Rastlinná strava bola spojená s nižším rizikom vzniku chronických ochorení, ako je obezita

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPre viac informácií

Abstrakt:Bolo navrhnuté, že špenátový metanolový extrakt (SME) inhibuje tvorbu konečných produktov pokročilej glykácie (AGE), ktoré sa zvyšujú počas progresie diabetu, takže je dôležité vedieť, či majú MSP priaznivé účinky na diabetickú sietnicu. V tejto štúdii in vitro testy ukázali, že SME inhibuje glykáciu, tvorbu karbonylových skupín a depléciu redukovaných tiolových skupín v hovädzom sérovom albumíne inkubovanom buď redukujúcimi cukrami alebo metylglyoxalom. Účinok SME v sietniciach potkanov s cukrovkou vyvolanou streptozotocínom (STZ2) bol tiež študovaný (n=10) v normoglykemickej skupine, STZ, potkanoch STZ liečených SME a potkanoch STZ liečených aminoguanidínom (odkaz na anti-AGEs skupina) počas 12 týždňov. Sietnica bola narezaná a imunofarbená na Ne-karboxymetyllyzín (CML), receptor RAGE, NADPH-Nox4, indukovateľnú syntázu oxidu dusnatého (iNOS), 3-nitrotyrozín (NT), jadrový NF-kB, vaskulárny endotelový rastový faktor ( VEGF), gliálny fibrilárny kyslý proteín (GFAP), proteín S100B a test TUNEL. Peroxidácia lipidov bola stanovená v celej sietnici hladinami malondialdehydu (MDA). Výsledky ukázali, že v diabetickej sietnici SME znížila ko-lokalizáciu CML-RAGE, oxidačný stres (NOX4, iNOS, NT, MDA), zápal (NF-B, VEGF, S10B, GFAP) a apoptózu (p<0.05).therefore, smes="" could="" attenuate="" retinal="" degeneration="" by="" inhibiting="" cml-rage="">

Kľúčové slová:špenát; diabetická retinopatia; konečné produkty pokročilej glykácie; oxidačný stres; zápal; RAGE; karboxymetyl L-lyzín

Ak chcete vedieť viac, kliknite sem

1. Úvod

Rastlinná strava sa spája s nižším rizikom vzniku chronických ochorení, ako je obezita, cukrovka 2. typu a ischemická choroba srdca. Špenát (Spinacia oleracea L.) je jedlá listová zelenina, ktorá sa konzumuje na celom svete, pretože poskytuje značné množstvo vlákniny, vitamínov a minerálov [1,2]. Bolo identifikovaných niekoľko jeho fytochemikálií vrátane chlorofylov, karotenoidov (luteín a zeaxantín) [3] a fenolových zlúčenín (flavóny, flavonoidy, kumaríny) [4-8] (pozri doplnok 1). Uvádza sa, že špenát, keď sa konzumuje ako potravina, vo vode rozpustný extrakt alebo v lyofilizovanej forme, a jeho tylakoidy majú protirakovinové vlastnosti, vlastnosti proti obezite a hypoglykemické vlastnosti [9]. Protizápalový účinok špenátu bol preukázaný na zvieracích modeloch endotoxémie, obéznych zvieratách a zdravých ľuďoch [9]. Jeho antioxidačný účinok bol študovaný na bunkách ľudského karcinómu prostaty, zvieracích modeloch s obezitou, UV ožiarených myšiach a adenokarcinóme prostaty transgénnych myší [9,10]. Antiglykačné a protizápalové účinky špenátového metanolového extraktu (SME) boli študované na modeli glukózou indukovaného diabetu u zebrafish a izoproterenolom indukovanej nekrózy myokardu u potkanov [11,12]. SME znížilo hladiny glykozylovaného hemoglobínu a fruktozamínu, vrátane hladín glykovaného proteínu, znížením aktivity aldózareduktázy v očnej šošovke [11]. Vyššie uvedené zistenia naznačujú, že MSP môžu mať preventívny účinok na progresiu komplikácií diabetes mellitus, ako je diabetická retinopatia (DR).

DR progresívne vedie k strate zrakovej ostrosti alebo slepote, čo súvisí so zápalom, oxidačným stresom a akumuláciou konečných produktov pokročilej glykácie (AGE) [13,14]. AGE indukujú zosieťovanie proteínov, menia štruktúru/funkciu a jej premenu/klírens. AGE môžu byť produkované neenzýmovou reakciou medzi glukózou a voľnou aminoskupinou proteínov, pričom vznikajú reverzibilné medziprodukty, ako sú Schiffove bázy a Amadoriho produkty (fruktózamín)[15]. Medzi ďalšie mechanizmy tvorby AGE patrí dráha „karbonylového stresu“, kde oxidáciou cukrov a lipidov vznikajú dikarbonylové medziproduktové zlúčeniny, ako je glyoxal a metylglyoxal (MGO), ktoré vedú k tvorbe AGE ako N:-karboxymetyllyzín (CML)[ 16]. Zvýšené hladiny CML v sére a sklovci môžu byť biochemickým markerom pre vznik aj progresiu DR [17,18]. V sietnici aktivácia receptora RAGE pomocou AGEs (AGEs-RAGE) indukuje nadmernú expresiu gliálneho fibrilárneho kyslého proteínu (GFAP) a prozápalových faktorov regulovaných nukleárnym faktorom kappa-light-chain-enhancer aktivovaného B. bunky (NF-kB)[19]. NF-kB pozitívne reguluje expresiu RAGE tým, že pôsobí ako mechanizmus pozitívnej spätnej väzby [20].čo je cistancheNa druhej strane, vysoké koncentrácie S100B, proteínu viažuceho vápnik, môžu tiež aktivovať NF-kB, indukovať neurozápal a aktiváciu gliových buniek [21]. Nadmerná expresia S100B v astrocytoch vyvoláva neurotoxické účinky prejavujúce sa astrogliózou sietnice [22].

Cistanche môže proti starnutiu

Experimentálne boli vyvinuté stratégie na prevenciu poškodenia sietnice. Niektoré fytochemikálie špenátu izolované z iných rastlín boli spojené s inhibíciou AGE a oxidačným stresom [8, 23-26]. Luteín, astaxantín a kempferol chránili bunky pigmentového epitelu sietnice (ARPE-19) získané z človeka pred poškodením prostredníctvom svojich anti-AGEs, antioxidačných a antiapoptóznych vlastností [26-28]. Tieto výsledky naznačujú, že fytochemikálie špenátu majú významnú úlohu pri prevencii degenerácie sietnice, ako je DR. Ďalšou stratégiou je použitie aminoguanidínu (AG) ako silného inhibítora glykácie a aktivity iNOS, ktorý zmierňuje akumuláciu CML a tvorbu reaktívnych di-karbonylových prekurzorov u potkanov [29]. V multicentrickej a randomizovanej klinickej štúdii so 690 diabetickými pacientmi sa však priaznivý účinok jednoznačne nepotvrdil [30].

Zmeny v degenerácii sietnice za hyperglykemických podmienok boli sotva študované. Preto je zaujímavé vedieť, či SME chráni vrstvy sietnice pred poškodením súvisiacim s jeho anti-AGE, antioxidačnými a protizápalovými vlastnosťami v sietnici diabetických potkanov vyvolaných streptozotocínom.

2. Materiály a metódy

2.1. Príprava metanolového extraktu zo špenátu (SME)

Čerstvé listy špenátu (S.oleracea L.) boli zozbierané v jesennom a zimnom období na poľnohospodárskom poli v provincii Puebla v Mexiku a identifikované botanikom v herbári Národného polytechnického inštitútu (IPN, Mexico City, Mexiko). Poukazový exemplár číslo 4532 bol uložený v herbári Národnej školy biologických vied IPN.

Listy boli vysušené a jemne pomleté. Sušené listy sa macerovali v metanole pri izbovej teplote, prefiltrovali cez celulózové filtre (Whatman, Maidstone, UK) a sušili pomocou rotačnej vákuovej odparky (BUCHI Rotavapor R{{0}}, Švajčiarsko) pri 45 stupňoch až výťažok zelenej gumy (95,0 g/kg suchých listov).Čistota proti starnutiuSME bol skladovaný v tme pri 4 stupňoch až do použitia. Pre všetky testy sa extrakt rekonštituoval v destilovanej vode[11].

2.2. In vitro analýzy antiglykačnej aktivity MSP

2.2.1. Tvorba konečných produktov pokročilej glykácie odvodených z bovinného sérového albumínu (BSA-AGEs)

Uskutočnil sa test BSA-AGEs, ako už bolo opísané [31]. Stručne povedané, 10 mg/ml BSA (frakcia V; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) sa pridal buď v D-glukóze 0,5 M, D-fruktóze {{12 }} 0,5 M alebo metylglyoxal 2,5 mM a vyrobené v roztoku 0 0,1 M PBS (pH 7,4) a 0,02 percenta azidu sodného. Do každej zmesi sa pridali koncentrácie SME (5, 10, 25, 50, 100 a 200 mg/ml) a potom sa inkubovali pri 37 stupňoch počas 4 týždňov. Potom sa nezreagované cukry odstránili dialýzou proti destilovanej vode počas dvoch dní pri 4 stupňoch. Hladiny BSA-AGE boli stanovené fluorescenčnou spektrofotometriou (Ex370/Em 440 nm; model LS 30, PerkinElmer LAS Ltd., Buckinghamshire, UK)[32]. Glykácia BSA proteínu redukujúcimi cukrami a MGO boli pozitívnou kontrolou (BSA glykovaný), zatiaľ čo inkubácia BSA glykovaného s aminoguanidínom (1 mg/ml) bola použitá ako negatívna kontrola (BSA glykovaný-AG). Testy sa uskutočňovali trojmo.

2.2.2. Fruktozamínový test

Hladina fruktozamínu bola stanovená testom s nitromodrou tetrazóliovou (NBT) [33], ktorá je založená na schopnosti fruktozamínu redukovať NBT za vzniku formazanu, farebného konečného produktu v alkalických podmienkach. Desať mikrolitrov kontrolných alebo glykovaných BSA-inkubovaných koncentrácií SME （BSA-SME） sa pridalo do 90 μl NBT pri 2,5 mM, pripraveného v uhličitanovom pufri (0,1 M; pH 10,3); všetky boli inkubované pri 37 °C počas 30 minút. Merala sa absorbancia pri 530 nm. Koncentrácie fruktozamínu (nmol/mg) sa vypočítali podľa štandardnej krivky formazanu.

2.2.3. Stanovenie tvorby karbonylových skupín a deplécie tiolových skupín v BSA-AGE

Koncentrácia karbonylovej skupiny sa merala v BSA-SME a kontrolných vzorkách podľa Levine et al. [34]. Roztok 2,4-dinitrofenylhydrazínu (DNPH;10 mM) v 400 ul 2,5 M HCl sa pridal do 100 ul každej vzorky a inkuboval sa v tme počas 60 minút pri teplote miestnosti.cistanche benefíciosPotom sa pridalo 500 ul kyseliny trichlóroctovej (20 percent w/v) a nechalo sa na ľade 5 minút. Vzorky sa centrifugovali pri 4{11}} otáčkach za minútu počas 15 minút a proteínová peleta sa trikrát premyla zmesou etylacetát/etanol (1:1 v/v). Potom sa vzorky suspendovali v 250 μl guanidín hydrochloridu na 6 M. Koncentrácia karbonylových skupín (nmol/mg proteínu) sa vypočítala spektrofotometriou pri absorbancii 370 nm (EON, BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA) s použitím absorpčný koeficient DNPH (22 000 M-1 cm-1).

Podľa Ellmanovej metódy bolo uskutočnené stanovenie deplécie tiolových skupín v BSA-SME a kontrolných vzorkách. Stručne, 10 μl 5,5'-disulfándiylbis（2-kyseliny nitrobenzoovej）） (DNTB;10 mM, pripravené v PBS) s 50 μl glykovaných vzoriek sa inkubovalo 15 minút pri teplote miestnosti, potom sa merala absorbancia pri 410 nm. Hladina voľných tiolových skupín bola vypočítaná pomocou štandardnej krivky L-cysteínu（0.4-11 μM） a vyjadrená v nmol/mg proteínu [34].

2.3. Vplyv MSP na sietnicu diabetických potkanov 2.3.1. Indukcia diabetu u potkanov

Použili sa samce potkanov Wistar s hmotnosťou 250 ± 10 gr (N=40) nalačno počas 8 hodín. Bola podaná intraperitoneálna dávka streptozotocínu (60 mg/kg) v citrátovom pufri (10 mM, pH 4,5) (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO, USA) [35]. O tri dni neskôr sa zmerala hladina glukózy (glukometer; ACCU-CHEK aktívny; Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Nemecko) odobratím kvapky vzorky krvi z chvosta. Do štúdie boli zaradené zvieratá s glykemickými hladinami vyššími ako 350 mg/dl. Glukóza v krvi sa merala týždenne počas 12 týždňov.

2.3.2. Experimentálny dizajn

Diabetické potkany (STZ) vyvolané streptozotocínom boli rozdelené náhodne do nasledujúcich skupín (n =10): STZ liečené intragastricky 2 ml pitnej vody (STZ); STZ liečená SME v dávke 400 mg/kg (STZ-SME); normoglykemické potkany (NG); a STZ ošetrené 50 mg/kg aminoguanidínu (AG; Sigma-Aldrich, Inc.) (STZ-AG). STZ-AG sa použil ako anti-AGE referenčná skupina. Priradené dávky sa podávali každých 24 hodín (9:00 ráno) počas 12 týždňov. Hladina glykémie vo všetkých skupinách bola sledovaná týždenne. Dávkovací režim SME pri 400 mg/kg bol založený na nasledujúcom: 7 g SME sa získa zo 100 g čerstvého špenátu (údaje nie sú uvedené). Toto množstvo zodpovedá dennej spotrebe priemerného človeka 70 kg pri americkej strave [36], čo zodpovedá 100 mg extraktu/kg telesnej hmotnosti.Cistanche Extract Anti RadiationNa druhej strane, vzhľadom na rozdiel v zrýchlenom metabolizme potkanov sa pre porovnávacie štúdie s ľuďmi odporúča zvýšiť spotrebu akéhokoľvek prírodného extraktu až 6,4-krát [37]. Dávka 400 mg/kg, ktorú sme použili, bola založená najmä na výsledkoch získaných na modeli nekrózy myokardu vyvolanej u potkanov Wistar, ktoré ukázali, že protizápalový účinok SME je výraznejší pri dávke 300 mg/kg [12].

2.3.3. Histologické a imunohistochemické hodnotenia

Enukleované oči boli fixované v neutrálnom formalíne a potom boli dehydratované v triedených alkoholoch a zaliate do parafínu. Histologické rezy s hrúbkou 2 μm boli pripevnené na podložné sklíčka s elektrickým nábojom, zbavené vosku a rehydratované až do roztoku na získanie antigénu (K035; 10 x citrátový pufer, pH 6; Diagnostic BioSystems, Pleasanton, CA, USA). Použil sa imunodetekčný systém na báze polyméru (Detekčný systém PolyVuemouse/králika DAB, Diagnostic BioSystems). Boli použité nasledujúce primárne protilátky: gliálny fibrilárny kyslý proteín (anti-GFAP;MAB360; Chemicon International, Inc., Temecula, CA, USA); vaskulárny endotelový rastový faktor (anti-VEGF;sc-7269; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA), proteín B viažuci vápnik S100 (anti-S100B; ab52642; Abcam PLC, Cambridge, UK) a nukleárny faktor kappa-ľahký reťazec-enhancer aktivovaných B buniek (anti-NF-kB p65;sc{20}}). Všetky riedenia boli 1:200 a inkubované cez noc pri 4 stupňoch. Sekundárna protilátka (Mouse/Rabbit PolyVueTM) bola pridaná podľa pokynov dodávateľa.cistanche herbaRezy sa zafarbili substrátom DAB plus/chromogén a hematoxylínom. Histologické pozorovania a zachytávanie obrázkov sa uskutočňovali v mikroskope Carl Zeiss (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Nemecko).

Na imunofluorescenčné farbenie boli sklíčka inkubované cez noc pri 4 °C s nasledujúcimi primárnymi protilátkami: karboxymetyllyzín (anti-CML; ab124145; Abcam PLC, Cambridge, UK), AGE receptor (anti-RAGE; sc{4}}), NADPH oxidáza 4 (anti-Nox4;ab133303), 3-nitrotyrozín (anti-NT; ab110282) a syntáza oxidu dusnatého (indukovateľná) (anti-iNOS; A00368-1;Boster Bio, Pleasanton, CA , USA). Potom sa použili nasledujúce sekundárne protilátky: pre anti-RAGE konjugovaný kozí anti-myší IgG(FITC) (1:200; Santa Cruz, Biotechnology, Inc.); pre anti-CML a anti-NT myšací anti-králičí IgG-PE (SC-3753); a pre anti-iNOS a anti-Nox4, m-IgGkBP-PE (Sc-516141). Všetky boli inkubované pri teplote miestnosti počas 60 minút. Potom sa rezy umiestnili do média obsahujúceho 4',6-diamidín-2}'-fenylindol dihydrochlorid (DAPI). Anti-CML a anti-RAGE protilátky boli ko-hybridizované na rovnakom sklíčku. Na fluorescenčné snímky sa použila FLoidTM Cell Imaging Station (Life technologies Carlsbad, San Diego, CA, USA).

2.3.4. Hodnotenie apoptózy

Apoptóza buniek sietnice sa detegovala podľa návodu opísaného terminálnou deoxynukleotidyltransferázou (TdT) sprostredkovanou deoxyuridíntrifosfátom (dUTP) testom na značenie nick-end (TUNEL) s použitím súpravy na detekciu bunkovej smrti In situ, TMR(tetrametyl-rodamín{{{{101} 3}}dUTP) červená, verzia 12 (12156792910; Roche Diagnostics). Stručne povedané, odvoskované sklíčka boli rehydratované a dvakrát opláchnuté PBS. Potom boli inkubované s reakčnou zmesou TUNEL vo zvlhčenej atmosfére počas 60 minút pri 37 °C. Potom boli rezy pripevnené pomocou DAPI a pozorované vo fluorescenčnej mikroskopii (FLoidTM Cell Imaging Station). IOD pre TUNEL sa vypočítal pre vrstvy sietnice.

2.3.5. Test peroxidácie lipidov

Na vyhodnotenie hladín malondialdehydu (MDA) v tkanive sietnice sa približne 3 mg čerstvého tkaniva (n=3) homogenizovalo a spracovalo tak, ako už bolo uvedené [38]. Hladiny MDA boli kvantifikované podľa pokynov dodávateľa súpravy (testovacia súprava OXItek-TBARS, Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA).

2.4. Štatistická analýza

Na štatistickú analýzu boli všetky mikrofotografie sietnice zachytené s veľkosťou 200× vo vzdialenosti 100 μm za oblasťou zrakového nervu. Analyzovalo sa približne 40 obrázkov na skupinu zvierat (n=7). Analýza obrazu sa uskutočnila pomocou softvéru Image-Pro Premier Verzia 9.0 (Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, USA). Použili sme softvér GraphPad Prism (La Jolla, CA, USA; verzia 8.0). Obrázky znázorňujú hodnoty vykreslené v rámčekových grafoch (medián, prvý-tretí kvartil, minimálna-maximálna hodnota) pre vrstvu gangliových buniek (GCL), vnútornú jadrovú vrstvu (INL) a vonkajšiu jadrovú vrstvu (ONL). Priemer a štandardná odchýlka (priemer ± SD) sú uvedené v prílohe A (tabuľky A1-A3). Vo všetkých prípadoch sa uskutočnil jednosmerný test ANOVA, po ktorom nasledoval Tukeyho test. p<0.05 was="" considered="" statistically="">