkách viedla k akútnej akumulácii AICAR, metabolitu pozoruhodného ako analóg adenozínu a aktivátor AMPK (Rae a Mairs, 2019; Su et al., 2019). Neexistoval však žiadny dôkaz zvýšenej aktivity AMPK vo vybraných časových bodoch. To môže odrážať dodatočnú reguláciu AMPK, ale AICAR môže mať aj účinky nezávislé od AMPK (Dembitz et al., 2019). mTORC1 je tiež citlivý na koncentrácie purínov, pretože znížená dostupnosť guanínu potláča aktivitu aktivátora mTORC1 Rheb (Emmanuel a kol., 2017; Hoxhaj a kol., 2017). Akumulácia AICAR a zníženie aktivity mTORC1 môže teda prispieť k zhoršenej tvorbe buniek Th1 a Th17 ošetrených MTHFD2i a k ​​zvýšenej tvorbe buniek Treg. Potlačenie signalizácie mTORC1 môže tiež prispieť k posunu v metabolickom programe z glykolýzy na mitochondriálne dýchanie a zmenené množstvo metabolitu TCA v bunkách Th17 ošetrených MTHFD2i. Dráha mTORC1 hrá ústrednú úlohu pri podpore anabolického metabolizmu a môže riadiť akumuláciu TF ATF4, čo zase môže indukovať expresiu MTHFD2 (Ben-Sahra et al., 2016).

Metabolický tok je spojený s epigenetickou reguláciou, pretože metabolity prispievajú k mnohým epigenetickým modifikáciám (Sharma a Rando, 2017), vrátane metabolizmu 1C, aby sa vytvoril univerzálny donor metylu S-adenosyl metionín (SAM) na metyláciu proteínov a DNA. Experimenty so sledovaním uhlíka v aktivovaných T bunkách však naznačujú, že jednotky 1C odvodené od serínu odvodeného od glukózy a exogénneho serínu významne neprispievajú k metionínovému cyklu a metylácii (Ma et al., 2017). Metabolický tok môže tiež ovplyvniť metylačné vzorce prostredníctvom zmien v množstve metabolitov TCA, vrátane alfa-ketoglutarátu, fumarátu a sukcinátu. Konkrétne fumarát a sukcinát inhibujú DNA a históndemetylázy (Su et al., 2016). V súlade s depléciou týchto metabolitov v bunkách Th17 ošetrených MTHFD2i sa H3K27me3 značne znížil v genóme a metylácia DNA sa špecificky znížila na proximálnom promótore Foxp3, čo môže prispievať k transdiferenciačnému fenotypu. Fenotyp transdiferenciácie buniek Th17 nebol zachránený doplnením mravčanu, čo naznačuje, že k regulácii FoxP3 pravdepodobne prispievajú ďalšie dráhy, ako napríklad prostredníctvom aktivity iných mechanizmov snímania koncentrácie nukleotidov.

akteozid (verbaskozid)

Uvádza sa tiež, že MTHFD2 hrá neenzymatické úlohy, ktoré môžu prispievať k prozápalovým účinkom tohto enzýmu. V rakovinových bunkách môže mať MTHFD2 jadrové funkcie, ktoré sa lokalizujú spolu s miestami replikácie DNA na podporu progresie bunkového cyklu (Gustafsson Sheppard et al., 2015). V myších kmeňových bunkách sa ukázalo, že MTHFD2 moduluje opravu DNA na udržanie genómovej stability (Yue et al., 2020). Pri karcinóme obličkových buniek sa zistilo, že MTHFD2 je rozhodujúci pre metabolické preprogramovanie prostredníctvom metylácie mRNA (Green et al., 2019). Aj keď sa tieto úlohy pre MTHFD2 navzájom nevylučujú s našimi zisteniami, schopnosť formiátu zachrániť mnohé z fenotypov nedostatku MTHFD2 v T bunkách naznačuje, že enzymatická aktivita MTHFD2 je primárnou hnacou silou proliferácie a osudu T buniek.

MTHFD2 sa do značnej miery považuje za cieľ lieku v protirakovinových podmienkach. Môže byť tiež sľubným protizápalovým cieľom a ponúkať menej nežiaducich účinkov v porovnaní s v súčasnosti dostupnými antifolátmi, vzhľadom na nízku expresiu vo väčšine dospelých tkanív. Napríklad jeden cieľ MTX, DHFR, je exprimovaný extenzívne v tkanivách dospelých (Nilsson et al., 2014). Preto môže byť MTX spojený s rôznymi nepriaznivými účinkami, vrátane gastrointestinálnej toxicity. Mechanizmus účinku MTX je navyše stále zle pochopený napriek jeho rozsiahlej histórii (Cronstein a Aune, 2020). Vysoko regulovaná expresia MTHFD2 a potenciál pre redundanciu s cytosolickou MTHFD1 dráhou môže viesť k selektívnej závislosti špecifických bunkových populácií na MTHFD2. Naše zistenia identifikujú MTHFD2 ako kritický metabolický kontrolný bod v CD4^plusT bunky. Hoci existuje široké prekrytie medzi biológiou rakovinových buniek a biológiou rýchlo proliferujúcich T buniek, zistili sme, že podskupiny CD4 plus T buniek vykazujú dodatočnú citlivosť prostredníctvom modulácie bunkovej diferenciácie a funkcie. Je pravdepodobné, že zacielenie na MTHFD2 v terapiách rakoviny môže obmedziť protinádorovú imunitu. Avšak nastavenia, ako je kolorektálny karcinóm, kde zápal sprostredkovaný Th17 bunkami prispieva k ochoreniu, môžu byť pre MTHFD2is veľmi vhodné. Citlivosť T buniek na MTHFD2is môže byť účinnou formou imunoterapie v podmienkach CD4^plusZápal poháňaný T bunkami mimo rakoviny a vedie k menšiemu počtu nepriaznivých účinkov ako v súčasnosti dostupné terapeutické činidlá.

Obmedzenia štúdia

MTHFD2i použitý v tejto štúdii má hodnotu IC50 0,0063 mM pre MTHFD2 a 0,57 mM pre MTHFD1; preto nemožno vylúčiť menšie mimocieľové účinky duálnej inhibície MTHFD2 a MTHFD1. Vzhľadom na to, že aberantná upregulácia FoxP3 v bunkách Th17 nebola zachránená poskytnutím mravčanu, ale aktivita mTORC1 bola, mechanizmus, ktorý je základom tohto fenotypu, si vyžaduje ďalšie skúmanie. Okrem toho sa všetky modely in vivo uskutočňovali s liečbou MTHFD2i alebo genetickou abláciou od času indukcie ochorenia a fenotypovanie T buniek sa uskutočnilo v jedinom časovom bode. Aby sa lepšie charakterizoval účinok deficitu MTHFD2 na patogenézu ochorenia, ďalšie štúdie by mali zahŕňať experimenty s časovým priebehom so sériovou charakterizáciou populácií T buniek, aby sa definitívnejšie určilo, či sú podskupiny CD4 plus T buniek rozdielne ovplyvnené in vivo. Nakoniec, aby sa zlepšila relevantnosť tejto štúdie pre klinické aplikácie, mala by sa otestovať účinnosť liečby MTHFD2i, ktorá sa začala po nástupe ochorenia.

STAR★METÓDY

Podrobné metódy sú uvedené v online verzii tohto dokumentu a zahŕňajú nasledujúce:

• TABUĽKA KĽÚČOVÝCH ZDROJOV

• DOSTUPNOSŤ ZDROJOV

• B Vedúci kontakt

• B Dostupnosť materiálov

• B Dostupnosť údajov a kódu

  
  

• EXPERIMENTÁLNY MODEL A PODROBNOSTI PREDMETU

• B Myši B Ľudské T bunky

• B bunkové línie

  
  

• PODROBNOSTI METÓDY

• B In vitro myš CD4^plusAktivácia a diferenciácia T buniek

• B Test supresie buniek Th17

• B Ľudský CD4 in vitro^plusPodmienky kultivácie T buniek

• B Skríning CRISPR B Metabolomika hmotnostnej spektrometrie

• B Protónová nukleárna magnetická rezonančná spektroskopia (1H-MRS)

• B Imunoblotting

• B CUT&RUN B Cielené sekvenovanie Bisulfifiitu NextGen od EpigenDx

• B In vivo EAE modely pre IHC a prietokovú cytometriu

• B Ošetrenie in vivo LY345899 v modeli EAE

• B In vivo liečba DS18561882 v modeli DTH B In vivo model IBD s WT a CD4^ΔMthfd2súrodenci

• B In vivo model alergického ochorenia dýchacích ciest s WT a CD4^ΔMthfd2súrodenci

• B Ošetrenie in vivo DS18561882 v modeli imunizácie OVA

  
  

• KVANTIFIKÁCIA A ŠTATISTICKÁ ANALÝZA

DOPLŇUJÚCE INFORMÁCIE

Doplňujúce informácie možno nájsť online na https://doi.org/10.1016/j. imun.2021.10.011.

POĎAKOVANIE

Ďakujeme členom laboratória Rathmell za prispenie k tomuto projektu. Ďakujeme Thomasovi Auneovi za poskytnutie údajov RNA-seq a J. Coolsovi (VIB) za poskytnutie konštruktu pMx-U6-gRNA-GFP. Ďakujeme Maxovi R. Van Belkumovi za navrhnutie primerov MTHFD2 qPCR. Ďakujeme Nello Mainolfifi, Vipin Suri, Adam Friedman a Mark Manfredi z Raze Therapeutics, Inc. (Boston, MA) za poskytnutie zlúčeniny Raze 1459, ktorá bola použitá na potvrdenie zistení (údaje nie sú uvedené). Diagramy boli vytvorené pomocou BioRender. Uznávame zdieľaný zdroj Translational Pathology Shared Resource podporovaný grantom podpory NCI/NIH Cancer Center 5P30 CA68485-19 a grantom zdieľaného prístrojového vybavenia S10 OD023475-01A1 pre Leica Bond RX. Táto práca bola podporená cenou Williama E. Paula Distinguished Innovator Award pre Lupus Research Alliance (pre JCR), R01s DK105550 (pre JCR), HL136664 (pre JCR a DCN), CA217987 (pre JCR), AI153167 (pre JCR), AI137075 (do AKM), T32 DK101003 (KV) a T32 GM007347 (do AS).

AUTORSKÉ PRÍSPEVKY

AS, GA a JCR navrhli výskum. AS, GA, KV, DRH, XX, MZM, XY, KLB, NC, MMW, ACY, DLG, AES, SKS, SNF, AMC, PF, TB a JCG-C. vykonala výskum. AS, GA, XY, JK, DCN, AKM, JDR a JCR analyzovali dáta. AS a JCR napísali príspevok s príspevkami od ostatných autorov.

VYHLÁSENIE ZÁUJMOV

JCR je zakladateľom, členom vedeckej poradnej rady a akcionárom Sitryx Therapeutics; člen vedeckého poradného výboru a akcionár spoločnosti Caribou Biosciences; člen vedeckého poradného zboru NirogyTherapeutics; za posledné 3 roky konzultoval spoločnosti Merck, Pfizer a Mitobridge; a získal podporu výskumu od Incyte Corp., CalitheraBiosciences a Tempest Therapeutics. JDR je spoluzakladateľom a akcionárom v Raze Therapeutics, Toran, Serien Therapeutics a Farber Partners a poradcom a akcionárom v Agios Pharmaceuticals, Kadmon Pharmaceuticals, Bantam Pharmaceuticals, Colorado Research Partners, RafaelHoldings, Barer Institute a LEAF Pharmaceuticals; získal poplatky za poradenstvo a financovanie výskumu od spoločností Pfizer a Rafael a je vynálezcom patentov, ktoré vlastní Princetonská univerzita. AMC, PF a TB sú zamestnancami Sitryx Therapeutics.

INKLÚZIA A ROZMANITOSŤ

Pracovali sme na zabezpečení pohlavnej rovnováhy pri výbere nehumánnych subjektov. Jeden alebo viacerí z autorov tohto článku sa identifikujú ako nedostatočne zastúpená etnická menšina vo vede. Pri citovaní referencií vedecky relevantných pre túto prácu sme tiež aktívne pracovali na podpore rodovej vyváženosti v našom referenčnom zozname. Zoznam autorov tohto príspevku zahŕňa prispievateľov z miesta, kde sa výskum uskutočnil, ktorí sa podieľali na zbere údajov, návrhu, analýze a/alebo interpretácii diela.

LITERATÚRA

Anderson, GR, Winter, PS, Lin, KH, Nussbaum, DP, Cakir, M., Stein, EM, Soderquist, RS, Crawford, L., Leeds, JC, Newcomb, R. a kol. (2017). Krajina terapeutickej kooperativity u rakovín mutantov KRAS odhaľuje princípy kontroly evolúcie nádorov. Cell Rep. 20, 999-1015.

Aune, TM, Crooke, PS, 3., Patrick, AE, Tossberg, JT, Olsen, NJ, a Spurlock, CF, 3. (2017). Expresia dlhých nekódujúcich RNA v autoimunite a väzbe na funkciu zosilňovača a genetické varianty ohrozujúce autoimunitné ochorenie. J. Autoimmun. 81, 99-109.

Bantug, GR, Galluzzi, L., Kroemer, G. a Hess, C. (2018). Spektrum metabolizmu T buniek v zdraví a chorobe. Nat. Rev. Immunol. 18, 19-34. Ben-Sahra, I., Hoxhaj, G., Ricoult, SJH, Asara, JM a Manning, BD (2016). mTORC1 indukuje syntézu purínov prostredníctvom kontroly mitochondriálneho tetrahydrofolátového cyklu. Science 351, 728–733.

Brown, PM, Pratt, AG a Isaacs, JD (2016). Mechanizmus účinku metotrexátu pri reumatoidnej artritíde a hľadanie biomarkerov. Nat. Rev. Rheumatol. 12, 731-742.

Buck, MD, O'Sullivan, D. a Pearce, EL (2015). Metabolizmus T buniek poháňa imunitu. J. Exp. Med. 212, 1345–1360.

Cantor, JR, Abu-Remaileh, M., Kanarek, N., Freinkman, E., Gao, X., Louissaint, A., Jr., Lewis, CA a Sabatini, DM (2017). Fyziologické médium obnovuje bunkový metabolizmus a odhaľuje kyselinu močovú ako endogénny inhibítor UMP syntázy. Cela 169, 258–272.e17.

Cronstein, BN a Aune, TM (2020). Metotrexát a jeho mechanizmy účinku pri zápalovej artritíde. Nat. Rev. Rheumatol. 16, 145-154.

Dembitz, V., Tomic, B., Kodvanj, I., Simon, JA, Bedalov, A., and Visnjic, D. (2019). Ribonukleozid AICAr indukuje diferenciáciu myeloidnej leukémie aktiváciou ATR/Chk1 prostredníctvom deplécie pyrimidínu. J. Biol. Chem. 294, 15257–15270.

Dendrou, CA, Fugger, L. a Friese, MA (2015). Imunopatológia roztrúsenej sklerózy. Nat. Rev. Immunol. 15, 545-558.

Ducker, GS a Rabinowitz, JD (2017). Metabolizmus jedného uhlíka v zdraví a chorobe. Cell Metab. 25, 27-42.

Ducker, GS, Chen, L., Morscher, RJ, Ghergurovich, JM, Esposito, M., Teng, X., Kang, Y. a Rabinowitz, JD (2016). Zvrátenie cytosolického toku jedného uhlíka kompenzuje stratu mitochondriálnej folátovej dráhy. Cell Metab. 23, 1140-1153.

Emmanuel, N., Ragunathan, S., Shan, Q., Wang, F., Giannakou, A., Huser, N., Jin, G., Myers, J., Abraham, RT a Unsal-Kacmaz, K (2017). Dostupnosť purínových nukleotidov reguluje aktivitu mTORC1 prostredníctvom Rheb GTPázy. Cell Rep. 19, 2665-2680.

Farber, S., Diamond, LK, Mercer, RD, Sylvester, RF a Wolff, JA (1948). Dočasné remisie pri akútnej leukémii u detí spôsobené antagonistom kyseliny listovej, kyselinou 4-aminopteroyl-glutámovou. N. Engl. J. Med. 238, 787-793.

Field, MS, Kamynina, E., Watkins, D., Rosenblatt, DS a Stover, PJ (2015). Nové pohľady na metabolické a nutričné ​​determinanty závažnej kombinovanej imunodeficiencie. Zriedkavé Dis. 3, e1112479.

Fuseini, H., Yung, JA, Cephus, JY, Zhang, J., Goleniewska, K., Polosukhin, VV, Peebles, RS, Jr., a Newcomb, DC (2018). Testosterón znižuje zápal dýchacích ciest vyvolaný domácimi roztočmi typu 2 a IL-17A-sprostredkovaný zápal dýchacích ciest. J. Immunol. 201, 1843–1854.

Govindaraju, V., Young, K. a Maudsley, AA (2000). Chemické posuny protónovej NMR a väzbové konštanty pre metabolity mozgu. NMR Biomed. 13, 129-153.

Green, NH, Galvan, DL, Badal, SS, Chang, BH, LeBleu, VS, Long, J., Jonasch, E. a Danesh, FR (2019). MTHFD2 spája metyláciu RNA s metabolickým preprogramovaním pri karcinóme obličkových buniek. Oncogene 38, 6211-6225.

Gustafsson, R., Jemth, A.-S., Gustafsson, NMS, F€ arnega˚rdh, K., Loseva, O., Wiita, E., Bonagas, N., Dahllund, L., Llona-Minguez, S., H€ aggblad, M., et al. (2017). Kryštalická štruktúra vznikajúceho rakovinového cieľa MTHFD2 v komplexe s inhibítorom na báze substrátu. Cancer Res. 77, 937-948.

Gustafsson Sheppard, N., Jarl, L., Mahadessian, D., Strittmatter, L., Schmidt, A., Madhusudan, N., Tegne´r, J., Lundberg, EK, Asplund, A., Jain, M a Nilsson, R. (2015). Enzým MTHFD2 spojený s folátom je jadrový proteín a podporuje bunkovú proliferáciu. Sci. Rep. 5, 15029.

Hoxhaj, G., Hughes-Hallett, J., Timson, RC, Ilagan, E., Yuan, M., Asara, JM, Ben-Sahra, I. a Manning, BD (2017). Signalizačná sieť mTORC1 sníma zmeny v hladinách bunkových purínových nukleotidov. Cell Rep. 21, 1331–1346.

Johnson, MO, Wolf, MM, Madden, MZ, Andrejeva, G., Sugiura, A., Contreras, DC, Maseda, D., Liberti, MV, Paz, K., Kishton, RJ, a kol. (2018). Odlišná regulácia diferenciácie Th17 a Th1 buniek metabolizmom závislým od glutamínázy. Cela 175, 1780–1795.e19.

Ju, H.-Q., Lu, Y.-X., Chen, D.-L., Zuo, Z.-X., Liu, Z.-X., Wu, Q.-N., Mo, H.-Y., Wang, Z.-X., Wang, D.-S., Pu, H.-Y., a kol. (2019). Modulácia redoxnej homeostázy inhibíciou MTHFD2 pri kolorektálnom karcinóme: Mechanizmy a terapeutické dôsledky. J. Natl. Cancer Inst. 111, 584-596.

Kawai, J., Toki, T., Ota, M., Inoue, H., Takata, Y., Asahi, T., Suzuki, M., Shimada, T., Ono, K., Suzuki, K., a kol. (2019). Objav silného, ​​selektívneho a perorálne dostupného inhibítora MTHFD2 (DS18561882) s in vivo protinádorovou aktivitou. J. Med. Chem. 62, 10204-10220.

Kim, J., Yang, G., Kim, Y., Kim, J. a Ha, J. (2016). Aktivátory AMPK: mechanizmy účinku a fyziologické aktivity. Exp. Mol. Med. 48, e224.

Koufaris, C., Gallage, S., Yang, T., Lau, C.-H., Valbuena, GN, a Keun, HC (2016). Potlačenie MTHFD2 v MCF-7 bunkách rakoviny prsníka zvyšuje glykolýzu, závislosť od exogénneho glycínu a citlivosť na depléciu folátov. J. Proteome Res. 15, 2618-2625.

Li, W., Xu, H., Xiao, T., Cong, L., Love, MI, Zhang, F., Irizarry, RA, Liu, JS, Brown, M. a Liu, XS (2014). MAGECK umožňuje robustnú identifikáciu základných génov z CRISPR/Cas9 knockout screenov na úrovni genómu. Genome Biol. 15, 554.

Ma, EH, Bantug, G., Griss, T., Condotta, S., Johnson, RM, Samborska, B., Mainolfifi, N., Suri, V., Guak, H., Balmer, ML, a kol. (2017). Serín je esenciálny metabolit pre expanziu efektorových T buniek. Cell Metab. 25, 345-357.

Macintyre, AN, Gerriets, VA, Nichols, AG, Michalek, RD, Rudolph, MC, Deoliveira, D., Anderson, SM, Abel, DE, Chen, BJ, Hale, LP, a kol. (2014). Glukózový transportér Glut1 je selektívne nevyhnutný pre aktiváciu CD4 T buniek a funkciu efektora. Cell Metab. 20, 61-72.

Michalek, RD, Gerriets, VA, Jacobs, SR, Macintyre, AN, MacIver, NJ, Mason, EF, Sullivan, SA, Nichols, AG a Rathmell, JC (2011). Špičkové: odlišné glykolytické a lipidové oxidačné metabolické programy sú nevyhnutné pre efektorové a regulačné podskupiny CD4 plus T buniek. J. Immunol. 186, 3299-3303.

Nakaya, M., Xiao, Y., Zhou, X., Chang, J.-H., Chang, M., Cheng, X., Blonska, M., Lin, X., and Sun, S.-C . (2014). Zápalové reakcie T buniek sa spoliehajú na uľahčenie vychytávania glutamínu pomocou transportéra aminokyselín ASCT2 a aktivácie kinázy mTORC1. Imunita 40, 692–705.

Nilsson, R., Jain, M., Madhusudhan, N., Sheppard, NG, Strittmatter, L., Kampf, C., Huang, J., Asplund, A. a Mootha, VK (2014). Expresia metabolických enzýmov zdôrazňuje kľúčovú úlohu MTHFD2 a mitochondriálnej folátovej dráhy pri rakovine. Nat. komun. 5, 3128.

Palmer, LD, Maloney, KN, Boyd, KL, Goleniewska, AK, Toki, S., Maxwell, CN, Chazin, WJ, Peebles, RS, Jr., Newcomb, DC a Skaar, EP (2019). Innate Immune Protein S100A9 chráni pred 2-sprostredkovaným alergickým zápalom dýchacích ciest sprostredkovaným T-helper bunkami. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 61, 459-468.

Pikman, Y., Puissant, A., Alexe, G., Furman, A., Chen, LM, Frumm, SM, Ross, L., Fenouille, N., Bassil, CF, Lewis, CA, a kol. (2016). Zacielenie na MTHFD2 pri akútnej myeloidnej leukémii. J. Exp. Med. 213, 1285–1306.

Que'me' neur, L., Gerland, L.-M., Flacher, M., Ffrench, M., Revillard, J.-P., and Genestier, L. (2003). Diferenciálna kontrola bunkového cyklu, proliferácie a prežitia primárnych T lymfocytov purínovými a pyrimidínovými nukleotidmi. J. Immunol. 170, 4986-4995.

Que' me' neur, L., Beloeil, L., Michallet, M.-C., Angelov, G., Tomkowiak, M., Revillard, J.-P., and Marvel, J. (2004). Obmedzenie biosyntézy nukleotidov de novo interferuje s klonálnou expanziou a diferenciáciou na efektorové a pamäťové CD8 T bunky. J. Immunol. 173, 4945-4952.

Rae, C. a Mairs, RJ (2019). Aktivácia AMPK pomocou AICAR senzibilizuje bunky rakoviny prostaty na rádioterapiu. Oncotarget 10, 749-759.

Ron-Harel, N., Santos, D., Ghergurovich, JM, Sage, PT, Reddy, A., Lovitch, SB, Dephoure, N., Satterstrom, FK, Sheffer, M., Spinelli, JB a kol. (2016). Mitochondriálna biogenéza a remodelácia proteómu podporujú metabolizmus jedného uhlíka pre aktiváciu T buniek. Cell Metab. 24, 104-117.

Shahi, SK, Freedman, SN, Murra, AC, Zarei, K., Sompallae, R., Gibson Corley, KN, Karandikar, NJ, Murray, JA a Mangalam, AK (2019). Prevotella histicola, komenzál ľudského čreva, je rovnako účinný ako COPAXONE na zvieracom modeli roztrúsenej sklerózy. Predné. Immunol. 10, 462.

Shalem, O., Sanjana, NE, Hartenian, E., Shi, X., Scott, DA, Mikkelson, T., Heckl, D., Ebert, BL, Root, DE, Doench, JG a Zhang, F. (2014). Skríning CRISPR-Cas9 knockout na úrovni genómu v ľudských bunkách. Science 343, 84–87.

Sharma, U. a Rando, Ú. v. (2017). Metabolické vstupy do epigenómu. Cell Metab. 25, 544-558.

Shi, LZ, Wang, R., Huang, G., Vogel, P., Neale, G., Green, DR, a Chi, H. (2011). Glylytická dráha závislá od HIF1alfa organizuje metabolický kontrolný bod pre diferenciáciu buniek T H17 a Treg. J. Exp. Med. 208, 1367–1376.

Shin, M., Momb, J., a Appling, DR (2017). Ľudský mitochondriálny MTHFD2 je metyléntetrahydrofolátdehydrogenáza/metyltetrahydrofolátcyklohydroláza špecifická pre duálny redoxný kofaktor. Rakovina Metab. 5, 11.

Skene, PJ a Henikoff, S. (2017). Účinná cielená nukleázová stratégia na mapovanie väzbových miest DNA s vysokým rozlíšením. eLife 6, e21856.

Su, C.-C., Hsieh, K.-L., Liu, P.-L., Yeh, H.-C., Huang, S.-P., Fang, S.-H., Cheng, W.-C., Huang, K.-H., Chiu, F.-Y., Lin, I.-L., a kol. (2019). AICAR indukuje apoptózu a inhibuje migráciu a inváziu v bunkách rakoviny prostaty prostredníctvom dráhy závislej od AMPK/mTOR. Int. J. Mol. Sci. 20, 1647.

Su, X., Wellen, KE a Rabinowitz, JD (2016). Metabolická kontrola metylácie a acetylácie. Curr. Opin. Chem. Biol. 30, 52-60.

Tan, H., Yang, K., Li, Y., Shaw, TI, Wang, Y., Blanco, DB, Wang, X., Cho, J.-H., Wang, H., Rankin, S. a kol. (2017). Profilovanie integračnej proteomiky a fosfoproteomiky odhaľuje dynamické signalizačné siete a cesty bioenergetiky, ktoré sú základom aktivácie T buniek. Imunita 46, 488–503.

Toffalini, F., Kallin, A., Vandenberghe, P., Pierre, P., Michaux, L., Cools, J. a Demoulin, J.-B. (2009). Fúzne proteíny TEL-PDGFR a FIP1L1-PDGFR unikajú ubikvitinácii a degradácii. Haematologica 94, 1085–1093.

Wan, X., Wang, C., Huang, Z., Zhou, D., Xiang, S., Qi, Q., Chen, X., Arbely, E., Liu, C.-Y., Du, P. a Yu, W. (2020). Cisplatina inhibuje SIRT3-deacetyláciu MTHFD2, aby narušila bunkovú redoxnú rovnováhu v bunke kolorektálneho karcinómu. Cell Death Dis. 11, 649.

Wang, L., Xing, X., Chen, L., Yang, L., Su, X., Rabitz, H., Lu, W., a Rabinowitz, JD (2019). Špičkový anotačný a overovací nástroj pre necielenú LC-MS metabolomiku. Anal. Chem. 91, 1838–1846.

Yang, M. a Vousden, KH (2016). Metabolizmus serínu a jedného uhlíka pri rakovine. Nat. Rak 16, 650–662.

Yue, L., Pei, Y., Zhong, L., Yang, H., Wang, Y., Zhang, W., Chen, N., Zhu, Q., Gao, J., Zhi, M., a kol. (2020). Mthfd2 moduluje mitochondriálnu funkciu a opravu DNA, aby sa zachovala pluripotencia myších kmeňových buniek. Správy kmeňových buniek 15, 529-545.

Zhu, Z. a Leung, GKK (2020). Viac ako metabolický enzým: MTHFD2 ako nový cieľ protirakovinovej terapie? Predné. Oncol. 10, 658.

STAR★METÓDY

TABUĽKA KĽÚČOVÝCH ZDROJOV

DOSTUPNOSŤ ZDROJOV

Vedúci kontakt

Ďalšie informácie a požiadavky na zdroje a reagencie by mali byť adresované vedúcemu kontaktu Dr. Jeffrey Rathmell (jeff.rathmell@vumc.org) a po dokončení príslušného MTA budú splnené.

Dostupnosť materiálov

Plazmidy a myšacie línie vytvorené v tejto štúdii budú na požiadanie dostupné po dokončení vhodnej MTA.

Dostupnosť údajov a kódov

Údaje o sekvenovaní CUT&RUN boli uložené v GEO a sú verejne dostupné od dátumu publikácie (GSE180356). Údaje z mikroskopu a pôvodné obrázky Western blot uvedené v tomto dokumente budú na požiadanie zdieľané kontaktnou osobou vedúceho. Akékoľvek ďalšie informácie potrebné na opätovnú analýzu údajov uvedených v tomto dokumente sú na požiadanie k dispozícii u vedúceho kontaktu.

Kliknite na Cistanches pre imunitu