Nano mliečne proteínovo-slizové komplexy: Charakterizácia a protirakovinový účinok, časť 1

Pre viac informácií kontaktujtetina.xiang@wecistanche.com

Abstraktné: Theprotirakovinovéaktivita prírodných zlúčenín nedávno pritiahla multidisciplinárny výskum. V tejto štúdii sa skúmala komplexácia mliečnych proteínov (MP) s isabgolovým slizom (IHM) a slizom Ziziphus Spina Christi (NabM). V tejto súvislosti sa merali fyzikálno-chemické vlastnosti slizových komplexov mliečnych proteínov (MPMC) vrátane pH, Carrovho indexu, rozpustnosti vo vode a indexov absorpcie vody a študovalo sa tokové správanie. Okrem toho, profil aminokyselín, stráviteľnosť bielkovín a fenolické aflavonoidyobsah MPMC sa skúmal a mikroštruktúra komplexov sa vizualizovala pomocou transmisnej elektrónovej mikroskopie. Theantioxidanta protirakovinové potencie MPMC proti dvom rakovinovým bunkovým líniám, ľudskej rakovine pečene HEPG-2 a rakovine prsníka MCF-7, v porovnaní s dvoma normálnymi bunkovými líniami, konkrétne Bj-1 a MCF{{ 3}}F, boli testované použitím testu absorpcie neutrálnej červenej. Výsledky odhalili, že MPMC má vychytávaciu aktivitu proti radikálom DPPH, ABTS a HS. Okrem toho má MPMC potenciál zabrániť poškodeniu DNA vyvolanému oxidačným stresom v reakcii typu Fenton. Výsledky testu s neutrálnou červenou farbou ukázali významnú inhibíciu rastu HEPG-2, aj MCF-7, zatiaľ čo proti Bj-1 a MCF-12F sa nezistil žiadny významný cytotoxický účinok. Výsledky RT-qPCR indikovali apoptózu stimulovanú MPMC, ako sa ukázalo prostredníctvom zvýšenej regulácie proapoptózových génových markerov Caspase{11}}, p53, Bax. Medzitým bol anti-apoptózny Bcl-2 gén znížený. Nebol však pozorovaný žiadny významný rozdiel v normálnych bunkových líniách liečených MPMC. Na záver možno povedať, že MPMC možno považovať za sľubnú protirakovinovú entitu, ktorú možno použiť pri vývoji nových protirakovinových terapeutík s porovnateľnou aktivitou a minimálnymi vedľajšími účinkami v porovnaní s konvenčnými chemoterapiami rakoviny. .

Kľúčové slová: mliečne bielkoviny; sliz zo šupiek isabgolu; Nabeq sliz; mliečne proteíny, slizové komplexy; protirakovinová aktivita

Kliknutím sa dozviete viac o produktoch

1. Úvod

Rakovinaje hlavnou príčinou úmrtnosti na celom svete s približne 10 miliónmi úmrtí v roku 2020 [1]. Včasná diagnostika a vývoj nových terapeutík je jedinou nádejou na porazenie rakoviny. Bežná liečba rakoviny, ako je chemoterapia a ožarovanie, je pomerne drahá a sprevádzaná významnými vedľajšími účinkami.

Preto vedecký a výskumný záujem smeruje k využívaniu prírodných zlúčenín (tj proteínov, polysacharidov a polyfenolov) z ich zdrojov, ktoré majú antikarcinogénny potenciál, keďže sa považujú za menej toxické vedľajšie účinky v porovnaní s konvenčnou liečbou.

Polysacharidyz rastlinných zdrojov sa v poslednej dobe venuje čoraz väčšej pozornosti vďaka svojim bioaktívnym vlastnostiam [2,3]. Množstvo štúdií sa zaujímalo o izoláciu bioaktívnych polysacharidov a polyfenolov z prírodných rastlinných zdrojov, ako je ovocie, zelenina, obilniny a bylinky, kvôli ich priaznivým farmakologickým účinkom [4].

Plantago ovata (Psyllium alebo Isabgol) a Ziziphus Spina-Christi (Nabeg alebo Sidr) sú známymi zdrojmi bioaktívnych polysacharidov. IHM a NabM boli vybrané ako sľubné bioaktívne materiály. Predchádzajúce štúdie ukázali, že komplexy IHM a NabM s mliečnymi proteínmi zlepšili funkciu pečene a znížili riziko kardiovaskulárnych ochorení[5]. Šupka isabgolu sa ukázala ako účinná pri liečbe hnačky, zápchy, ulceróznej kolitídy, syndrómu dráždivého čreva, hypercholesterolémie a cukrovky. Okrem toho, protirakovinový účinok šupky isabgolu proti kolorektálnemu karcinómu sa pripisuje obsahu vlákniny, ktorá znižuje jeho účinky skrátením doby prechodu. To povedie k zníženiu metabolizmu žlče črevnou mikroflórou, zriedeniu žlčových kyselín zväčšovaním objemu stolice, zmene metabolizmu mikrobiálnych žlčových kyselín v dôsledku fermentácie vlákniny, zníženiu pH a produkcii mastných kyselín s krátkym reťazcom alebo priamou väzbou na žlčových kyselín a tým bráni ich metabolizmu [6]. Hlavnými biologicky aktívnymi zložkami Ziziphus Spina-Christi sú vitamín C, fenoly, flavonoidy a triterpénové kyseliny. Jeho bioaktivity zahŕňajú protirakovinové, antibakteriálne, antidiabetické, antiproliferatívne a antioxidačné aktivity [7. Šupky isabgolu a plody Nabeq sa používajú na výrobu slizu šupiek isabgolu (IHM) a slizu Nabeq (NabM) [5].

Na druhej strane, liečba rakoviny na báze proteínov získala čoraz väčší záujem kvôli kľúčovým vlastnostiam, ako je nízka cytotoxicita, silná špecifickosť a ľahká modifikácia [8]. Okrem zabezpečenia nutričných potrieb esenciálnych aminokyselín patria mliečne bielkoviny medzi biologické makromolekuly, ktoré majú mnoho funkčných vlastností, ako sú antioxidačné, imunomodulačné, antidiabetické, antimikrobiálne a protirakovinové vlastnosti [9,10]. Napríklad protirakovinová aktivita peptidov získaných z mlieka (tj -kazomorfínov izolovaných z -kazeínu a 1-kazeínových fragmentov 90-95 a 90-96[Arg{10}}Tyr-Leu -Gly-Tyr-Leu95-(Glu96)]) identifikované v kravskom mlieku podporujú predpoklad, že mliečne bielkoviny majú nielen nutričnú hodnotu, ale majú aj potenciál na prevenciu a liečbu rakoviny [11,12]

Komplex medzi mliečnymi proteínmi a polysacharidmi, ako je komplex mliečnych proteínov a chitosanu, bol predtým vyrobený ako pokus o zlepšenie funkčných vlastností ich prirodzených zložiek [13]. Vďaka dostupnosti a jednoduchosti prípravy majú takéto komplexy potenciál na použitie pri vývoji lacnejších protirakovinových terapií. Takéto terapeutiká budú lacnejšie a budú vykazovať porovnateľnú aktivitu ako v súčasnosti používané chemoterapeutiká.

Nekovalentná väzba prostredníctvom hydrofóbnych a elektrostatických interakcií je primárnymi faktormi asociácie mliečnych bielkovín spolysacharidy[14]. Okrem toho proteíny vykazujú prekvapivú odolnosť voči interakcii s inými zložkami v rozsahu pH od 2 do 11. Pri špecifickom pH sa povrchová reaktivita proteínu zvyšuje prostredníctvom rozvinutia proteínovej štruktúry [15].

V tejto súvislosti sa naša skupina nedávno zamerala na funkčnú úlohu komplexov mliečnych bielkovín na ľudské zdravie. Komplexy mliečnych bielkovín s IHM alebo NabM však vykazovali antihyperlipidemické a pečeňové ochranné vlastnosti [9]. Na základe predchádzajúcich štúdií sa teda predpokladalo, že komplexy mliečnych proteínov a polysacharidov môžu mať zaujímavú protirakovinovú aktivitu. Okrem toho žiadne publikácie neuskutočnili štúdiu protirakovinovej aktivity komplexov mliečnych proteínov s IHM a NabM. Hlavným cieľom tejto štúdie bolo preto charakterizovať fyzikálno-chemické vlastnosti novo vyrobených slizových komplexov mliečnych bielkovín vrátane profilu aminokyselín a funkčných vlastností týchto komplexov. Okrem toho sa skúmala protirakovinová aktivita komplexov mliečnych bielkovín s IHM a NabM slizom proti dvom ľudským rakovinovým bunkám (MCF7 a HEPG2) v porovnaní s nerakovinovými bunkovými líniami (Bi-1 a MCF{7}}F ). Posvietili sme si aj na mechanizmus účinku produkovaných slizových komplexov mliečnych bielkovín.

2. Výsledky a diskusia

2.1. Infračervená spektroskopia s Fourierovou transformáciou (FTIR).

Infračervené spektrá IHM, MP a MP/IHM sú znázornené na obrázku 1A. Spektrum IHM ukázalo charakteristický pás arabinoxylánov pri 100-1200 cm-1 a pásy pre skupiny amidu I a amidu II pri 1550 a 1650 cm-1. MP spektrum ukazuje pásy pri 1700-1600 a 1200-900 cm-I zodpovedajúce amidu I (hlavne C=O napínanie bielkovín) a mliečnym sacharidom [16]. Vyššie uvedené píky IHM a MP boli vyhradené v spektre komplexu IHM/MP. Podobne sa charakteristické pásy kyseliny galakturónovej v NabM zachovali v spektre komplexu NabM/MP (obrázok 1B). To by naznačovalo absenciu chemickej interakcie medzi polysacharidovým slizom a MP a tak by potvrdilo navrhovaný mechanizmus elektrostatickej príťažlivosti medzi MP a polysacharidmi (IHM a NabM). Takéto pozorovania sú v súlade s pozorovaniami Vukica a kol., ktorí uviedli tvorbu komplexu medzi proteínmi srvátkového mlieka a pektínom prostredníctvom elektrostatických a hydrofóbnych interakcií, čo viedlo k dobrej konzistencii komplexu [17].

2.2. Fyzikálno-chemické a funkčné vlastnosti MP a MPMC

Hodnoty sypnej hmotnosti (BD), hustoty po strasení (TD), Carrovho indexu a meraní pH sú uvedené v tabuľke 1. BD a TD MP boli vyššie ako IHM a IHM mali najnižšiu objemovú a postrekovú hustotu z testovaných vzoriek. . Podobne komplex MP/IHM mal významne (s<0.05) lower="" bulk="" and="" tapped="" density="" compared="" to="" mp/nabm.="" the="" obtained="" results="" indicated="" that="" the="" distribution="" and="" solubility="" of="" mp="" have="" been="" improved="" by="" complexation="" with="" the="" ihm.="" carr's="" index="" is="" frequently="" used="" as="" an="" indication="" of="" the="" flowability="" of="" powders.="" the="" results="" in="" table="" 1="" show="" that="" carr's="" index="" of="" mpmc="" was="" significantly="" lower="" than="" ihm="" which="" indicated="" that="" nabm="" improved="" the="" flowability="" of="" mp.="" this="" was="" probably="" due="" to="" the="" lower="" carr's="" index="" value="" of="" mp(30.6±="" 0.10%)="" compared="" to="" ihm="" and="" nabm="" (57.58±0.14="" and="" 53.97±0.11%,="" respectively)which="" are="" vicious.ihm="" is="" alkaline="" (7.79="" ph)="" while="" mp="" and="" the="" complexes="" with="" polysaccharide="" mucilage="" were="" slightly="" acidic="" which="" came="" in="" accordance="" with="" previously="" reported="" results="">

WSI a WAI sú dôležité funkčné vlastnosti v potravinárskej technológii. Tabuľka 1 ukazuje, že WSI a WAI MP sa významne zvýšili po komplexácii s IHM a NabM. Bolo to najpravdepodobnejšie preto, že materiály na báze Isabgolu sú vysoko rozpustné vo vode so zahusťovacím účinkom po pridaní adekvátneho množstva vody [19]. Okrem toho Qaisrani a kol. uviedli, že arabinoxylány zo šupiek Isabgolu majú schopnosť zadržiavať vodu až desaťnásobne vyššiu ako ich suchá hmotnosť [20]. Okrem toho má MP/IHM vyššie WSI a WAI ako MP/NabM, pretože IHM má vyššie WSI a WAI ako NabM. Okrem toho zvýšenie percenta WSI pre MPMC v porovnaní s MP viedlo k zvýšeniu disperzibility cieľových aktívnych zložiek pri ich použití v terapeutických otázkach [21]. To bolo jasné z protirakovinových výsledkov, ktoré ukázali, že tieto komplexy majú cytotoxický účinok ako MP.

2.3. Bioaktívne zložky

2.3.1. Fenolové zlúčeniny PHM a NabM

Jedlo obsahuje veľmi dôležité bioaktívne zlúčeniny (napr. fenolové a flavonoidy), ktoré pôsobia ako antioxidačné a protirakovinové účinky. HPLC analýza potvrdila a kvantifikovala prítomnosť mnohých fenolických zlúčenín v Nab a IHM, ako je znázornené na obrázku 2. Výsledky ukazujú vysoký obsah rôznych biologicky aktívnych zlúčenín, ako je kyselina galová (177,96 mg/kg), katechol (13,87 mg/kg) Kyselina p-hydroxybenzoová (24,02 mg/kg), katechín (5,93 mg/kg) a rutín (123,70 mg/kg) v extrakte PHM a katechol (410,72 mg/kg) kyselina p-hydroxybenzoová (426,71 mg/kg) chlórgén (72,05 mg/kg) rutín (1750,57 mg/kg) a rozmarínový (1771,72 mg/kg) v NabM (obrázok 2A,B). Obsah týchto zlúčenín je pre zdravie veľmi dôležitý. Protirakovinový účinok fenolových zlúčenín bol opísaný už skôr. Tento účinok sa pripisoval najmä antioxidačnému účinku týchto zlúčenín.

2.3.2. Celková fenolová, flavonoidová a antioxidačná aktivita MP a MPMC

Niekoľko správ naznačilo, že zlúčeniny, ktoré vykazujú antioxidačné vlastnosti, väčšinou vykazujú protirakovinovú aktivitu[22]. Celkový obsah fenolov (TP) a celkových flavonoidov (TF) bol stanovený v NabM, IHM, MP a ich komplexoch (obrázok 3A, B). Výsledky ukázali, že TP a TF boli vyššie v NabM a MP/NabM v porovnaní s IHM a MP/IHM. Obsah TP a TF bol však významne nižší v MP v porovnaní s MPC. Tieto výsledky sa zhodovali s údajmi, ktoré uvádza Singh et al.[23] ktorí zistili, že TP a TF NabM boli 1,6 mg GAE/100 g suchej hmotnosti a 47 mg CE/100 g suchej hmotnosti. Komplexy MP/NabM a MP/IHM vykazovali významný nárast o 309 percent a 59 percent v TP a 476 percent a 123 percent v TF v porovnaní s MP. Konjugácia MP s IHM a NabM viedla k strate 23 percent a 36 percent TPC zodpovedajúcich IHM a NabM. TF sa znížil o 44 percent v IHM a 46 percent v NabM, keď bol komplexovaný s MP. S najväčšou pravdepodobnosťou to bolo spôsobené nízkym TP a TF MP.

Potenciálna aktivita zachytávania radikálov MP/IHM a MP/NabM v porovnaní s MP pri použití DPPH, ABTS a HS je znázornená na obrázku 3C-E. Údaje získané z aktivity troch antioxidantov mali podobný trend naznačujúci, že NabM vykazoval vyššiu antioxidačnú aktivitu ako IHM, a to v kontexte výsledkov fenolických a

obsah flavonoidov. Antioxidačná kapacita MP sa zvýšila po komplexácii s NabM a IHM. S výnimkou testu ABTS sa antioxidačná aktivita NabM zvýšila konjugáciou s MP. Antioxidačná aktivita naznačila, že MPMC mala vyššiu antioxidačnú aktivitu v porovnaní s MP. Naša hypotéza poukazuje na možnú interakciu medzi MP a polysacharidmi, ktorá vedie k získaniu potenciálnej antioxidačnej aktivity, ako je opísané v Li et al. [24]. Už skôr sa uvádzalo, že existuje pozitívna korelácia medzi schopnosťou zachytávať a obsahom fenolov/flavonoidov 5]. Nemôžeme však vylúčiť, že sa vyrábajú nové bioaktívne peptidy obohatené o aminokyseliny obsahujúce síru, čo vysvetľuje vysokú antioxidačnú aktivitu MPMC v porovnaní s nekomplexnými zložkami. Okrem toho sa malé peptidy uvoľňujú v srvátkových frakciách, čo ovplyvňuje vysoké antioxidačné vlastnosti [4]. Nakoniec, obsah fenolov a flavonoidov ovplyvňuje rôzne rakovinové bunky. Okrem toho boli tieto aktivity a mechanizmy pozorované počas in vitro testov na bunkových kultúrach. Antioxidačné a protirakovinové aktivity fenolových látok sa pripisujú dvojitým väzbám a hydroxylovým substitúciám na aromatických kruhoch [25].

2.4. Aminokyselinový profil MP a MPMC

Aminokyselinové profily MP, NabM, MP/IHM a MP/NabMare znázornené na obrázku 4. V aminokyselinových profiloch MP a jeho komplexov s IHM a NabM neboli žiadne významné rozdiely. To naznačuje, že nekovalentná interakcia MP s polysacharidovým slizom nezmenila zloženie mliečnych bielkovín. Výsledky ukazujú vysoký obsah kyseliny glutámovej v MP a MPMC (obrázok 4) [26].

2.5. Reologické vlastnosti MP a MPMC

2.5.1. Zdanlivá viskozita

Obrázok S1 ukazuje viskozitu proteínových vzoriek pri rôznych hodnotách otáčok za minútu. IHM a NabM mali vysokú viskozitu pri pomalej rotácii, ale viskozita výrazne klesala so zvyšujúcou sa rýchlosťou rotácie. Tieto zistenia sa zhodovali s Chenom a Che, ktorí zaznamenali, že zjavná viskozita vo vode rozpustného slizu zeleného umývadla (Monostroma iridium) sa znížila zvýšením šmykovej rýchlosti [27].

Výsledky na obrázku S1 tiež ukazujú, že komplexácia MP s IHM a NabM viedla k významnému zvýšeniu (p menšie alebo rovné 0,05) zdanlivej viskozity MP. To možno pripísať jedinečným vlastnostiam IHM (hydrokoloidný materiál), ktorý má účinok zvyšujúci viskozitu [28].

2.5.2. Prietokové správanie

Tokové správanie (krivky šmykového napätia/šmykovej rýchlosti) mliečnych bielkovín a ich komplexov je znázornené na obrázku S2. So zvýšením šmykovej rýchlosti sa šmykové napätie zvýšilo. Transformáciou údajov o šmykovom napätí a šmykovej rýchlosti do mocninovej rovnice sú hodnoty indexu konzistencie toku (K) a indexu správania toku (n) uvedené v tabuľke S1. IHM a MP/IHM mali najvyšší index konzistencie toku. Môže to byť spôsobené vysokou viskozitou vo vode rozpustného slizu IHM v dôsledku jeho vysokej kapacity na zadržiavanie vody a gélovatenie vo vodnom médiu. Výsledky tiež ukázali, že IHIM, NabM a MP/IHM sa správali pri strihovom stenčovaní (nenewtonské tekutiny) s nízkou hodnotou n v rozsahu od 0,25 do 0,64. Tieto výsledky sú v súlade s Thanatcha a Pranee, ktorí študovali fyzikálno-chemické vlastnosti Ziziphus mauritiana[29]. Na druhej strane, hodnota n MP bola približne 1 (0,99), čo naznačuje newtonovský tok. Podobne hodnota n pre komplex MP/NabM bola 0,95, ako je uvedené v tabuľke S1.

2.6. Diferenciálna skenovacia kalorimetria MP a MPMC

Diferenciálna skenovacia kalorimetria sa použila na skúmanie tepelnej stability MP a jeho komplexov s IHIM a NabM. Termogramy MP a MPMC sú znázornené na obrázku S3 a parametre DSC sú uvedené v tabuľke 2. Pozorovalo sa, že na termograme MP nebol žiadny jasný endotermický pík, ale bol tam výrazný endotermický pík pre MP/IHM a široký endotermický pík pre MP/NabM. Je to pravdepodobne spôsobené postupnou elimináciou voľnej vody, teplotou topenia NabM, pomalou želatináciou a denaturáciou proteínov [30].

Bolo tiež zaznamenané, že MPMC bola tepelne stabilnejšia ako nekomplexovaný proteín, ako bolo pozorované pri nízkej denaturačnej teplote MP (101,44 stupňa) v porovnaní s MP/IHM a MP/NabM (148,24 a 121,4 stupňa, v danom poradí), ako je uvedené v tabuľke 2. Okrem toho bola zaznamenaná teplota degradácie MP 302,3 stupňa, zatiaľ čo nebola pozorovaná žiadna degradácia MPMC so zvýšením teploty až na 35 °C. Tieto zistenia boli v súlade s niekoľkými štúdiami, ktoré zistili, že tepelná stabilita mliečnych bielkovín sa zvýšila interakciou s fenolickými zlúčeninami, ktoré zabránili agregácii bielkovín [2,31].

Teplo, ktoré prechádza do alebo zo systému počas reakcie, je entalpia (AH). Vyššia entalpia MP/IHM a MP/NabM v porovnaní s entalpiou nekomplexovaného MP by mohla byť spôsobená potenciálnou chemickou reakciou medzi mliečnymi bielkovinami (srvátka a kazeín) a medzi mliečnymi bielkovinami a polysacharidmi pri vysokej teplote (Maillardova reakcia)[ 31.

2.7. Transmisná elektrónová mikroskopia (TEM) MP a MPMC

Obrázok 5 ukazuje mikroštruktúru IHM, NabM, MP a MPMC. Zistilo sa, že veľkosť častíc MPMC bola v nanorozsahu (114-250 nm) a bola menšia ako veľkosť častíc MP (191-300 nm). Okrem toho TEM MPMC (obrázok 5D, E) odhalil rozvetvený vzor vytvorených komplexov. To možno pripísať elektrostatickej príťažlivosti medzi mliečnymi proteínmi a polysacharidmi Goh, et al. [32]. Okrem toho väčšia rozvetvená štruktúra MP / IHM v porovnaní s MP / NabM môže byť zodpovedná za jej vyššiu viskozitu, ako je znázornené na obrázku S1.

2.8. Biologické štúdie o MP a MPMC

2.8.1. Protirakovinová aktivita MP a MPMC

Cytotoxický účinok rôznych koncentrácií (1, 5, 10 a 20 ug/ml) MP a MPMC na bunky HepG-2 a MCF-7 v porovnaní s MCF-12F a Bij{ {7}} normálne bunky sú znázornené na obrázkoch 6 a 7. MPMC preukázal protirakovinový účinok na bunky HepG-2 a MCF{11}} Obrázok 6A, respektíve B. Krivka závislosti od dávky vykazovala zníženie životaschopnosti buniek v reakcii na vyššie koncentrácie. Na druhej strane nebol pozorovaný žiadny významný cytotoxický účinok MP a MPMC na normálne bunky Bj-1 a MCF{15}}F (obrázok 6C, D). Naše výsledky tiež ukázali, že MP/NabM mal vyššiu protirakovinovú aktivitu proti rakovinovým bunkovým líniám HepG-2 a MCF{18}} s hodnotami IC50 5,13 a 10,07 ug/ml. Okrem toho MP/IHM vykazoval mierny cytotoxický účinok proti rakovinovým bunkovým líniám v porovnaní s príslušnými kontrolami. Celkovo naše cytotoxické údaje naznačujú, že komplexovanie MP s IHM a NabM významne zvyšuje protirakovinovú aktivitu v porovnaní s nekomplexovanými mliečnymi proteínmi, ako je uvedené v tabuľke 3. Bolo tiež zrejmé, že bunky Hep G-2 boli citlivejšie na MP a MPMC v porovnaní s bunkami MCF{26}}, čo sa prejavuje nižšími hodnotami IC50.

Protirakovinový účinok protinádorových peptidov odvodených od mliečneho proteínu bol už predtým opísaný. V tejto súvislosti Jeong a Hong [33] pozorovali, že trypsínové hydrolyzáty -laktalbumínu mali cytotoxický účinok na bunkové línie ľudského karcinómu kostí SJSA-1, ľudského kolorektálneho karcinómu HCT 116 a ľudského karcinómu žalúdka NCI-N87. Zistilo sa, že o-laktalbumín interaguje s modulátormi bunkového povrchu a mení rýchlosť rastu buniek, intracelulárny vápnik a rýchlosť transportu vápnika [34]. Stojí za zmienku, že hovädzí laktoferín indukoval apoptózu v bunkách MCF7 v závislosti od dávky [35]. Okrem toho kazeínové a srvátkové proteínové frakcie mlieka vykazovali protinádorové účinky na zvieracom modeli, ako aj antiproliferatívnu aktivitu in vitro [36]. Okrem toho Elzoghby a spol.[37] uviedli, že kazeínové nanočastice sa môžu použiť na zapuzdrenie hydrofóbneho protirakovinového liečiva, flutamidu, na kontrolu uvoľňovania liečiva, zlepšenie jeho protinádorovej aktivity a zníženie jeho hepatotoxicity.

Protirakovinový účinok IHIM a NabM bol už skôr publikovaný [6,38]. Cytotoxický účinok MP a MPMC možno pripísať prítomnosti aminokyselín, ako je glutamín, arginín a cysteín, o ktorých sa uvádza, že vykazujú protirakovinovú aktivitu proti kolorektálnemu karcinómu [39]. Tieto výsledky sú v súlade s vysokým obsahom kyseliny glutámovej v MPMC (obrázok 5).

2.8.2. Stanovenie hladiny proteínov p53, Bax, kaspázy-3 a Bd{5}}

Aby sa preskúmal mechanizmus cytotoxicity MPMC, hladina markerových proteínov apoptózy p53, Bax, kaspáza-3 a Bcl-2 bola stanovená v HepG-2, MCF-7 , Bj-1 a MCF-12F bunkové línie ošetrené IC0 MPMC (obrázok 8). Hladina pro- a antiapoptotických markerov je spojená s indukciou apoptózy v rakovinových bunkových líniách [40,41]. Výsledky ukázali, že MP/NabM a MP/IHMenhanced apoptosis v HepG-2 a MCF-7, ale nie v MCF-12F a Bj-1 bunkových líniách. Hladina kaspázy-3, p53, Bax sa významne zvýšila v porovnaní s príslušnými kontrolami (obrázok 8), zatiaľ čo proteín Bcl{20}} bol znížený pri všetkých ošetreniach. Je zaujímavé, že MP tiež vykazoval významnú zmenu v markeroch proteínu apoptózy. To bolo v súlade s výsledkami protirakovinovej štúdie a mohlo by sa to označovať ako cytotoxický účinok mnohých peptidov odvodených od mliečnych bielkovín, ako je diskutované vyššie (časť 2.8.1).

2.8.3. Ochrana pred poškodením DNA pomocou MPMC proti oxidačnému štiepeniu plazmidu RNH1

Plazmidová DNA RNH1 má pri elektroforéze na agarózovom géli tri formy usporiadané zhora nadol ako otvorená kruhová, lineárna a nadzávitnicová kruhová DNA. Oxidačný stres Fentonovým činidlom vyvolal poškodenie DNA. Následne sa mení hladina foriem DNA. Avšak, otvorené kruhové a lineárne formy naznačujú poškodenie DNA a supercoiled kruhová DNA naznačuje väčší ochranný potenciál. V tomto teste sme testovali, či MP a MPMC pri ich IC50 môžu chrániť pred degradáciou supercoiled kruhovej formy v reakcii na oxidačný stres. Výsledkom bolo, že MP/NabM aj MP/IHM vykazovali vysokú ochrannú kapacitu podobnú DNA kontrole (dráhy 3 a 4, obrázok 9A). Na druhej strane nebol pozorovaný žiadny významný rozdiel v DNA ošetrenej MP v porovnaní s DNA kontrolou a DNA ošetrenou len Fentonovým činidlom (dráha 5).

2.8.4. Ochrana pred poškodením DNA pomocou MPMC proti oxidačnému štiepeniu genómovej DNA

Pomocou techniky PCR sa skúmali ochranné vlastnosti MPMC na poškodenie genómovej DNA vyvolané Fentonovou reakciou. Vo všeobecnosti poškodenie DNA znižuje počet kópií určitých génov, a preto produkuje nižšiu intenzitu pásov pri gélovej elektroforéze. Testoval sa gén MTHFR s pásovou hustotou krvnej genómovej DNA inkubovanej s Fentonovým činidlom s a bez IC50 MP, MP/NabM a MP/IHM. Zistilo sa, že MP/NabM a MP/IHM (dráhy 3 a 4, obrázok 9B) zabránili poškodeniu DNA a následne chránili miesto rezania templátu MTHFR. V porovnaní s príslušnými kontrolami sa teda vytvorila vyššia intenzita pásu produktu PCR v géli pre elektroforézu (obrázok 9B). Tieto výsledky ukázali, že antioxidačná aktivita MPMC inhibovala produkciu voľných radikálov, ktoré sprostredkúvali poškodenie DNA.

2.8.5. Génová expresia

V súlade s údajmi získanými z markera apoptózneho proteínu výsledky RT-qPCR odhalili, že inkubácia buniek HepG-2, MCF-7 s MP, MP/NabM a MP/IHM vyvolala významnú upreguláciu pro- apoptotické mRNA markery, menovite Casp3, p53 a Bax, zatiaľ čo hladina expresie antiapoptotického markera Bcl-2 bola významne znížená (obrázok 10A-D). Kaspázy sú aktívne proteíny, ktoré hrajú dôležitú úlohu pri iniciácii a udržiavaní apoptózy. Zvýšená regulácia proteínu kaspázy 3 však svedčí o vykonaní hlavnej vnútornej dráhy apoptózy (obrázok 10A, B), ktorá je charakterizovaná kolapsom mitochondriálnej membrány s Bax-indukovaným uvoľňovaním cytochrómu c a aktiváciou kaspázy 9, ktorá vedie k následné zapojenie kaspázy 3 [42]. Upregulácia Casp3, p53 a Bax spolu so znížením expresie Bcl{20}} odhalila, že MP, MP/NabM a MP/IHM spustili apoptózu. V tomto ohľade upregulácia p53 stimulovala expresiu Bax, čo zase indukuje uvoľnenie cytochrómu c, po ktorom nasleduje aktivácia kaspázy-9 a -3. Je však známe, že Bcl-2 ako antiapoptóza inhibuje uvoľňovanie cytochrómu c [43], liečba viedla k významnému zníženiu hladín transkriptov mRNA antiapoptotického markerového génu Bcl-2 v dôsledku Liečba MP/NabM a MP/IHM, ktorá uľahčuje uvoľnenie cytochrómu c vyvolané Baxom a následnú apoptózu. V tejto štúdii MP/NabM vážne sprostredkoval apoptózu v porovnaní s MP/IHM a MP, ako je pozorované na (obrázok 10). Pozorované protirakovinové účinky MP/NabMor MP/IHM prebiehajú prostredníctvom modulácie dráhy apoptózy závislej od p53-, pretože hladiny jeho proteínu aj transkriptu mRNA boli významne upregulované.

Kliknutím na odkaz získate ďalšie informácie:https://www.xjcistanche.com/news/nano-milk-protein-mucilage-complexes-characte-55049190.html