Mechanizmy inhibície melanogenézy vyvolanej N-(4-metoxyfenyl)kafeamidom

Pozadie:

Derivát kofeínu vykazuje antioxidačnú a antityrozinázovú aktivitu. Bola skúmaná aktivita a mechanizmus N-(4-metoxyfenyl)kofeínu (K36E) na melanogenézu.

Metódy:

Bunky B16F0 boli ošetrené rôznymi koncentráciami K36E; študoval sa obsah melanínu a súvisiaca signálna transdukcia. Na stanovenie expresie proteínu sa použil test Western blotting a na identifikáciu tyrozinázovej aktivity a obsahu melanínu sa uskutočnila spektrofotometria.

Výsledky:

Naše výsledky ukázali, že K36E znížil obsah melanínu indukovaný hormónom stimulujúcim melanocyty (-MSH) a aktivitu tyrozinázy v bunkách B16F0. Okrem toho K36E inhiboval expresiu proteínu viažuceho element na fosfo-cyklický adenozínmonofosfát (cAMP), transkripčného faktora spojeného s mikroftalmiou (MITF), tyrozinázy a proteínu súvisiaceho s tyrozinázou-1 (TRP{{14} }). K36E aktivoval fosforyláciu proteínkinázy B (AKT) a glykogénsyntázy kinázy 3 beta (GSK3), čo viedlo k inhibícii transkripčnej aktivity MITF. K36E zoslabil -MSH-indukované cAMP dráhy, čo prispieva k hypopigmentácii.

Zároveň sme vo výskume našli aj novú aplikáciu celkových glykozidov Cistanche deserticola alebo extraktu s obsahom fenyletanoidných glykozidov Cistanche deserticola a pozorovali sme inhibičný účinok celkových glykozidov Cistanche deserticola na tyrozinázu použitím rýchlosti tyrozinázy dopa. oxidačná metóda. Tyrozináza je hlavným enzýmom obmedzujúcim rýchlosť biosyntézy kožného melanínu a je to komplex medi a bielkovín. Môže hydroxylovať tyrozín, hlavnú surovinu na produkciu melanínu v tele, za vzniku L-dopy a následne oxidovať dopa na dopachinón. Dopachinón prechádza sériou metabolických procesov, preskupuje sa a polymerizuje a nakoniec sa spája s kombináciou proteínov, čím vzniká séria melanínu, ktorý spôsobuje hnednutie, takže sme zistili, že Cistanche deserticola má významný účinok na zníženie tyrozinázy.

Kliknite na zdravotné prínosy produktu cistanche

Závery:

K36E reguloval syntézu melanínu znížením expresie downstream proteínov vrátane p-CREB, p-AKT, p-GSK3, tyrozinázy a TRP-1 a aktivoval transkripčný faktor MITF. K36E môže mať potenciál vyvinúť sa ako činidlo na bielenie pokožky.

Kľúčové slová:

N-(4-metoxyfenyl) kofeín, melanogenéza, propolis, transkripčný faktor spojený s mikroftalmiou, proteín viažuci prvok odpovede cAMP, kináza 3 beta glykogénsyntázy.

Pozadie

Melanín hrá kľúčovú úlohu pri prevencii fotopoškodenia a fotokarcinogenézy kože; abnormálna akumulácia melanínu však vyvoláva hyperpigmentačné poruchy, ako sú starecké škvrny a melazma [1, 2]. Melanogenéza je séria zložitých procesov s mnohými zúčastnenými faktormi. Genetické pozadie je najdôležitejším faktorom pre pigmentáciu kože; Zistilo sa, že viac ako 150 génov reguluje biosyntézu melanínu [3–5].

Okrem toho negenetické faktory, ako sú lieky, hormonálne zmeny, zápaly, starnutie a vystavenie ultrafialovému (UV) žiareniu, ovplyvňujú pigmentáciu kože [4, 5]. Melanogenézu regulujú rôzne proteíny a enzýmy vrátane tyrozinázy, transkripčného faktora súvisiaceho s mikroftalmiou (MITF), proteínu súvisiaceho s tyrozinázou-1 (TRP-1) a proteínu súvisiaceho s tyrozinázou-2 (TRP -2) ​​[4, 6–8]. UV ožarovanie stimuluje v keratinocytoch sekréciu -melanocyty stimulujúceho hormónu ( -MSH), ktorý sa viaže na melanokortínový 1 receptor (MC1R) a katalyzuje konverziu adenozíntrifosfátu na cyklický adenozínmonofosfát (cAMP) [9]. cAMP stimuluje proteínkinázu A (PKA) a PKA sa translokuje do jadra a aktivuje proteín viažuci prvok odpovedajúci na cAMP (CREB) [10, 11]. Proteín viažuci prvok fosfo-cAMP (p-CREB) zvyšuje expresiu MITF, aby indukoval expresiu tyrozinázy, TRP-1 a TRP-2. Tyrozináza podlieha dozrievaniu a aktivácii prostredníctvom viacerých mechanizmov, vrátane väzby medi, glykozylácie a fosforylácie, čo vedie k syntéze melanínu [12].

Významný výskum študoval reguláciu biosyntézy melanínu pre vývoj hypopigmentovaných činidiel. Na inhibíciu aktivity tyrozinázy a zníženie syntézy melanínu bolo vyvinutých niekoľko inhibítorov tyrozinázy, ktoré zabraňujú hyperpigmentácii buď syntézou alebo izoláciou z prírodných zdrojov [1, 2, 7, 13]. N-(4-metoxyfenyl)kofeín (K36E; obr. 1) je analógom fenetylesteru kyseliny kávovej, aktívnej zložky propolisu. V našej predchádzajúcej štúdii kofeínový derivát vykazoval antioxidačné vlastnosti, zabraňoval degradácii kožného kolagénu po vystavení UVB žiareniu a stimuloval syntézu kolagénu vo fibroblastoch ľudskej kože a u bezsrstých myší [14, 15]. Ďalší kofeínový derivát vykazoval antimelanogénnu aktivitu inhibíciou aktivity a expresie tyrozinázy [16].

Okrem toho deriváty kyseliny kávovej, ako je trans-N-kafeoyltyramín a trans-N-dihydro-p-hydroxycinnamoyltyramín, inhibovali aktivitu tyrozinázy v melanocytoch [17]. Preto sme špekulovali, že K36E inhibuje melanogenézu. V súčasnej štúdii sme skúmali vplyv aktivity K36E na syntézu melanínu v bunkách B16F{10}}, čo je dobre zavedený model na skúmanie činidiel na bielenie kože [18–20]. Okrem toho sme skúmali, či anti-melanogénna aktivita K36E závisí od regulácie TRP1, AKT/glykogénsyntáza kinázy 3 beta (GSK3)/CREB a MITF.

Metódy

Materiály a chemikálie

K36E bol syntetizovaný a identifikovaný profesorom YuehHsiung Kuo s čistotou 99,9 percenta [21]. -MSH bol zakúpený od spoločnosti Merck (Darmstadt, Nemecko). Arbutín, 3,4-dihydroxy-L-fenylalanín (L-DOPA), DL-ditiotreitol, hydrát H-89dihydrochloridu, fenylmetánsulfonylfluorid a L-tyrozín boli zakúpené od spoločnosti Sigma-Aldrich Chemical Co. ( Louis, MO, USA). Fetálne hovädzie sérum (FBS), Dulbeccovo modifikované Eaglovo médium (DMEM) a kyselina trypsín-etyléndiamíntetraoctová (EDTA) boli zakúpené od GIBCO Invitrogen Corporation (NY, USA). Protilátka rozpoznávajúca MITF bola získaná od Abcam (Cambridge, MA, USA). Protilátky rozpoznávajúce p-CREB a CREB boli zakúpené od Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA). Protilátky rozpoznávajúce fosfo-AKT, AKT a fosfo-glykogénsyntázu kinázu 3 beta (p-GSK3) boli získané od GeneTex, Inc. (CA, USA). Protilátky rozpoznávajúce aktín, GSK3, TRP-1 a tyrozinázu boli získané od Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA).

Účinok K36E na inhibíciu tyrozinázy húb

Aktivita hubovej tyrozinázy bola stanovená spektrofotometricky s malými úpravami vyššie opísaného postupu [7, 21–23]. Arbutín (2 mM) bol pozitívnou kontrolou. Testovaná vzorka a L-tyrozín vo fyziologickom roztoku s fosfátovým pufrom (PBS) sa pridali do 96-jamkovej mikroplatničky (Nunc, Dánsko) a pridala sa hubová tyrozináza. Po inkubácii sa množstvo dopacrómu produkovaného v reakčnej zmesi stanovilo pri optickej hustote 492 nm pomocou čítačky mikrodoštičiek (Tecan, Grodig, Rakúsko).

Bunkové kultúry

Bunky B16F{1}} boli zakúpené od Bioresource Collection and Research Center na Taiwane a kultivované v DMEM doplnenom 10 percentami FBS a 100 jednotkami/ml penicilínu a streptomycínu pri 37 stupňoch v 5 percentách CO2.

Test životaschopnosti buniek

Experimenty s rastom buniek sa uskutočnili pomocou testu 3-(4, 5-dimetyltiazol-2-yl)-2, 5-difenyltetrazóliumbromidu (MTT) s malými úpravami skôr opísaný postup [7, 8, 24, 25]. Ako pozitívna kontrola bol použitý peroxid vodíka. Bunky boli kultivované cez noc a ošetrené rôznymi koncentráciami K36E počas 48 hodín a potom bol do každej jamky pridaný roztok MTT. Po inkubácii sa pridal roztok dodecylsulfátu sodného (SDS), čím sa rozpustili kryštály formazanu produkované v bunkách. Optická hustota sa merala pri 570 nm s použitím čítačky mikrodoštičiek (Tecan, Grodig, Rakúsko).

Obsah bunkového melanínu

Obsah melanínu v B16F0 bunkách sa meral pomocou metódy modifikovanej z predchádzajúcich štúdií [7, 8, 23]. Bunky B16F0 boli nasadené na 6-jamkové platne v hustote 7 x 104 buniek na jamku a inkubované cez noc. Bunky boli vystavené médiu obsahujúcemu -MSH a K36E počas 48 hodín. Arbutín (1 mM) bol pozitívnou kontrolou. Do každej jamky sa pridal NaOH (2 N) na lýzu buniek, ktoré sa potom centrifugovali. Obsah melanínu v supernatante sa meral pri 405 nm pomocou čítačky ELISA (Tecan, Grodig, Rakúsko).

Test aktivity bunkovej tyrozinázy

Tyrozinázová aktivita B16F0 buniek po ošetrení K36E bola meraná s miernou modifikáciou metódy opísanej v predchádzajúcich štúdiách [7, 26, 27]. Bunky B16F0 boli nanesené na 24-jamkové multimisky a inkubované cez noc. Bunky boli ošetrené rôznymi koncentráciami K36E a boli inkubované ďalších 48 hodín. Boli premyté PBS a lýzované 1 percentom Triton X-100 zmiešaným v 100 mM PBS (pH 6,8); výsledná zmes bola zmrazená počas inkubácie pri -80 stupňoch počas 15 minút a rozmrazená pri teplote miestnosti. Následne boli vzorky odstredené. Čerstvo pripravený substrát (15 mM L-DOPA v 48 mM tlmivom roztoku fosforečnanu sodného s pH 7,1) sa pridal k supernatantu a inkuboval sa. Absorbancia sa následne merala pri 405 nm pomocou čítačky mikrodoštičiek (Tecan, Grodig, Rakúsko).

Rýchlosť aktivity tyrozinázy sa vypočítala pomocou nasledujúcej rovnice:

Western blot analýza

Analýza Western blot sa použila na demonštráciu účinkov K36E na expresiu proteínov súvisiacich s melanogenézou v B16F0 bunkách, ako už bolo opísané [7, 8, 22, 28, 29]. Bunky B16F{{10}} sa vysiali na misku 10-cm počas 24 hodín a ošetrili sa samotným -MSH (kontrolná skupina) alebo -MSH plus rôznymi koncentráciami K36E počas 48 hodín. Lyzáty sa odstredili a obsah proteínu sa stanovil pomocou Bradfordovho činidla (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Dvadsať mikrogramov proteínu sa separovalo na gélovej elektroforéze na dodecylsulfát-polyakrylamidovom géli (SDS-PAGE) a blotovalo s použitím polyvinylidéndifluoridovej (PVDF) membrány (Hybond ECL, Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ, USA). Bloty boli blokované 5 percentami (w/v) odstredeného mlieka v Tris-pufrovanom fyziologickom roztoku obsahujúcom 0,05 percenta Tween 20 a špecifickými protilátkami: aktín (1:1000), AKT (1:5000), p-AKT (1:5000 ), CREB (1:1000), p-CREB (1:1000), GSK3 (1:500), p-GSK3 (1:500), MITF (1:1000), TRP-1 (1: 500) a tyrozináza (1:200). PVDF membrány sa inkubovali so zodpovedajúcou konjugovanou anti-imunoglobulínovou G chrenovou peroxidázou (Santa Cruz Biotechnology, Inc.). Imunoreaktívne proteíny sa detegovali pomocou súpravy Enhanced Chemiluminescence Plus kit (Fujifilm, LAS4000) a sily signálu sa kvantifikovali pomocou denzitometrického programu (MultiGauge V2.2). Výsledky testov western blot predstavovali aspoň tri individuálne experimenty.

Štatistické analýzy

Hodnoty boli vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka od výsledkov aspoň troch individuálnych experimentov. Rozdiely v účinkoch rôznych liečebných postupov sa porovnávali pomocou Studentovho t-testu alebo ANOVA, ako aj Scheffeho testu prostredníctvom softvéru SPSS (verzia 12.0). P hodnoty<0.05 indicated significance. 

Výsledky

Inhibícia aktivity hubovej tyrozinázy pomocou K36E

K36E pri 1000 μM významne znížil aktivitu hubovej tyrozinázy. Inhibičný účinok hubovej tyrozinázy pri 500, 750 a 1000 μM bol 6,8 percenta ± 1,6 percenta, 14,0 percenta ± 7,1 percenta a 36,8 percenta ± 1,1 percenta. Okrem toho miera inhibície 2 mM arbutínu na aktivitu tyrozinázy húb bola 65,3 percenta ± 2,5 percenta.

Účinok K36E na životaschopnosť buniek B16F0

Životaschopnosť buniek po ošetrení 1, 1,5, 2, 2,5, 4, 5, 10, 25 a 50 μM K36E bola 92,7 percenta ± 2.0 percent , 91,7 percenta ± 2,1 percenta, 90,9 percenta ± 2,2 percenta, 87,8 percenta ± 4,2 percenta, 72,8 percenta ± 1.0 percenta, 68,5 percenta ± 2,4 percenta, 54,6 percenta ± 1,3 percenta, 38,6 percenta ± 1,6 percenta 0,8 percenta a 28,4 percenta ± 2,3 percenta. Peroxid vodíka bol pozitívnou kontrolou a životaschopnosť buniek 0,1 μM H2O2 bola 48,9 percenta ± 7,5 percenta po 48 hodinách liečby. Životaschopnosť buniek bola prijateľná pre vývoj materiálu pre kozmetiku. Podľa Medzinárodnej organizácie pre štandardizáciu (ISO) 10993–5:2009 (Biologické hodnotenie zdravotníckych pomôcok) sa životaschopnosť buniek vyššia ako 80 percent považuje za necytotoxicitu. Výsledky ukázali, že ošetrenie 0,5 až 2,5 uM K36E počas 48 hodín nemalo žiadny cytotoxický účinok na bunky B16F0.

Inhibícia biosyntézy melanínu pomocou K36E v bunkách B16F{2}}

Obrázok 2a ukazuje účinky K36E na biosyntézu melanínu po stimulácii 0,5 μM -MSH v bunkách B16F0. Vnútrobunkový obsah melanínu sa po liečbe -MSH zvýšil na 124,6 percent ± 13.{{10}} percent. K36E v dávkach vyšších ako 1,0 μM významne znížil obsah melanínu, ktorý sa znížil na 97,5 percenta ± 1,9 percenta, 96,6 percenta ± 3,3 percenta, 94,4 percenta ± 2,8 percenta a 90,8 percenta ± 1,4 percenta (obr. 2a). Účinok K36E na biosyntézu melanínu bol podobný ako účinok 1 mM arbutínu.

Inhibícia aktivity tyrozinázy pomocou K36E v bunkách B16F0

K36E významne inhiboval aktivitu tyrozinázy v B16F0 bunkách po ošetrení počas 48 hodín (obr. 2b). Úrovne aktivity tyrozinázy boli 83,2 percent ± 2,1 percenta , 76,3 percenta ± 2,9 percenta , 72.0 percent ± 5.0 percent a 67,2 percenta ± 4,4 percenta po liečbe 1, 1,5, 2 a 2,5 uM K36E počas 48 hodín. Výsledky ukázali, že K36E inhiboval obsah melanínu v bunkách B16F0 prostredníctvom inhibície aktivity tyrozinázy.

Účinky K36E na proteíny súvisiace s melanogenézou

K36E znížila expresiu tyrozinázy a TRP-1

Aby sa zistilo, či inhibícia melanogenézy pomocou K36E súvisela s hladinami expresie proteínov súvisiacich s melanogenézou, vrátane tyrozinázy a TRP-1, bunky B16F{4}} sa inkubovali s -MSH (0. 5 μM) a rôzne koncentrácie K36E (1–2,5 μM) počas 48 hodín. Aj keď expresia tyrozinázy vykazovala 2,{14}}násobné zvýšenie v porovnaní s kontrolnou skupinou po liečbe s -MSH, K36E významne potláčal expresiu tyrozinázy spôsobom závislým od dávky (obr. 3). Okrem toho K36E významne redukoval expresiu TRP-1 stimulovanú -MSH pri dávkach vyšších ako 1,5 μM (obr. 3).

K36E znížila expresiu MITF

Expresia MITF v B16F0 bunkách vykazovala 1,{3}}násobné zvýšenie v porovnaní s kontrolou po ošetrení s -MSH (obr. 4). K36E liečený počas 4 hodín v závislosti od dávky inhiboval expresiu MITF a významne znížil expresiu MITF v bunkách B16F{10}} v koncentrácii 1 uM (obr. 4).

K36E znížila expresiu p-CREB

Expresia p-CREB v B16F0 bunkách vykazovala 1,{4}}násobné zvýšenie v porovnaní s kontrolou po liečbe -MSH (obr. 5). K36E významne inhiboval expresiu p-CREB v koncentráciách vyšších ako 1, 5 μM a následne znížil expresiu MITF v bunkách B16F{12}}.

Účinky K36E na signálnu dráhu melanogenézy

K36E-inhibovaná melanogenéza bola spojená s reguláciou PKA

Aby sa určilo, či melanogenéza inhibovaná K36E bola spojená s PKA, bunky B16F0 sa inkubovali s 10 μM H-89, inhibítorom PKA [30] a 2,5 μM K36E počas 48 hodín . Liečba K36E a H-89 oddelene spôsobila 1.{14}} a 1{16}}násobný pokles expresie tyrozinázy indukovanej -MSH v porovnaní s kontrolou (obr. 6 ). Okrem toho spoločná liečba s K36E a H-89 spôsobuje 0,{23}}-násobný pokles expresie tyrozinázy v porovnaní s kontrolou. Okrem toho expresia tyrozinázy po spoločnej liečbe bola významne nižšia ako po liečbe K36E alebo H-89 samostatne. Výsledky ukázali, že dráha PKA sa môže podieľať na antimelanogénnom účinku K36E.

K36E inhiboval melanogenézu zvýšením expresie p-AKT a p-GSK3

Ako je znázornené na obr. 7, ošetrenie 2,5 uM K36E počas 1 hodiny výrazne zvýšilo expresiu p-AKT a p-GSK3. Hladina p-AKT dosiahla maximum (1.{10}}násobné zvýšenie v porovnaní s kontrolou) po 1 hodine a 1.{13}}násobné zvýšenie po 2 hodinách; hladina p-GSK3 tiež vykazovala 1.2-násobné zvýšenie po 1 hodine v porovnaní s kontrolou, čo naznačuje, že K36E potláčal melanogenézu v bunkách B16F0 aktiváciou signálnych dráh AKT a GSK3, čo viedlo k inhibícii MITF expresia a transkripčná aktivita, a teda inhibícia expresie génu tyrozinázy.

Diskusia

Tyrozináza a jej aktivita zohrávajú hlavnú úlohu pri kontrole melanogenézy [31–33]. Činidlá alebo produkty, ktoré inhibujú aktivitu tyrozinázy, sa používajú v kozmetike na bielenie pokožky a kozmeceutikách [1, 2, 34]. Kvercetín a kyselina vanilová inhibovali -MSH indukoval expresiu MITF, tyrozinázy, TRP-1 a TRP-2, čo spôsobilo inhibíciu melanogenézy [35, 36]. Deriváty resveratrolu inhibovali syntézu melanínu prostredníctvom inhibície expresie melanogénnych enzýmov, ako sú tyrozináza a TRP-1 [37]. Naše výsledky ukázali, že K36E inhiboval aktivitu tyrozinázy a expresiu proteínu indukovanú -MSH, čím potláčal biosyntézu melanínu. Okrem toho K36E inhiboval proteíny súvisiace s melanogenézou, ako je TRP-1. TRP-1 sa považuje za dôležitú úlohu ako štrukturálny proteín aj ako katalytický enzým v eumelanickej dráhe melanozómov [38, 39]. Výsledky uvedené vyššie naznačujú, že zníženie melanogenézy K36E by sa mohlo dosiahnuť prostredníctvom jeho inhibície signálnej dráhy, ktorá reguluje expresiu a aktivitu tyrozinázy.

MITF je najdôležitejším transkripčným faktorom, ktorý reguluje melanogenézu indukciou expresie melanogénnych génov [5, 40]. Aktivácia MITF zvyšuje expresiu tyrozinázy a TRP-1 a následne zvyšuje syntézu melanínu. V tejto štúdii K36E potlačil melanogenézu inhibíciou expresie MITF indukovanej -MSH. Dráha cAMP hrá kľúčovú úlohu v melanogenéze indukovanej -MSH.

V predchádzajúcej štúdii látky zvyšujúce cAMP inhibovali PI3K/AKT. GSK3 môže stimulovať väzbu MITF na jeho cieľovú sekvenciu, aby sa stimulovala expresia melanogénnych enzýmov a uľahčila sa produkcia melanínu [41]. cAMP inhibuje fosforyláciu a aktivitu PI3K a AKT a znižuje fosforyláciu GSK3, aby stimuloval jej aktivitu. Aktivácia cAMP signálnej transdukcie vedie k naviazaniu MITF na promótor tyrozinázy, čo vedie k stimulácii melanogenézy [41, 42]. Aktivácia dráhy AKT potlačila syntézu melanínu znížením melanogénnych enzýmov [41]. Uvádza sa, že Cordycepín inhibuje biosyntézu melanínu indukovanú MSH a IBMX inhibíciou enzýmov súvisiacich so syntézou melanínu, ako je tyrozináza, TRP-1 a TRP{13}}, potláčaním aktivity CREB a MITF a aktiváciou PI3K /AKT dráha v bunkách melanómu B16F10 [43]. V našich výsledkoch K36E inhiboval fosforyláciu CREB. K36E zvýšil expresiu p-AKT a p-GSK3, možno redukoval transkripciu MITF na potlačenie expresie génu tyrozinázy. Predchádzajúce štúdie uvádzali, že aktivácia AKT inhibovala melanogenézu v melanocytoch [33, 44]. K36E teda inhiboval -MSH indukovanú hyperpigmentáciu spôsobenú aktiváciou AKT a GSK3 a následne znížil produkciu MITF, CREB, tyrozinázy a TRP-1 (obr. 8).

Vystavenie UV žiareniu stimuluje sekréciu -MSH v keratinocytoch. -MSH sa viaže na MC1R v melanocytoch, čo vedie k produkcii cAMP a aktivácii PKA [10]. Prenos signálu súvisiaci s dráhou cAMP, vrátane aktivácie transkripčných faktorov PKA a CREB, vedie k upregulácii MITF [45]. PKA následne fosforyluje CREB, aby sa aktivovala expresia génu MITF [46, 47]. Hydroxamát kyseliny nikotínovej inhiboval syntézu melanínu prostredníctvom aktivácie signálnych dráh MEK/ERK a AKT/GSK3 v bunkách melanómu B16F10 [48]. Sušený prášok z granátového jablka má bieliace účinky tým, že účinne znižuje aktivitu tyrozinázy a produkciu melanínu v bunkách B16F10 prostredníctvom inaktivácie signálnych dráh p38 a PKA/CREB v bunkách B16F10 [49]. cAMP-indukovaná PI3K inhibícia znižuje AKT fosforyláciu a jej aktiváciu. V tejto štúdii bola expresia MITF indukovaná -MSH inhibovaná K36E a H-89, čo je inhibítor PKA. Okrem toho spoločná liečba s K36E a H-89 významne zoslabila K36E-indukovanú redukciu syntézy melanínu. Naše výsledky naznačujú, že antimelanogénna aktivita K36E je spojená s dráhou PKA, a teda vedie k downregulácii MITF (obr. 8).

Záver

K36E znížil expresiu MITF inhibíciou fosforylácie CREB. Okrem toho K36E inhiboval expresiu MITF zvýšením regulácie fosforylácie AKT a GSK3, čo následne inhibovalo expresiu tyrozinázy a TRP-1, a tým znížilo biosyntézu melanínu. Normálne melanocyty a štúdie in vivo sa môžu použiť na ďalšie skúmanie účinku K36E na melanogenézu. Záverom možno povedať, že K36E môže byť kandidátom na reguláciu melanogenézy a je pravdepodobné, že v budúcnosti bude mať rôzne aplikácie v produktoch na bielenie pokožky.

Poďakovanie

Tento výskum bol podporený grantmi Ministerstva vedy a techniky (NSC100-2320-B-039-002-MY3; MOST104-2320-B-039-006), CMU v rámci plánu Aim for Top University Plan Centra excelentnosti klinického skúšania a výskumu ministerstva školstva Taiwanu a Ministerstva zdravotníctva a sociálnej starostlivosti Taiwanu (MOHW105-TDU-B-212-133019) a Čínskej lekárskej univerzity (CMU102- ÁZIA-18).

Dostupnosť údajov a materiálov

Súbory údajov podporujúce závery tohto článku sú súčasťou článku.

Príspevky autorov

YHK, CYL a HMC boli zodpovedné za návrh štúdie a za poskytnutie financovania výskumu. PYW, CSW a PJS navrhli experimenty a poskytli technické pokyny. CCC a HMC vykonali experimentálnu operáciu. YHK, YHK, CYL a HMC napísali papier. Všetci autori prečítali a schválili konečný rukopis.

Konkurenčné záujmy

Autori vyhlasujú, že nemajú žiadne konkurenčné záujmy.

Súhlas so zverejnením

Nepoužiteľné.

Etický súhlas a súhlas s účasťou

V tejto štúdii sa použili komerčne dostupné bunkové línie; teda nebolo potrebné etické schválenie.

Podrobnosti o autorovi

1Department of Chinese Pharmaceutical Sciences and Chinese Medicine Resources, China Medical University, Taichung 404, Taiwan. 2 Katedra biotechnológie, Ázijská univerzita, Taichung 413, Taiwan. 3 Department of Cosmeceutics, China Medical University, Taichung 404, Taiwan. 4 Dermatologické oddelenie, China Medical University Hospital, Taichung 404, Taiwan. 5 Lekárska fakulta, Čínska lekárska univerzita, Taichung 404, Taiwan. 6 Národné múzeum morskej biológie a akvária, Pingtung 944, Taiwan.

Referencie

1. Solano F, Briganti S, Picardo M, Ghanem G. Hypopigmentačné činidlá: aktualizovaný prehľad o biologických, chemických a klinických aspektoch. Pigment Cell Res. 2006;19(6):550–71.

2. Chiang HM, Chen HW, Huang YH, Chan SY, Chen CC, Wu WC, Wen KC. Melanogenéza a prirodzené hypopigmentačné činidlá. 2012.

3. Costin GE, Hearing VJ. Pigmentácia ľudskej kože: melanocyty upravujú farbu pokožky v reakcii na stres. FASEB J. 2007;21(4):976–94.

4. Kondo T, Sluch VJ. Aktualizácia o regulácii funkcie melanocytov a pigmentácie kože u cicavcov. Expert Rev Dermatol. 2011;6(1):97–108.

5. Yamaguchi Y, Hearing VJ. Fyziologické faktory, ktoré regulujú pigmentáciu kože. Biofaktory. 2009;35(2):193–9.

6. Vypočutie VJ. Míľniky v melanocytoch/melanogenéze. J Invest Dermatol. 2011;131(E1):E1.

7. Chiang HM, Chien YC, Wu CH, Kuo YH, Wu WC, Pan YY, Su YH, Wen KC. Hydroalkoholový extrakt z Rhodiola rosea L. (Crassulaceae) a jeho hydrolyzát inhibujú melanogenézu v B16F0 bunkách reguláciou CREB/MITF/tyrozinázovej dráhy. Food Chem Toxicol. 2014;65:129–39.

8. Wen KC, Chang CS, Chien YC, Wang HW, Wu WC, Wu CS, Chiang HM. Tyrozol a jeho analógy inhibujú melanogenézu indukovanú hormónom stimulujúcim alfa-melanocyty. Int J Mol Sci. 2013;14(12):23420–40.

9. Cui R, Widlund HR, Feige E, Lin JY, Wilensky DL, Igras VE, D'Orazio J, Fung CY, Schanbacher CF, Granter SR a kol. Centrálna úloha p53 v reakcii na opaľovanie a patologickej hyperpigmentácii. Bunka. 2007;128(5):853–64.

10. Hocker TL, Singh MK, Tsao H. Genetika melanómu a terapeutické prístupy v 21. storočí: presun z pláže na posteľ. J Invest Dermatol. 2008;128(11):2575–95.

11. Drira R, Sakamoto K. Isosakuranetin, 4'-O-metylovaný flavonoid, stimuluje melanogenézu v bunkách myšacieho melanómu B16BL6. Life Sci. 2015;143:43–9.

12. Chou TH, Ding HY, Lin RJ, Liang JY, Liang CH. Inhibícia melanogenézy a oxidácie kyselinou protokatechovou z Origanum vulgare (oregano). J Nat Prod. 2010;73(11):1767–74.

13. Yeom GG, Min S, Kim SY. 2,3,5,6-Tetrametylpyrazín z Ephedra sinica reguluje melanogenézu a zápal v systéme kokultivácie melanómu/keratinocytov indukovaného UVA žiarením. Int Immunopharmacol. 2014;18(2):262–9.

14. Chiang HM, Chen CW, Lin TY, Kuo YH. N-fenetyl kofeín a fotopoškodenie: Ochrana pokožky inhibíciou degradácie prokolagénu typu I a stimuláciou syntézy kolagénu. Food Chem Toxicol. 2014;72C:154–61.

15. Kuo YH, Chen CW, Chu Y, Lin P, Chiang HM. In vitro a in vivo štúdie o ochrannom pôsobení N-fenetylkafeamidu proti fotopoškodeniu kože. PLoS One. 2015;10(9):e0136777.

16. Shimoda H, Shan SJ, Tanaka J, Maoka T. beta-kryptoxantín potláča melanogenézu indukovanú UVB u myši: zapojenie inhibície prostaglandínu E2 a dráh hormónu stimulujúceho melanocyty. J Pharm Pharmacol. 2012;64(8):1165–76.

17. Okombi S, Rival D, Bonnet S, Mariotte AM, Perrier E, Boumendjel A. Analógy N-hydroxycinnamoylfenalkylamidov ako inhibítory ľudskej melanocytovej tyrozinázy. Bioorg Med Chem Lett. 2006;16(8):2252–5.

18. Bellei B, Pitisci A, Izzo E, Picardo M. Inhibícia melanogenézy triedou zlúčenín pyridinylimidazolu: možné zapojenie signálnej dráhy Wnt/beta-katenínu. PLoS One. 2012;7(3):e33021.

19. Wang L, Lu AP, Yu ZL, Wong RN, Bian ZX, Kwok HH, Yue PY, Zhou LM, Chen H, Xu M a kol. Inhibičný účinok na melanogenézu a perkutánna formulácia ginsenosidu Rb1. AAPS PharmSciTech. 2014;15(5):1252–62.

20. Suwannalert P, Kariya R, Suzu I, Okada S. Účinky Salacia reticulata na anticelulárne oxidanty a inhibíciu melanogenézy v bunkách melanómu B16 stimulovaných alfa-MSH a ožiarených UV žiarením. Nat Prod Commun. 2014;9(4):551–4.

21. Chou YC, Sheu JR, Chung CL, Chen CY, Lin FL, Hsu MJ, Kuo YH, Hsiao G. Nukleárne cielená inhibícia NF-kappaB na produkciu MMP-9 pomocou N-2- ( 4-brómfenyl)etylkofeín v ľudských monocytových bunkách. Chem Biol Interact. 2010;184(3):403–12.

22. Chiang HM, Lin JW, Hsiao PL, Tsai SY, Wen KC. Hydrolyzáty citrusových rastlín stimulujú melanogenézu a chránia tak pred poškodením kože spôsobeným UV žiarením. Phytother Res. 2011;25(4):569–76.

23. Chiang HM, Ko Y, Shih I, Wen K. Vývoj vínneho koláča ako činidla na bielenie kože a zvlhčovadla. J Food Drug Anal. 2011;19(2):223–9.

24. Chiang HM, Chen HC, Lin TJ, Shih IC, Wen KC. Extrakt Michelia alba zoslabuje UVB-indukovanú expresiu matrixových metaloproteináz prostredníctvom MAP kinázovej dráhy v ľudských dermálnych fibroblastoch. Food Chem Toxicol. 2012;50(12):4260–9.

25. Salucci S, Burattini S, Battistelli M, Buontempo F, Canonico B, Martelli AM, Papa S, Falcieri E. Tyrosol zabraňuje apoptóze v ožiarených keratinocytoch. J Dermatol Sci. 2015;80(1):61–8.

26. Zhang Y, Helke KL, Coelho SG, Valencia JC, Hearing VJ, Sun S, Liu B, Li Z. Základná úloha molekulárneho chaperónu gp96 pri regulácii melanogenézy. Pigment Cell Melanoma Res. 2014;27(1):82–9.

27. Park H, Song KH, Jung PM, Kim JE, Ro H, Kim MY, Ma JY. Inhibičný účinok apigenínu z extraktu Fructus Arctii na syntézu melanínu prostredníctvom potlačenia expresie tyrozinázy. Evid Based Complement Alternat Med: eCAM. 2013; 2013:965312.

28. Chiang HM, Lin TJ, Chiu CY, Chang CW, Hsu KC, Fan PC, Wen KC. Extrakt z Coffea arabica a jeho zložky zabraňujú fotostarnutiu tým, že potláčajú expresiu MMP a dráhu MAP kinázy. Food Chem Toxicol. 2011;49(1):309–18.

29. Chiang HM, Chiu HH, Liao ST, Chen YT, Chang HC, Wen KC. Výťažok z Flemingia macrophylla bohatý na izoflavonoidy zmierňuje poškodenie kože spôsobené UVB žiarením tým, že odstraňuje druhy reaktívneho kyslíka a inhibuje expresiu MAP kinázy a MMP. Evid Based Complement Alternat Med. 2013;2013:12.

30. Bertolotto C, Bille K, Ortonne JP, Ballotti R. Regulácia expresie génu tyrozinázy cAMP v bunkách melanómu B16 zahŕňa dva motívy CATGTG obklopujúce TATA box: implikácia génového produktu mikroftalmie. J Cell Biol. 1996;134(3):747–55.

31. Korner A, Pawelek J. Cicavčia tyrozináza katalyzuje tri reakcie v biosyntéze melanínu. Veda (New York, NY). 1982;217(4565):1163–5.

32. Tripathi RK, Hearing VJ, Urabe K, Aroca P, Spritz RA. Mutačné mapovanie katalytických aktivít ľudskej tyrozinázy. J Biol Chem. 1992;267(33):23707–12.

33. Slominski A, Tobin DJ, Shibahara S, Wortsman J. Pigmentácia melanínu v koži cicavcov a jej hormonálna regulácia. Physiol Rev. 2004;84(4):1155–228.

34. Fu YT, Lee CW, Ko HH, Yen FL. Extrakty Artocarpus communis znižujú melanogenézu indukovanú hormónom stimulujúcim alfa-melanocyty prostredníctvom aktivácie signálnych dráh ERK a JNK. ScientificWorldJournal. 2014; 2014:724314.

35. Chou TH, Ding HY, Hung WJ, Liang CH. Antioxidačné vlastnosti a inhibícia melanogenézy vanilínu a kyseliny vanilovej z Origanum vulgare stimulovanej hormónom stimulujúcim alfa-melanocyty. Exp Dermatol. 2010;19(8):742–50.

36. Kumar KJ, Yang JC, Chu FH, Chang ST, Wang SY. Lucidon, nový inhibítor melanínu z ovocia Lindera erytroderma Makino. Phytother Res. 2010; 24(8):1158-65.

37. Liu Q, Kim C, Jo YH, Kim SB, Hwang BY, Lee MK. Syntéza a biologické hodnotenie derivátov resveratrolu ako inhibítorov melanogenézy. Molekuly (Bazilej, Švajčiarsko). 2015;20(9):16933–45.

38. Jimenez-Cervantes C, Solano F, Kobayashi T, Urabe K, Hearing VJ, Lozano JA, Garcia-Borron JC. Nová enzymatická funkcia v melanogénnej dráhe. Aktivita oxidázy 5,6-dihydroxyindol-2-karboxylovej kyseliny proteínu súvisiaceho s tyrozinázou-1 (TRP1). J Biol Chem. 1994;269(27):17993–8000.

39. Kobayashi T, Urabe K, Winder A, Jimenez-Cervantes C, Imokawa G, Brewington T, Solano F, Garcia-Borron JC, Hearing VJ. Proteín 1 súvisiaci s tyrozinázou (TRP1) funguje ako DHICA oxidáza pri biosyntéze melanínu. EMBO J. 1994;13(24):5818–25.

40. Gaggioli C, Busca R, Abbe P, Ortonne JP, Ballotti R. Transkripčný faktor spojený s mikroftalmiou (MITF) je potrebný, ale nestačí na vyvolanie expresie melanogénnych génov. Pigment Cell Res. 2003;16(4):374–82.

41. Khaled M, Larribere L, Bille K, Aberdam E, Ortonne JP, Ballotti R, Bertolotto C. Glykogénsyntáza kináza 3beta je aktivovaná cAMP a hrá aktívnu úlohu v regulácii melanogenézy. J Biol Chem. 2002;277(37):33690–7.

42. Khaled M, Larribere L, Bille K, Ortonne JP, Ballotti R, Bertolotto C. Transkripčný faktor spojený s mikroftalmiou je cieľom fosfatidylinozitol-3-kinázovej dráhy. J Invest Dermatol. 2003;121(4):831–6.

43. Shao YY, Chen CC, Wang HY, Chiu HL, Hseu TH, Kuo YH. Chemické zložky gáforátu Antrodia ponorené do celého vývaru. Nat Prod Res. 2008;22(13):1151–7.

44. Oka M, Nagai H, Ando H, Fukunaga M, Matsumura M, Araki K, Ogawa W, Miki T, Sakaue M, Tsukamoto K a kol. Regulácia melanogenézy prostredníctvom fosfatidylinozitolovej 3-kinázy-Akt v bunkách ľudského melanómu G361. J Invest Dermatol. 2000;115(4):699–703.

45. Busca R, Ballotti R. Cyklický AMP kľúčový posol v regulácii pigmentácie kože. Pigment Cell Res. 2000;13(2):60–9.

46. ​​Shibahara S, Takeda K, Yasumoto K, Udono T, Watanabe K, Saito H, Takahashi K. Transkripčný faktor spojený s mikroftalmiou (MITF): multiplicita v štruktúre, funkcii a regulácii. J Invest Dermatol Symp Proc/Soc Invest Dermatol, Inc [a] Eur Soc Dermatol Res. 2001;6(1):99–104.

47. Lee JY, Choi HJ, Chung TW, Kim CH, Jeong HS, Ha KT. Fenetylester kyseliny kávovej inhibuje syntézu melanínu indukovanú hormónmi alfa-melanocytmi prostredníctvom potlačenia transaktivačnej aktivity transkripčného faktora spojeného s mikroftalmiou. J Nat Prod. 2013;76(8):1399–405.

48. Huang GJ, Huang SS, Lin SS, Shao YY, Chen CC, Hou WC, Kuo YH. Analgetické účinky a mechanizmy protizápalu ergostatién-3beta-olu z Antrodia camphorate ponoreného celého bujónu u myší. J Agric Food Chem. 2010;58(12):7445–52.

49. Tsai TC, Tung YT, Kuo YH, Liao JW, Tsai HC, Chong KY, Chen HL, Chen CM. Protizápalové účinky Antrodia camphorate, rastlinného lieku, v modeli ischémie kože u myší. J Ethnopharmacol. 2015;159:113–21.

For more information:1950477648nn@gmail.com