Viaczložkové režimy očkovania proti Chlamydia Trachomatis s primárnym účinkom indukujú protilátkové a T bunkové reakcie a urýchľujú odstraňovanie infekcie u modelu primátov (okrem človeka) Ⅱ

Materiály a metódy

Vakcinačné antigény a adjuvans

V tejto štúdii boli použité rôzne vakcínové antigény a adjuvans: CTH522 vakcínový antigén na báze MOMP (11) bol podaný intramuskulárnou cestou (IM) s CAF01 adjuvans (42) alebo adjuvans hydroxid hlinitý (AlOH) alebo intranazálnou cestou ( IN) bez adjuvans. Plazmidová DNA vakcína, pcDNA3.1-MOMP, bola vyrobená klonovaním konsenzuálnej MOMP do plazmidového vektora pcDNA3.1 (14) a podaná intradermálnou (ID) cestou s elektroporáciou (EP) do chrbta. Vakcína s rekombinantným ľudským adenovírusom sérotypu 5 (rHuAd5) exprimujúca MOMP (HuAd5-MOMP) bola vyrobená homológnou rekombináciou konsenzuálneho MOMP (AAC45154.1) do vektora pAL1112 HuAd5 s deletovaným E1 a E2 a podaná intramuskulárnou cestou (14) . Modifikovaná vakcína Ankara-MOMP vyrobená spoločnosťourekombinujúci konsenzus MOMP(AAC45154.1) do plazmidu p3186 a atenuovaného vektora MVA (14) a podávaný cezintramuskulárnou cestou.

Kliknite sem a získajte protizápalový liek Cistanche

Zásoba sérovaru D C. trachomatis

Sérovar D Chlamydia trachomatis (Ct SvD; UW{{0}}}/Cx, ATCC® VR-885™) bol získaný z American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) a propagovaný v HeLa{ {2}} buniek, zozbieraných a purifikovaných, ako je opísané v Caldwell et al. (43). Zásobný roztok C. trachomatis SvD bol skladovaný pri -80 stupni v 0,2 M sacharóze, 20 mM fosforečnane sodnom (pH 7,4) a 5 mM kyseline glutámovej (SPG) a koncentrácia jednotiek tvoriacich inklúzie (IFU) bola stanovená v HeLa{11}} bunky a McCoyove bunky.

Primáty (okrem človeka).

Tridsať makakov cynomolgus (Macaca fascicularis) s hmotnosťou 3 až 5 kg bolo zahrnutých do štúdie spracovanej v zariadeniach NHP úrovne 3 biologickej bezpečnosti (ABSL3) IDMIT („Modely infekčných chorôb a inovatívne terapie“ v CEA „Commissariat à l'Energie Atomique“, Fontenay-aux-Roses, Francúzsko; akreditácia č. #D92- 032-02). Protokoly boli schválené inštitucionálnym etickým výborom "Comité d'Ethique en Expé rimentation Animale du Commissariat à l'Energie Atomique et aux Energies Alternatives" (CEtEA #44) pod číslom vyhlásenia A14-026. Štúdia bola schválená "Ministerstvom výskumu, inovácií a vzdelávania" pod registračným číslom APAFIS#720-201505281237660. Všetky zvieratá boli pred štúdiou testované negatívne na SIV, SHIV, STLV (opičí Tlymfotropný vírus), herpes B vírus, filovírus, SRV-1, SRV-2 a potvrdilo sa, že sú séronegatívne na chlamýdiovú infekciu. Všetky experimentálne postupy boli vykonané podľa európskych smerníc pre starostlivosť o zvieratá ("Journal Officiel de l'Union Europé enne", smernica 2010/63/ UE, 22. septembra 2010).

Očkovacie protokoly

3 0 makaky boli náhodne rozdelené do 6 skupín s 5 zvieratami v každej. Rôzne režimy prime-boost očkovania pre 6 skupín sú podrobne znázornené na obrázku 1. Počas všetkých vakcinácií boli makaky sedatívne podávané ketamín chlórhydrátom (10 mg/kg telesnej hmotnosti intramuskulárne). CTH522 (85 µg na zviera) sa podával intramuskulárnou (IM) cestou buď s CAF{{20}}}1 adjuvans (625 µg/125 µg) alebo AlOH adjuvans (0,425 mg 1, ako je znázornené na obrázku 1. IM imunizácie sa uskutočnili v objeme 0,6 ml v pravom stehne (M. quadriceps) zvieraťa. CTH522 intranazálne (IN) imunizácie (30 ug na zviera) sa uskutočňovali pomocou zariadenia Vaxinator pripojeného k 1 ml injekčnej striekačke s dvoma po sebe nasledujúcimi podaniami 0,25 ml, jedným do každej nosovej dierky. Vakcína DNA-MOMP bola podaná intradermálnou (ID) cestou s elektroporáciou (EP) do kože chrbta. ID sa vstreklo 6 opakovaných objemov 0,1 ml (celkovo 1 mg) a následne EP použitím systému Nepagen™ (nastavenia: 6 štvorcových impulzov 10 ms s 90 ms intervalmi pri 110 V, (300- 700mA)) . Vakcína hAd5-MOMP bola podaná IM s dávkou 1011 vírusových častíc v 1 ml na zviera. Vakcína MVA-MOMP bola podaná IM s dávkou 4 x 108 PFU na zviera v objeme 0,5 ml**. Naivná skupina nedostala žiadne očkovanie a bola považovaná za kontrolnú skupinu.

Zbierka vzoriek

Počas všetkých odberových procedúr boli makaky sedatívne podávané chlórhydrátom ketamínu (10 mg/kg telesnej hmotnosti IM). Krv sa odoberala femorálnou venepunkciou v 0., 2., 4., 6., 8., 10., 16., 18., 20., 22., 24. týždni. Cervikovaginálna tekutina na detekciu protilátok sa odoberala pomocou Weck-Cel®spears (Medtronic Ophthalmics, Jacksonville, FL , USA) v 4., 8., 16., 18., 20., 22. a 24. týždni. Cervikovaginálne vzorky na detekciu chlamýdiovej záťaže sa odoberali bežnými plochými tampónmi (Mast Diagnostic - ref.: 552C/ 10). Po kontakte s vagino-cervikálnou sliznicou sa tampón umiestnil do liekovky obsahujúcej médium UTM-RT (Mast Diagnostic – ref.: 330C/6) a uchovával sa na ľade.

Vaginálna provokačná infekcia s 5 x 107 IFU C. trachomatis SvD

Zvieratá dostali sedáciu ketamín chloridom (10 mg/kg IM), umiestnili ich do ventrálnej ľahu so zdvihnutými bokmi a 1 ml inokula sa traumaticky aplikovalo priamo na vaginálnu sliznicu pri vagino-cervikálnom prechode pomocou 1 ml striekačky. Každému zvieraťu bola podaná dávka 5 x 107 IFU. Zviera sa nechalo krátko po inokulácii ležať vo ventrálnej polohe so zdvihnutými bokmi.

Enzýmovo viazaný imunosorbentový test

CTH522špecifické protilátkyvo vzorkách séra a tampónov sa zistilo nepriamym testom ELISA. Doštičky Maxisorp® (NUNC A/S, Roskilde, Dánsko) boli potiahnuté CTH522 (0,5 ug/ml) cez noc pri 4 stupňoch. Izotypy IgG a IgA boli detegované s HRP konjugovanými protilátkami špecifickými proti IgG primátov (43R-IG020HRP, Fitzgerald, Acton, MA, USA, 1:75).{10 }}) a IgA (43C-CB1631, Fitzgerald, USA, 1:50.000). Reakcie boli vizualizované substrátom TMB PLUS (KemEnTec, Taastrup, Dánsko) a zastavené 0,5 M kyselinou sírovou. Doštičky sa odčítali na čítačke ELISA pri 450 nm s korekciou pri 650 nm. Pozitívna kontrola (sérum z predchádzajúcej štúdie) sa použila ako vnútorný štandard na korekciu variácií medzi platňami. Na každej platni boli analyzované dve jamky bez substrátu ako negatívna kontrola. Titre protilátok sa vypočítali ako prevrátená hodnota najvyššieho riedenia s hodnotou optickej hustoty (OD) vyššou ako medzná hodnota. Hranica sa určila z priemeru vzorky v deň 0 plus 2 x SD.

Peptidové pole a analýza

Peptidový rad CTH522 bol navrhnutý s trojitými replikátmi imobilizovaných 15mérnych peptidov prekrývajúcich sa o 14 aminokyselín, ktoré boli vytlačené na funkcionalizované sklenené sklíčka a inkubované so vzorkami séra od JPT Peptide Technologies, Berlín. Stručne, čip sa inkuboval so vzorkami séra odobratými v 24. týždni a komplexy IgG peptidov sa vizualizovali pomocou biotinylovaného kozieho anti-opičieho IgG a Alexa Fluor® 647 Streptavidínu. Sklíčka sa skenovali skenerom s vysokým rozlíšením pri 635 nm a údaje sa uvádzali ako ľubovoľné jednotky fluorescencie. Bol stanovený priemer troch hodnôt, ak bol variačný koeficient väčší ako 0,5, použili sa len 2 najbližšie hodnoty. 10 percent signálu maximálnej intenzity (65 535) sa použilo ako hranica pre apozitívna odozvaa stredným signálom pod touto prahovou hodnotou bola priradená hodnota zodpovedajúca polovici prahovej hodnoty (3277).

In vitro neutralizačný test

Neutralizačný test in vitro sa uskutočnil na testovanie schopnosti sérových protilátok indukovaných vakcínou neutralizovať chlamýdiovú infekciu HaK buniek in vitro. Test sa v zásade riadil protokolom opísaným vyššie (44). Najprv sa vzorky séra od jednotlivých zvierat inkubovali pri 56 stupňoch počas 30 minút, aby sa inaktivoval komplement. Zásoby chlamýdií (SvD, SvE a SvF) sa zmiešali a inkubovali so sériovými riedeniami inaktivovaného séra z každého z očkovaných zvierat počas 30 minút a potom sa naočkovali na monovrstvu HaK buniek v 96-jamkových platniach s plochým dnom v duplikáty. Po 30 hodinách inkubácie boli bunky a inklúzie fixované a vizualizované pomocou polyklonálneho králičieho anti-Ct043 séra a fluorescenčne značenej sekundárnej protilátky (Alexa Flour 488, kozí anti-králičí IgG, A11008, Life Technologies) v zriedení 1:500 . Počítanie inklúzií sa uskutočnilo manuálne v 20 zorných poliach pri 40-násobnom zväčšení (invertovaný fluorescenčný mikroskop Olympus IX71). Neutralizácia sa vypočítala ako percentuálne zníženie priemerného počtu IFU v porovnaní so súborom sér od zvierat kontrolnej skupiny (naivných).

Intracelulárne farbenie cytokínov PBMC a spoločná cytometria

PBMC boli izolované a ({{0}}} x 106) boli resuspendované v 150 ul kompletného média obsahujúceho 0,2 ug každej kostimulačnej protilátky CD28 a CD49b. Stimulácia sa uskutočnila v 96 jamkách/doštičkách s použitím 2 uM každého peptidového poolu alebo SEB (ako pozitívna kontrola) alebo samotného média (ako negatívna kontrola). Brefeldin A bol pridaný do každej jamky v konečnej koncentrácii 10 ug/ml a doštička bola inkubovaná pri 37 °C, 5 percent C02 cez noc. Bunky sa potom premyli, zafarbili sa životaschopným farbivom (fialové, fluorescenčné reaktívne farbivo, Invitrogen), fixovali sa a permeabilizovali s činidlom BD Cytofifix/Cytoperm. Vzorky permeabilizovaných buniek sa potom pred farbením uchovávali pri -80 stupni. Farbenie protilátky sa uskutočnilo v jednom kroku po permeabilizácii. Všetky použitéprotilátkysú uvedené v tabuľke 1. Po 30 minútach inkubácie na ľade v tme sa bunky premyli v BD Perm/Wash pufri. Bunky sa spočítali pomocou LSR II (BD) ihneď po procedúre farbenia a na analýzu údajov sa použil softvér FlowJo.

TABUĽKA 1 Protilátky používané na farbenie markerov imunitných buniek a intracelulárnych cytokínov

Detekcia vaginálnej chlamýdiovej DNA pomocou kvalitatívnej PCR

Abbott RealTime CT/NG test (ABBOTT, Rungis, Francúzsko) je in vitro test polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) na priamu, kvalitatívnu detekciu plazmidovej DNA pre CT (C.trachomatis) a NG (N. gonorrhoeae) genómy. . Nukleová kyselina sa extrahovala zo vzoriek UTM (univerzálne transportné médium) na M2000SP a amplifikácia sa uskutočnila na M2000SP podľa pokynov výrobcu. Výsledky boli vyjadrené ako prah cyklu (Ct).

Štatistická analýza

Všetky štatistiky boli vykonané pomocou softvéru GraphPad Prism (verzia 8.1.2). Údaje, ktoré nie sú normálne rozdelené, boli analyzované neparametrickými testami; Kruskal-Wallisov test a Dunnov viacnásobný porovnávací test na určenie významnosti rozdielu medzi skupinami. Krivky ukazujúce percento PCR negatívnych zvierat sa porovnali so štatistickým testom Log-rank (Mantel-Cox). Porovnania sa považovali za štatisticky významné, ak hodnota P bola < 0.05 (P < 0.05). Ďalšie hladiny významnosti sú označené hviezdičkami *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.

Vyhlásenie o dostupnosti údajov

Pôvodné príspevky prezentované v štúdii sú zahrnuté v článku/doplnkovom materiáli. Ďalšie otázky možno smerovať na príslušného autora.

Etické vyhlásenie

Štúdia na zvieratách bola posúdená a schválená "Comité d'Ethique en Expérimentation Animale du Commissariat à l'Energie Atomique et aux Energies Alternatives" (CEtEA #44) pod číslom vyhlásenia A14-026. Štúdia bola schválená "Ministerstvom výskumu, inovácií a vzdelávania" pod registračným číslom APAFIS#720-201505281237660.

Autorské príspevky

Vymyslené a navrhnuté experimenty: JD, FF, EL, PA, RG, RS. Vykonané pokusy: VC, DD, BD, SL, CD, CJ, ND-B, CB, BB, AT. Vyrábané vakcíny a antigénové konštrukty: IR, PM, AO. Analyzované údaje: JD, EL, FF, IR, HJ. Príspevok vypracoval a upravil: JD, EL, FF. Každý z uvedených spoluautorov významne prispel k práci prostredníctvom dizajnu a koncepcie a/alebo získavania, analýzy a interpretácie údajov. Všetci autori prispeli k článku a schválili predloženú verziu.

Poďakovanie

Ďakujeme Fondation Dormeur, Vaduz za dar pre vírusovú evolúciu a prenosovú jednotku na laboratórne prístroje relevantné pre tento projekt.

Konflikt záujmov FF, IR, PA a AWO sú spoluvynálezcami patentovej prihlášky na vakcíny proti chlamýdiám [WO2014146663A1]. Všetky práva boli pridelené Statens Serum Institut, dánskemu neziskovému vládnemu inštitútu. Zostávajúci autori vyhlasujú, že výskum bol vykonaný bez akýchkoľvek obchodných alebo finančných vzťahov, ktoré by mohli byť chápané ako potenciálny konflikt záujmov.

Poznámka vydavateľa Všetky tvrdenia vyjadrené v tomto článku sú výlučne tvrdeniami autorov a nemusia nevyhnutne predstavovať tvrdenia ich pridružených organizácií alebo tvrdenia vydavateľa, redaktorov a recenzentov. Žiadny produkt, ktorý môže byť hodnotený v tomto článku, alebo tvrdenie, ktoré môže uviesť jeho výrobca, nie je zaručené ani schválené vydavateľom.

Referencie

1. Newman L, Rowley J, Vander Hoorn S, Wijesooriya NS, Unemo M, Low N, a kol. Globálne odhady prevalencie a incidencie štyroch liečiteľných sexuálne prenosných infekcií v roku 2012 na základe systematického prehľadu a globálnych správ. PLoS One (2015) 10(12):e0143304. doi: 10.1371/journal.pone.0143304

2. Longbottom D, Coulter LJ. Zvieracie chlamýdiózy a zoonotické dôsledky. J Comp Pathol (2003) 128 (4): 217–44. doi: 10.1053/jcpa.2002.0629

3. Haggerty CL, Gottlieb SL, Taylor BD, Low N, Xu F, Ness RB. Riziko následkov po infekcii genitálií chlamydia trachomatis u žien. J Infect Dis (2010) 201 Suppl 2:S134–55. doi: 10.1086/652395

4. Dodet B. Súčasné bariéry, výzvy a príležitosti pre vývoj účinných vakcín proti STI: pohľad výrobcov vakcín, biotechnologických spoločností a finančných agentúr. Vaccine (2014) 32 (14): 1624–9. doi: 10.1016/ j.vaccine.2013.08.032

5. Brunham RC, Kuo CC, Cles L, Holmes KK. Korelácia imunitnej odpovede hostiteľa s kvantitatívnou obnovou Chlamydia trachomatis z ľudského endocervixu. Infect Immun (1983) 39 (3): 1491–4. doi: 10.1128/iai.39.3.{10}}.1983

6. Cotter TW, Meng Q, Shen ZL, Zhang YX, Su H, Caldwell HD. Ochranná účinnosť imunoglobulínu a (IgA) a IgG monoklonálnych protilátok špecifických pre hlavný proteín vonkajšej membrány v myšom modeli infekcie pohlavného traktu chlamydia trachomatis. Infect Immun (1995) 63 (12): 4704–14. doi: 10.1128/iai.63.12.{11}}.1995

7. Johansson M., Schon K., Ward M., Lycke N. Štúdie na myšiach s knockoutom odhaľujú, že antichlamýdiová ochrana vyžaduje bunky TH1 produkujúce IFN-gama: platí to pre ľudí? Scand J Immunol (1997) 46 (6): 546-52. doi: 10.1046/j.{11}}.1997.d01-167.x

8. Gondek DC, Olive AJ, Starý G, Starnbach MN. CD4 plus T bunky sú nevyhnutné a dostatočné na to, aby poskytli ochranu pred infekciou chlamydia trachomatis v hornom pohlavnom trakte myší. J Immunol (2012) 189 (5): 2441–9. doi: 10.4049/ jiimmunol.1103032

9. Armitage CW, O'Meara CP, Harvie MC, Timms P, Wijburg OL, Beagley KW. Hodnotenie intra- a extraepiteliálnych sekrečných IgA pri chlamýdiových infekciách. Imunológia (2014) 143 (4): 520–30. doi: 10.1111/imm.12317

10. Armitage CW, O'Meara CP, Harvie MC, Timms P, Blumberg RS, Beagley KW. Rozdielne výsledky po transcytóze IgG zacielenej na intracelulárne a extracelulárne chlamýdiové antigény. Immunol Cell Biol (2014) 92 (5): 417-26. doi: 10.1038/icb.2013.110

11. Olsen AW, Follmann F, Erneholm K, Rosenkrands I, Andersen P. Ochrana proti infekcii Chlamydia trachomatis a patologickým zmenám horného genitálneho traktu vakcínou podporovanými neutralizujúcimi protilátkami namierenými proti VD4 hlavného proteínu vonkajšej membrány. J Infect Dis (2015) 212 (6): 978–89. doi: 10.1093/infdis/jiv137

12. Nguyen N, Guleed S, Olsen AW, Follmann F, Christensen JP, Dietrich J. Imunita rezidentná v tkanive Th1/Th17 T buniek zvyšuje ochranu, ale nie je potrebná vo vakcinačnej stratégii proti genitálnej infekcii chlamydia trachomatis. Front Immunol (2021) 12:790463. doi: 10.3389/fifimmu.2021.790463

Požiadajte o viac:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel: plus 86 15292862950

Pridajte do košíka doplnok cistanche:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop