Prirodzená infekcia parvovírusom u voľne žijúcich rybárskych mačiek (Prionailurus Viverrinus) odhaľuje existujúcu vírusovú lokalizáciu v obličkách

edmund.chen@wecistanche.com

Abstraktné

Mäsožravý protoparvovírus-1 (CPPV{1}}), vírusový druh obsahujúci varianty vírusu panleukopénie mačiek (FPV) a psieho parvovírusu (CPV), je široko rozšírený medzi domácimi a voľne žijúcimi mäsožravcami a spôsobuje systémové smrteľné ochorenia. Voľne žijúce mačky rybárske (Prionailurus viverrinus), celosvetovo zraniteľný druh, boli nájdené mŕtve. Postmortálne vyšetrenie tiel odhalilo lézie v čreve, slezine aRenálna. Identifikácia antigénu CPPV{0}} v týchto tkanivách pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) a imunohistochémie (IHC) podporila infekciu vírusom. PCR- a IHC-pozitivita v obličkové tkaniváodhalili atypickú lokalizáciu vírusu, pričom in situ hybridizácia (ISH) a transmisná elektrónová mikroskopia (TEM) s pop-off technikou potvrdili prvý popis vírusovej lokalizácie v r.obličky. Kompletná charakterizácia genómu a odvodená analýza aminokyselín získaného CPPV-1 od mačiek rybárskych odhalila FPV ako príčinného činiteľa. Detegované FPV sekvencie vykazovali aminokyselinové mutácie na I566M a M569R v kapsidovom proteíne. Fylogenetické a evolučné analýzy kompletných kódujúcich sekvencií genómu odhalili, že genómy CPPV-1 rybárskej mačky sú geneticky zoskupené do FPV genómov izolovaných z domácich mačiek v Thajsku. Od 70. rokov 20. storočia sa tiež ukázalo, že tieto genómy zdieľajú genetickú evolúciu s čínskymi kmeňmi FPV. Táto štúdia je prvým dôkazom infekcie CPPV-1 u mačiek rybárskych a je prvou, ktorá preukázala jej lokalizáciu vobličky. Tieto zistenia podporujú rozsah tohto parvovírusu s viacerými hostiteľmi a naznačujú, že smrteľné infekcie CPPV-1 môžu viesť k ďalším zraniteľným divokým mäsožravcom.

Kľúčové slová: obličkové tkanivo; choroby obličiek, obličky, obličky, obličkové tubulárne

Úvod

Rod Prionailurus, čeľaď Felidae, je kategorizovaný ako skupina škvrnitých, malých, divokých mačiek, ktoré pochádzajú z Ázie [1]. Rod Prionailurus zahŕňa štyri formálne uznané druhy divých mačiek vrátane mačky leopardej (P. bengalensis), mačky s plochou hlavou (P. planiceps), mačky hrdzavej (P. rubiginosus) a mačky rybárskej (P. viverrinus). [2]. Mačka rybárska žije najmä v okolí močiarov a mangrovníkov. Žije výlučne v južnej a juhovýchodnej Ázii a viac prevláda v Thajsku [3, 4]. V súčasnosti sú populácie mačiek rybárskych ohrozené, pretože mokrade, kde žijú, boli za posledné desaťročie zničené. V dôsledku toho je tento druh v súčasnosti považovaný za zraniteľný a je na Červenom zozname Medzinárodnej únie na ochranu prírody (IUNC) [3]. Kvôli strate ich biotopu sa kolónie rybárskych mačiek sťahujú a príležitostne žijú v oblastiach, kde žijú domestikované zvieratá a ľudia [5]. Tento fenomén spoločného prostredia môže viesť k zvýšenému prelievaniu patogénov medzi vnímavými voľne žijúcimi a domácimi zvieratami a naopak. Správy o smrteľných prepuknutiach u voľne žijúcich alebo domácich zvierat, ktoré mohli byť výsledkom preliatia patogénov, boli zdokumentované v priebehu niekoľkých posledných desaťročí [6–9]. Preto by sa mala preskúmať dynamika prenosu patogénov z týchto zvierat a vyžaduje si ďalšie skúmanie.

CISTANCHE ZLEPŠÍ FUNKCIU OBLIČIEK/RENÁL

Masožravý protoparvovírus-1 (CPPV{1}}), vírusový druh vrátane vírusu enteritídy norka (MEV), parvovírusu medvedíka (RPV), vírusu panleukopénie mačiek (FPV) a variantov psieho parvovírusu (CPV), bol uznávaný ako dôležitý patogén spojený so smrteľnými chorobami v divokých aj domácich čeľadiach Canidae a Felidae [10, 11]. Predpokladá sa, že FPV, bežný patogén druhu Felidae, je spoločným predkom CPV [12–14]. CPV často infikuje zvieratá z čeľade Canidae a pribúdajú dôkazy o infekcii u náprotivku čeľade Felidae [9, 15, 16]. Predtým sa predpokladalo, že FPV a CPV sú vírusom obmedzeným na hostiteľa. Niekoľko zistení však následne naznačilo, že niektoré zvieratá z čeľade Canidae môžu hrať úlohu ako rezervoár pre FPV alebo naopak [11, 17, 18]. Okrem toho niekoľko správ naznačilo, že varianty FPV a CZZ (CPV-2a, -2b a -2c) zdieľajú náchylných hostiteľov. Títo hostitelia nie sú len domáce zvieratá, ale aj rôzne mäsožravé druhy [15, 19, 20], čo naznačuje rozsah CPPV s viacerými hostiteľmi-1 [11].

V rokoch 1996 až 1997 boli varianty CPV prvýkrát detegované u leopardích mačiek a pôvodne boli označené ako parvovírus leopardích mačiek (LCPV), čo naznačuje prvý popis CPPV-1 v rode Prionailurus [21, 22]. Ukázalo sa, že niektoré z týchto kmeňov LCPV sú geneticky odlišné od predtým opísaného CPV-2a a -2b v dôsledku mutácie aminokyseliny G300A v kapsidovom (VP) proteíne. To viedlo k zmene jeho antigénnych vlastností, ktoré sa teraz používa ako jedinečný bod mutácie na odlíšenie CPV-2c od iných variantov CPV [22]. Objav nového variantu CPV (v súčasnosti známeho ako CPV-2c) u leopardích mačiek podporil myšlienku spoločnej evolúcie CPPV-1 medzi živočíšnymi druhmi. Neskôr boli hlásené infekcie variantmi FPV a CPV u leopardích mačiek [9]. To naznačuje, že iné druhy rovnakého rodu ako mačka leopard (rod Prionailurus) môžu byť náchylné na infekciu CPPV-1. Doteraz je náchylnosť na infekciu CPPV{15}} u iných druhov rodu Prionailurus stále veľkou neznámou. Rozlúštenie toho, ako sa varianty CPPV{16}} vyvíjajú a ako sa správajú novovznikajúce varianty, môže pomôcť objasniť, ako zabrániť možnému prepuknutiu nového variantu. Aj keď nový vírus získa širší rozsah hostiteľov, u nového citlivého hostiteľa možno pozorovať smrteľné prepuknutia alebo atypické lézie spojené s infekciou. Táto štúdia opisuje smrteľnú infekciu CPPV{17}} u mačiek divých rybárskych (Prionailurus viverrinus). Genetická charakterizácia získaného CPPV-1 odhaľuje FPV ako kauzálny činiteľ. Toto zistenie poskytuje prvý dôkaz infekcie FPV u tohto druhu a odhaľuje jedinečný bunkový tropizmus tohto vírusu. Ďalšie objasnenie infekcie FPV a jej variantov u tohto druhu je potrebné pre jej vysvetlenie globálnej infekcie u mnohých zraniteľných druhov.

Materiály a metódy

Zvieratá a rutinné postmortálne vyšetrenieV júni 2019 boli dve divoké mačky rybárske (P. viverrinus), označené č. 1 a 2 boli nájdené mŕtve v prímestskej oblasti v provincii Nakhon Ratchasima v Thajsku. Neskôr v auguste 2019 ďalšia mačka rybárska, označená ako prípad č. 3, bol zachraňovaný z oblasti, kde sa našli prvé dve mačky rybárske. Vzhľadom na závažnosť dehydratácie prípad č. 3 zomreli počas prevozu do zvieracej nemocnice. Tieto tri rybárske mačky boli predložené na postmortálne vyšetrenie ako rutinný proces. Žiaľ, vzorky voľne pobehujúcich domestikovaných zvierat alebo voľne žijúcich druhov žijúcich v rovnakej oblasti neboli k dispozícii; teda neboli zahrnuté do tejto štúdie. U všetkých rybárskych mačiek bola vykonaná rutinná pitva. Selektívne životne dôležité orgány vrátane pľúc, pečene, srdca, sleziny aobličkyboli odobraté vzorky od všetkých rybárskych mačiek, zatiaľ čo črevo a mezenterická lymfatická uzlina boli dodatočne odobraté od rybárskej mačky č.3. Všetky vybrané tkanivá sa podrobili histologickému vyšetreniu a individuálne sa odobrali vzorky na ďalšie molekulárne testy. Na histológiu boli tkanivá ponorené do 10 % (obj./obj.) neutrálneho pufrovaného formalínu na najmenej 24 hodín a rutinne spracované. Potom boli zafarbené hematoxylínom a eozínom

(H&E) použitím štandardných postupov pred vyšetrením veterinárnym patológom (TK) certifikovaným výborom ACVP. Vzorky čerstvého tkaniva získané z troch rybárskych mačiek sa skladovali pri -80 °C na molekulárne štúdie. Všetky postupy sa uskutočňovali v súlade so smernicami a nariadeniami po schválení Výborom pre starostlivosť a používanie zvierat Chulalongkorn University (č. 1931036).

Všeobecné virologické molekulárne testyVzorky čerstvého tkaniva vrátane srdca, pľúc, pečene, sleziny aobličkyvšetkých rybárskych mačiek plus ďalšie tkanivá črevných a mezenterických lymfatických uzlín rybárskej mačky č. 3, boli podrobené extrakcii vírusovej nukleovej kyseliny ich individuálnou homogenizáciou s 1 % (v/v) fosfátom pufrovaným fyziologickým roztokom (PBS). Následne sa celková vírusová nukleová kyselina extrahovala pomocou komerčnej súpravy na extrakciu vírusových nukleových kyselín II (Geneaid, Taipei, Taiwan) podľa návrhu výrobcu. Extrahované nukleové kyseliny sa potom kvalifikovali a kvantifikovali ich pomerom absorbancie A260/A280 pomocou spektrofotometrickej metódy (NanoDrop, Thermo Scientific™, Waltham, MA, USA). Všetky extrahované nukleové kyseliny boli ďalej podrobené vírusovému molekulárnemu vyšetreniu pomocou analýzy polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) s niekoľkými panvirologickými rodinami PCR testovacích panelov vrátane detekcie herpesvírusu [23], paramyxovírusu [24], pneumovírusu [25], kalicivírusu [26], vírus chrípky [27], bocavírus [26, 28], parvovírus [29] a koronavírus [30, 31]. Protokoly PCR, činidlá, podmienky cyklovania a pozitívne/negatívne kontroly použité v reakciách sú opísané v súbore S1. Ako vnútorná kontrola sa použila PCR špecifická pre gén glyceraldehyd- 3-fosfátdehydrogenázy (GAPDH) mačiek, ako už bolo opísané [32]. Následne boli pozitívne amplikóny PCR vizualizované pomocou platformy pre kapilárnu elektroforézu QIAxcel (Qiagen, Hilden, Nemecko), ako už bolo opísané [33]. Pozitívne amplikóny každého PCR testu boli purifikované a podrobené obojsmernému Sangerovmu sekvenovaniu (Macrogen Inc, Soul, Južná Kórea). Kvôli miernej autolýze tkanív nebolo možné vykonať bakteriologické vyšetrenie týchto rybárskych mačiek.

In situ detekcia CPPV-1 pomocou imunohistochémie (IHC), in situ hybridizácie (ISH) a transmisnej elektrónovej mikroskopie (TEM)

Počiatočný virologický molekulárny skríning odhalil pozitívne amplikóny pan-parvovírusovej PCR a výsledky sekvenovania tiež ukázali potenciálne sekvencie DNA CPPV-1. Tieto zistenia nás podnietili k ďalšiemu potvrdeniu prítomnosti CPPV-1 a k lokalizácii distribúcie CPPV-1 v tkanivách mačiek rybárskych. Vo formalíne fixované tkanivá zaliate do parafínu (FFPE) vrátane pľúc, pečene, srdca, sleziny,obličkya črevo sa podrobili detekcii CPPV{0}} IHC pomocou myšacej monoklonálnej protilátky proti psiemu parvovírusu (ab59832, Abcam, Cambridge, UK) s detekčným systémom chrenovej peroxidázy (HRP) (EnVision polymér, Dako, Glostrup, Dánsko) . Stručne, rezy FFPE boli narezané na hrúbku 4- μm a ďalej deparafinizované a rehydratované. Sklíčka sa potom vopred ošetrili, endogénna peroxidáza sa zablokovala a spracovala, ako už bolo opísané [11]. Rezy črevného tkaniva mačky infikovanej FPV a psa infikovaného CPV sa použili ako pozitívne kontroly, zatiaľ čo identické rezy sa inkubovali s purifikovanými kozími-myšími a králičími IgG (IHC univerzálne negatívne kontrolné činidlo, kód ADI-950-231-0025, Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA), boli použité ako negatívne kontroly. Čo sa týkaobličkovétubulárna nekróza prítomná v oblastiach, kde boli pozorované pozitívne signály CPPV-1 IHC,obličkyčasti všetkých rybárskych mačiek boli podrobené špeciálnemu farbeniu periodickou kyselinou Schiffovou (PAS), aby sa demonštrovala bunková architektúraobličkytkanív.

CISTANCHE ZLEPŠÍ OCHORENIE OBLIČIEK/OBLIVÍN

Okrem toho FFPEobličkyúseky rybárskych mačiek č. 1 a 3 boli podrobené analýze ISH a TEM, aby sa podporil výsledok pozitívneho farbenia CPPV-1 IHC a aby sa ultraštrukturálne demonštrovali vírusové častice vobličkové tkanivá, resp. Pre ISH bola CPPV -1 DNA sonda pokrývajúca 393 bp [34] kapsidového génu CPPV -1 skonštruovaná pomocou PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche Diagnostics, Basel, Švajčiarsko), podľa návrhy výrobcu. Reakcia tepelného cyklovania a podmienky boli uskutočnené tak, ako bolo opísané vyššie [34] s výnimkou použitia digoxigenínom (DIG) značených oligonukleotidov. Skonštruovaná hybridizačná sonda bola vizualizovaná a potvrdená rozlíšením veľkosti na 1,5 % (w/v) agarózovej gélovej elektroforéze. ISH s chromogénnou DNA sa uskutočnil tak, ako bolo opísané vyššie [26] s malými modifikáciami. Stručne povedané, po deparafinizácii, rehydratácii a následnom opláchnutí v PBS sa sklíčka FFPE s hrúbkou 4- μm podrobili proteolytickej digescii, postfixácii a predhybridizácii. Sklíčka sa potom hybridizovali s 25 ng/ul ISH sondou pri 42 °C cez noc. Hybridizačné signály boli vizualizované spojením so 100 ul anti-DIG-AP Fab fragmentov (Roche, Basel, Švajčiarsko) (1:200 v 1X blokovacom roztoku) v kombinácii s Liquid Permanent Red (LPR) (Dako, Glostrup, Dánsko) . Sklíčka sa potom kontrastne zafarbili hematoxylínom. Červené precipitáty v korelácii bunkovej morfológie sa považovali za pozitívne na ISH. Na negatívne kontroly sa namiesto sondy CPPV-1 použili sondy tilapia lake virus (TiLV) [35]. Vzorky TEM boli pripravené v súlade s pop-off technikami s modifikáciami [36–38] a boli zafarbené ťažkými kovmi, ako už bolo opísané [39, 40]. Ultraštruktúra bola skúmaná pomocou TEM (HT7800; Hitachi, Tokio, Japonsko) prevádzkovaného pri 80 kV

Kompletná genetická charakteristika CPPV rybárskej mačky-1Keďže výsledky virologickej PCR a IHC skríningu sa zhodovali a výsledky čiastočných VP-2 genómových sekvencií získaných z pan-parvovírusovej PCR naznačovali genetickú podobnosť medzi prípadmi č. 1 a 2, ale nie pre prípad č. 3, ďalej sme charakterizovali kompletnú sekvenciu CPPV-1 z týchto rybárskych mačiek (prípad č. 1 a 3) a klasifikovali sme pôvod CPPV-1 pomocou súbor degenerovaných párov primérov špecifických pre FPV a CPV získaný z predchádzajúcej publikácie [26]. Stručne povedané, extrahované nukleové kyseliny získané zo sleziny aobličkydvoch rybárskych mačiek plus ďalšie črevné tkanivo rybárskej mačky č. 3, boli individuálne amplifikované pomocou GoTaq1 Hot Start Green Master Mix (Promega, Madison, WI, USA) a špecifických primérov (S1 File). Podmienky PCR boli opísané skôr [26]. Cieľové amplikóny boli pred komerčným Sangerovým sekvenovaním vizualizované pomocou elektroforézy na 2 percentách (w/v) agarózovom géli a ďalej purifikované použitím súpravy na extrakciu gélu Monarch DNA Gel (New England Biolab, Frankfurt, Nemecko). Kompletné genómové sekvencie izolátov CPPV-1 získané z dvoch rybárskych mačiek boli uložené v GenBank (prístupové čísla MW145540-MW145541).

Fylogenetické, rekombinantné a evolučné analýzy CPPV mačky rybárskej-1 Úplné genómové sekvencie kmeňov CPPV mačky rybárskej-1 boli porovnané s publikovanými úplnými sekvenciami CPPV-1 získanými z rôznych hostiteľských druhov , dostupný v GenBank pomocou MAFFT V. 7 (http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/) a softvéru MEGA7 (http://www.megasoftware.net). Zarovnania sekvencií sa potom podrobili konštrukcii fylogenetického stromu. Fylogenetický strom bol vytvorený pomocou metódy maximálnej pravdepodobnosti (ML) s modelom Hasegawa–Kishino–Yano s gama distribúciou (HKY plus G), ktorý bol vybraný pomocou algoritmu find-best-fit modelu v MEGA7 podľa Bayesovho informačného kritéria. . Strom bol zavedený s 1,{10}} replikátmi. Sekvenčná párová podobnosť medzi genómami CPPV{11}} sa vypočítala pomocou modelu maximálnej zloženej pravdepodobnosti a ich evolučná vzdialenosť sa analyzovala v MEGA7. Výstupné párové nukleotidové identity boli generované a vizualizované vo formáte Microsoft Excel (S2 File). Výstupná zarovnávacia sekvencia CPPV-1 sa potom použila ako šablóna pre analýzu genetickej rekombinácie pomocou dvoch štatisticky nezávislých softvérových balíkov. Stručne, porovnanie identifikovalo potenciálne rekombinantné kmene pomocou integrovaného softvéru Recombination Detection Program 4 (RDP4) Package V. Beta 4.94 a to sa krížovo skontrolovalo pomocou grafu podobnosti a analýzy bootscanning v softvérovom balíku SimPlot vek V. 3.5.1. Nastavenia programov a interpretácia výsledkov boli vykonané tak, ako bolo opísané vyššie [26, 41].

FPre evolučnú analýzu CPPV{{0}} mačiek rybárskych bol získaný súbor údajov 224 kompletných sekvencií genómu obsahujúcich 26 FPV-, 6 MEV- a 192 CPV sekvencií, všetky pochádzajúce z 18 krajín v rokoch 1979 až 2019. z databázy GenBank. Evolučná analýza sa uskutočnila s 2 potenciálnymi sekvenciami CPPV-1 získanými od mačiek rybárskych pomocou modelu Bayesian Markovho reťazca Monte Carlo (BMCMC) implementovaného v BEAST V. 2.4.8 [42]. Uskutočnil sa jModelTest [43], aby sa identifikoval najvhodnejší model nukleotidovej substitúcie pre viacnásobné porovnávacie sekvencie. Najlepšie vyhovujúce substitučné modely v rámci lognormálnych uvoľnených a prísnych modelov hodín pri konštantných veľkostiach populácie ako predchádzajúce boli implementované, aby sa zohľadnili rôzne evolučné rýchlosti medzi líniami. Koalescentný strom bayesovskej panorámy predchádzajúcej a empirické základné frekvencie boli získané podľa najvhodnejšieho hodinového modelu a spustené pre 100 miliónov reťazcov, pričom sa vzorkovalo každú 10.{21}} generáciu, pričom prvých 10 percent bolo vyradených ako zapálených. Konvergencia parametrov bola potvrdená výpočtom efektívnej veľkosti vzorky pomocou programu TRACER V. 1.7.0 [44]. Stromy maximálnej dôveryhodnosti kladu boli anotované pomocou TreeAnnotator V. 1.8.3 [42]. Fylogenetický strom s odhadovanou divergenciou, variabilnou časovou osou, zadnou pravdepodobnosťou a 95 percent najvyššou posteriórnou hustotou (HPD) bol vygenerovaný a zobrazený pomocou Fig Tree V. 1.4.3 [45].

Retrospektívna štúdia antigénu CPPV-1 u voľne žijúcich mäsožravcovS cieľom preskúmať úlohu CPPV-1 spojenú s chorobnosťou a úmrtnosťou s neznámymi príčinami u voľne žijúcich mäsožravcov v dávnej a nedávnej minulosti bolo zahrnutých 305 selektívnych čerstvých vzoriek na extrakciu genómu a zacielenie identifikácie CPPV{{2} } kapsidový gén, ako je opísané vyššie. Tieto vzorky sa získavali od roku 2013 buď ako fekálne výtery, alebo ako obsah čriev. Boli získané od 136 zvierat zo zoologických záhrad z 27 rôznych mäsožravých druhov (tabuľka S1). Výsledky Postmortálne nálezy a lokalizácia tkaniva rybárskej mačky CPPV-1 Všetky pitvané rybárske mačky boli stredne vychudnuté s rôznym stupňom dehydratácie, zatiaľ čo 2 z 3 rybárskych mačiek (prípad č. 1 a 2) vykazovali miernu autolýzu. Výrazne slezina aobličkyboli preťažené vo všetkých rybárskych mačkách. Rybárska mačka č. 3 mala makroskopické lézie katarálnej enteritídy, ktoré obsahovali vodnatý hnedo-žltkastý obsah v ich lúmenoch a prekrvenie mezenterickej lymfatickej uzliny. Histologicky boli pľúca rybárskej mačky č. 3 odhalila ťažkú ​​kongesciu s infiltráciou mononukleárnych buniek v alveolách. Pečeň vykazovala miernu periportálnu hepatitídu, charakterizovanú infiltráciou mononukleárnych buniek na triádach pečeňových portálov. Podobné stupne prekrvenia sleziny s malým počtom lymfoidných folikulov sleziny boli pozorované u všetkých rybárskych mačiek. Lymfoidné folikuly boli vyčerpané a zostávajúce lymfoidné folikuly uprostred kolabovanej architektúry sleziny so zvýšeným počtom prominentných slezinných trabekul (obr. 1A). Boli tam rozptýlené karyoretické zvyšky lymfocytov s

Obr. 1. Infekcia CPPV-1 u mačiek rybárskych. Ukážkové obrázky H&E (A, C) a CPPV-1 IHC (B, D) z rybárskych mačiek. (A) Rybárska mačka č. 1. Difúzna prekrvená slezina s riedkym počtom lymfoidných folikulov. Stred jedného zo zostávajúcich lymfoidných folikulov obsahoval eozinofilný fibrilárny materiál (fibrín) premiešaný s rozptýlenými karyorektickými úlomkami lymfocytov (lymfocytolýza) (vložka). Niekoľko týchto lymfocytov obsahovalo 5–7 μm bazofilné intranukleárne inklúzne telieska, ktoré ohraničovali jadrový chromatín (šípka). (B) Rybárska mačka č. 3. Skrátenie klkov s občasnými rozšírenými kryptami, ktoré obsahovali eozinofilné proteínové látky a lemované výrazne oslabenými alebo nekrotickými epitelovými bunkami krypty (vložka). Mnoho epitelových buniek krypty bolo pyknotických a karyorrektických a zriedkavé bunky obsahovali podobné bazofilné intranukleárne inklúzne telieska (šípky). (C) Rybárska mačka č. 1. Imunoreaktivita CPPV-1 bola často pozorovaná v cytoplazme mononukleárnych buniek v oblasti lymfoidného folikulu sleziny. (D) Rybárska mačka č. 3. CPPV-1 IHC signály boli detegované difúzne a signály imunoreaktivity boli výrazne lokalizované v cytoplazme buniek kryptálneho epitelu (vložka). Stĺpce označujú 25 μm pre (A) a 120 μm pre (B–D).

akumulácie eozinofilných fibrilárnych materiálov v strede takéhoto folikulu. Niekoľko týchto lymfocytov obsahuje 5–7 μm bazofilné intranukleárne inklúzne telieska, ktoré ohraničujú jadrový chromatín. Skrátenie črevných klkov s kolapsom slizničnej architektúry bolo prítomné v črevnom úseku mačky rybárskej č. 3 (obr. 1B). Niektoré krypty boli rozšírené a obsahovali eozinofilný proteínový materiál a boli lemované výrazne oslabenými alebo nekrotickými epitelovými bunkami krypty. Mnohé kryptálne epitelové bunky boli pyknotické a karyorrhetické a zriedkavé bunky obsahovali podobné bazofilné intranukleárne inklúzne telieska. CPPV-1 IHC sa použil na preukázanie prítomnosti vírusu v tkanivách a na opísanie patologickej úlohy CPPV-1 v léziách pozorovaných pri rutinnom postmortálnom vyšetrení. Zostávajúce mononukleárne bunky v slezine odhalili pozitívnu intenzívnu imunoreaktivitu CPPV-1 u všetkých rybárskych mačiek (obr. 1C). Imunoreaktivita bola tiež pozorovaná vo väčšine cytoplazmy buniek kryptálneho epitelu a bola kompatibilná s črevnými léziami rybárskej mačky č. 3 (obr. 1D). Najmä rôzne stupneobličkové tubulárnevakuolizácia a multifokálnaobličkovékrvácanie bolo evidentné u všetkých rybárskych mačiek (obr. 2A). Niektoríobličkovétubulárne epitelové bunky boli hypereozinofilné s jadrovou pyknózou, zatiaľ čo vzácne vakuolizované tubulárne epitelové bunky odhalili vezikulárne jadrá s okrajovým jadrovým chromatínom (obr. 2B). Čo sa týkaobličkylézií, ďalej sme vykonali farbenie PAS, aby sme demonštrovali bunkovú architektúruobličkové tkanivoa vylúčiť systémovú hypoxiu ako možnú príčinu tejto lézie. Farbenie PAS preukázaloobličkové tubulárnebazálne membrány boli neporušené (obr. 2B, vložka). V rámciobličkyCPPV-1 imunoznačenie bolo silné a často pozorované v cytoplazmeobličkové tubulárneepitelové bunky (obr. 2C) a uroteliálne bunky vobličkovej panvičkyv každom prípade. V negatívnych kontrolách sa nepozorovali žiadne dôkazy imunogénnej reakcie (obr. S1). Atypická CPPV-1 lokalizácia vobličkové tkaniváodhalila IHC navrhla, že by sme mali vykonať dodatočné vyšetrovanie na potvrdenie prítomnosti a lokalizácie CPPV-1 vobličkypomocou ISH a TEM s pop-off technikou. CPPV-1 ISH-imunoreaktivita bola pozitívna u všetkých rybárskych mačiek a difúzne lokalizovaná v jadreobličkovétubulárne epitelové bunky, kde boli pozorované tubulárne lézie (obr. 2D). V negatívnych kontrolách nebola pozorovaná žiadna reakcia (obr. S1). V súlade s výsledkami pozitívnych imunologických signálov ISH lokalizovaných v jadreobličkovéboli pozorované epitelové bunky, početné malé vírusové častice s hustotou elektrónov, ktorých priemer sa odhaduje na približne 19–22 nm. Tie boli zoskupené v jadrách týchtoobličkové tubulárnea urotelové bunky (obr. 3).

Detekcia CPPV rybárskej mačky-1 a genomická analýzaNa extrahovaných vzorkách vírusovej nukleovej kyseliny sa testovali predovšetkým panely PCR pan-family špecifické pre rôzne vírusy vrátane herpesvírusu, paramyxovírusu, pneumovírusu, kalicivírusu, vírusu chrípky, bocavírusu, koronavírusu a parvovírusu. To odhalilo pozitívne výsledky iba s pan-parvovírusovou PCR v čreve, lymfatických uzlinách aobličkyvzorky troch rybárskych mačiek. Naopak, iné pan-PCR pre detekciu iných vírusov boli negatívne vo všetkých testovaných vzorkách tkaniva Z predtým získaných výsledkov pan-parvovírusovej PCR pozitivity u všetkých rybárskych mačiek sme ďalej charakterizovali kódujúce sekvencie genómu u dvoch rybárskych mačiek pomocou niekoľkých párov primérov v extrahované vzorky nukleových kyselín získané z čreva (prípad č. 1) aobličky(prípad č.3). Zistilo sa 4 462 a 4 430 párov báz kompletného kódujúceho genómu dvoch kmeňov CPPV-1 mačiek rybárskych a boli označené ako kmeň 19ZP004-TH/2019 (prípad č. 1, prírastkové č. MW145540) a 19ZP{ {12}}TH/2019 (prípad č. 3, prírastkové č. MW145541), resp. Po genetickej analýze odhalili kompletné kódujúce genómy geneticky podobné výsledky medzi kmeňmi CPPV{16}} získanými od mačiek rybárskych tým, že preukázali, že tieto CPPV{17}} mačiek rybárskych boli FPV. Odvodené porovnanie aminokyselín medzi variantmi CPPV{18}} a FPV mačiek rybárskych je popísané v tabuľke 1. Je potrebné poznamenať, že FPV mačiek rybárskych odhalilo jedinečné mutácie aminokyselín I566M a M569R v štrukturálnom (VP1 a 2) proteíne , ktoré neboli zistené v predchádzajúcich variantoch CPPV-1.

Obr. 2. Infekcia CPPV-1 u mačiek rybárskych. Demonštračné H&E (A), farbenie PAS (B), CPPV-1 IHC (C) a in situ hybridizácia (ISH) (D) mikrofotografieobličkyod rybárskych mačiek. (A, B) Rybárska mačka č.3. (A) Multifokálneobličkovékrvácanie sobličkové tubulárnevakuolizácia. Niekoľko tubulárnych epitelových buniek bolo hypereozinofilných s pyknotickými jadrami (vložka, šípky). (B)Renálne tubulárneepitelové bunky vykazovali cytoplazmatickú vakuolu a jadrá vzácnych epitelových buniek sú vezikulárne s okrajovým jadrovým chromatínom. Farbenie PAS zvýraznilo intaktnú bazálnu membránu (vložka). (C) Rybárska mačka č. 2. CPPV-1 IHC-imunoreaktivita (tmavohnedá farba) bola pozorovaná difúzne vobličkové tubulya často sa detegujú v cytoplazmeobličkové tubulárneepitel (vložka). (D) Rybárska mačka č.1. CPPV-1 ISH-imunoreaktivita (červenkastoružová farba) bola hojne pozorovaná vobličkové tubuly(hviezdičky) a lokalizovala sa v jadráchobličkové tubulárneepitelov (vložka, šípky). Stĺpce označujú 50 μm pre (A, C) a 120 μm pre (B, D).

Fylogenetická a evolučná analýzaNa porovnanie genetického vzťahu medzi zisteným CPPV{0}} rybárskej mačky a inými predtým publikovanými genómami CPPV{1}} bola vykonaná fylogenetická analýza založená na kompletnej kódujúcej sekvencii genómu. Fylogenetický strom ML ukázal, že väčšina FPV, MEV a CPV tvorila medzi skupinami veľmi odlišný klad (obr. 4). Dva genómy CPPV-1 zo študovaných rybárskych mačiek (označené červenými trojuholníkmi) boli zoskupené spolu s rovnakou líniou predtým publikovaných sekvencií FPV získaných od rôznych hostiteľov, čo potvrdzuje, že získané

Obr. 3. CPPV-1 vírusové častice v jadreobličkové tubulárneepitelové bunky. Transmisná elektrónová mikroskopia (TEM) s použitím pop-off techniky. Ultraštrukturálna demonštrácia zhlukovania častíc s hustotou elektrónov (šípky). Veľkosť ikozaedrických častíc bola 19–22 nm priemer umiestnených v jadreobličkové tubulárneepitelové bunky (vložka). Mierka, ako je znázornené na obrázku.

CPPV-1rybárskej mačky boli FPV. Detegované genómy boli zoskupené a najviac súviseli s FPV genómom detekovaným u domácich mačiek v Thajsku (prístupové č. MN127780). Na ďalšie objasnenie evolučného procesu zistenej CPPV mačky rybárskej-1 sa vykonalo niekoľko detekcií rekombinácií a evolučných analýz na súbore údajov 224 úplných sekvencií genómu CPPV-1. Rekombinačná analýza odhalila, že v sekvenciách CPPV-1 rybárskej mačky sa nenašli žiadne rekombinačné udalosti. Evolučný strom týchto údajov ukázal dva hlavné odlišné oddelené klady (obr. 5). Jeden klad obsahoval FPV a MEV a ďalší klad zahŕňal všetky sekvencie CPV. Celková miera evolúcie bola odhadnutá na 1,08 × 10-4 substitúcií/miesto/rok (95 percent HPD: 1,95 – 2,87 × 10-4 ). Evolučný strom ukázal, že FPV sekvencie rybárskej mačky boli zoskupené v rovnakej línii FPV ako tá izolovaná z Thajska. Zdieľali genetický vývoj s FPV genómami zistenými u domácich mačiek v Číne a môžu mať rovnaký pôvod od roku 1970.

Diskusia

Cirkulácia variantov CPPV-1, ktoré zahŕňajú CPV a FPV, bola identifikovaná u domácich aj voľne žijúcich mäsožravcov. Zatiaľ čo smrteľná infekcia CPPV-1 u domácich psov a mačiek je bežná, táto infekcia sa sporadicky vyskytuje u voľne žijúcich mäsožravcov [46]. Niekoľko štúdií ukázalo, že na infekciu CPPV-1 je náchylných mnoho divých mäsožravcov vrátane divých mačkovitých šeliem, noriek, vydier, skunkov, mývalov, líšok, vlkov, kojotov, cibetiek a kún [11, 19]. Najmä v prípade rodu Prionailurus boli hlásené iba leopardie mačky infikované variantmi CPPV-1 [9]. V tejto štúdii popisujeme prirodzenú infekciu FPV, člena CPPV-1, u voľne žijúcich mačiek (Prionailurus viverrinus). Toto je prvá správa s popisom odlišnej vírusovej distribúcie a tropizmu vobličkové tkaniváako bolo potvrdené antigénnou detekciou pomocou PCR, IHC, ISH a TEM analýzy ultraštruktúry.

Bol pozorovaný medzidruhový prenos variantov CPPV-1 medzi domácimi a voľne žijúcimi mäsožravcami a predpokladá sa, že niektoré smrteľné ohniská CPPV-1 sú spojené s prenesením patogénov medzi biotopy [9, 11]. V dôsledku súčasnej straty biotopov voľne žijúcich živočíchov voľne žijúce kolónie migrovali a zdieľali biotopy s domácimi zvieratami, čo viedlo k zvýšenému prelievaniu patogénov medzi vnímavými zvieratami. V tejto štúdii sme zistili, že genómy CPPV-1 mačiek rybárskych majú spoločný evolučný vzor s kmeňmi FPV zistenými v

Obr. 4. Fylogenetická topológia odhaľujúca genetický vzťah kódujúcich sekvencií plnej dĺžky medzi CPPV-1 rybárskej mačky a inými variantmi CPPV-1. Fylogenetický strom ukázal, že sekvencie CPPV-1 rybárskej mačky (označené červenými trojuholníkmi) boli zoskupené spolu s genómami FPV s genómom najviac príbuzným genómu FPV detekovaným u thajskej mačky (MN127780). Boli uvedené prístupové čísla GenBank predtým opísaných sekvencií CPPV-1 použitých v tejto analýze.

domáce mačky v Thajsku. Tieto výsledky ukazujú podobný evolučný vzor ako kmene FPV od spoločných predkov izolovaných z domácich mačiek v Číne od 70. rokov 20. storočia. Tento výsledok môže naznačovať buď možný dôkaz medzidruhového prenosu medzi mačkami domácimi a mačkami rybárskymi, alebo spoločný vývoj variantov CPPV-1. Avšak vzhľadom na obmedzené množstvo vzoriek získaných od voľne sa pohybujúcich zvierat v rovnakých biotopoch a malý počet skúmaných mačiek rybárskych nebolo možné v tejto štúdii identifikovať primárny rezervoár CPPV-1 a je potrebné ďalšie skúmanie . Hoci niekoľko štúdií naznačilo, že rôzne aminokyselinové zvyšky v kapsidovom géne sú spojené so schopnosťou infikovať nových hostiteľov aj s antigenicitou CPPV-1 [18, 47], mutácia jednej aminokyseliny na pozícii 300 kapsidový proteín (VP2) sa uvádza ako kľúčový determinant pre viaceré rozsahy hostiteľov [48]. V tejto štúdii variant CPPV-1 získaný od rybárskych mačiek odhalil rovnaké aminokyselinové vzory ako v sekvenciách FPV, s prítomnosťou alanínu (A) ako kľúčového aminokyselinového determinantu v polohe kapsidy 300. kapsidový proteín rybárskej mačky CPPV-1 odhalil aminokyseliny asparagín (N) a alanín (A) umiestnené na pozíciách 564 a 568 (ktoré sa považujú za kritické pre replikáciu FPV u mačacieho hostiteľa), mali 2 jedinečné aminokyselinové mutácie v polohách I566M a M569R. Tieto mutácie môžu tento vírus odlíšiť od predtým opísaných variantov CPPV-1. Predchádzajúca analýza rekonštrukcie predkov zistila, že FPV môže infikovať odlišné mäsožravce s niekoľkými zmenami v géne VP2 [49]. Parvovírus podobný FPV bol teda predbežne pomenovaný ako potenciálne nový vírus detegovaný u mačiek rybárskych, čo môže podporiť prvú identifikáciu tohto vírusu u tohto druhu. Avšak malý počet skúmaných rybárskych mačiek v porovnaní s malým počtom iných sekvencií nemusí poskytnúť definitívnu interpretáciu. Toto si vyžaduje ďalšiu štúdiu, aby bolo možné vyvodiť konkrétnejšie závery.

Lokalizácie CPPV-1 mačiek rybárskych boli pozorované v rôznych tkanivách vrátane črevných epiteliálnych buniek a lymfoidných buniek, kde sa najčastejšia tkanivová lokalizácia infekcie CPPV-1 nachádza u iných druhov [20, 26, 50, 51 ]. Je zaujímavé, že od počiatočného skúmania vírusovej genómovej detekcie pomocou PCR a vírusovej lokalizácie pomocou IHC odhalili odlišnú vírusovú lokalizáciu vobličkové tkanivávykonali sme farbenie PAS, aby sme demonštrovali bunkovú architektúruobličkové tkanivoa vylúčiť systémovú hypoxiu ako možnú príčinu tubulárnej nekrózy. Farbenie PAS odhalilo, že väčšina tubulárnych bazálnych membrán bola intaktná, čo naznačuje, že táto lézia nemusí byť výsledkom systémovej hypoxie [52]. Túto léziu však môžu spôsobiť aj iné príčiny, ako je toxínmi indukovaná tubulárna nekróza. Úloha parvovírusovej infekcie podobnej FPV je teda spojená sobličkylézie si ešte vyžadujú ďalšie vyšetrenie. Okrem toho sme sa pokúsili ďalej objasniť existujúcu lokalizáciu vírusu vobličkové tkanivopomocou ISH a TEM s pop-off technikou [37] v oblastiach, kde bola zistená CPPV-1 IHC-imunoreaktivita. Častice s hustotou elektrónov boli pozorované v jadreobličkové tubulárneepitelové bunky a urotelové bunky, ktoré podporujú pozitívnu in situ imunoreaktivitu CPPV-1 vobličkové tkanivo. Mačky infikované FPV vylučujú vírus prevažne vo výkaloch, ale bola opísaná prítomnosť aktívneho vírusu v moči [53, 54]. Nedávne štúdie ukázali, že parvovírusová infekcia zohráva úlohu vzlyhanie obličiek[55]. Avšak lokalizácia FPV a náprotivku CPV vobličkové tkanivonebol predtým vyšetrený. Ďalej myšobličkyParvovírus (MKPV) sa ukázal ako nefrotropný vírus tým, že vykazuje afinitu k infekcii a lokalizácii vobličkové tubulárneepitelové bunky, čo má za následokochorenia obličiek [56, 57].

Na základe našich znalostí je lokalizácia CPPV-1 vobličkynebola predtým popísaná. To naznačuje nový opis jedinečnej vírusovej lokalizácie u tohto druhu, alebo aj keď ju možno nájsť u mačiek infikovaných FPV. Toto zistenie môže podporiť predchádzajúce štúdie, ktoré našli FPV v moči. Jedinečné patologické nálezy môžu byť subjektívne a môžu byť pozorované ako infekcia u jednotlivcov. Rozsiahle vyšetrovanie CPPV u mačiek rybárskych-1 teda uľahčí definitívnu interpretáciu. Okrem toho vzorky, ktoré boli odovzdané väčšinou z mŕtvych zvierat a už prešli postmortálne autolýzou, nie sú vhodné na ďalší odber orgánov z týchto zvierat. Preto sme neboli schopní určiť lokalizáciu vírusu v iných orgánoch. Užitočným výskumom by bolo objasnenie atypickej vírusovej lokalizácie rybárskej mačky CPPV-1.

CISTANCHE ZLEPŠÍ OCHORENIE OBLIČIEK/OBLIVÍN

CPPV-1 bola identifikovaná u rôznych voľne žijúcich mäsožravcov a je spojená so smrteľnými ohniskami. Negatívny dôkaz retrospektívnej detekcie CPPV-1 vo vzorkách voľne žijúcich zvierat v tejto štúdii môže byť výsledkom buď žiadneho blízkeho kontaktu medzi vnímavými zvieratami, alebo na druhej strane predĺženého skladovania vzoriek, ktoré ovplyvňuje stabilitu genómových materiálov. Nová identifikácia CPPV-1 spojená so smrteľnou infekciou rybárskych mačiek v tejto štúdii vyvoláva obavy z novej, potenciálne virulentnej choroby u tohto zraniteľného zvieraťa. Preto je nevyhnutné ďalšie štúdium prenosu CPPV-1 u mačiek rybárskych, aby sa zabránilo strate iných vnímavých druhov zvierat. Preto by sa mali klásť dôraz na stratégie prevencie s cieľom zvládnuť infekcie CPPV-1 nielen u tohto druhu, ale aj u voľne sa pohybujúcich domácich zvierat, ktoré môžu slúžiť ako potenciálni hostitelia tohto vírusu.