Neuroprotektívny potenciál izotiokyanátov v modeli neuroinfamácie in vitro

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Tiziana Latronico1 · Marilena Larocca2 · Serafna Milella1 · Anna Fasano1 · Rocco Rossano2 · Grazia Maria Liuzzi1

Prijaté: 10. júla 2020 / Prijaté: 25. októbra 2020 / Zverejnené online: 16. novembra 2020

© Autor(i) 2020

Funkcia bylinného prášku Cistanche: má veľmi dobrýneuroprotektívny účinok

Abstraktné

Izotiokyanáty (ITC), prítomné ako glukozinolátové prekurzory v krížovej zelenine, preukázaliprotizápalovéantioxidačné a antikarcinogénne aktivity. Tu sme porovnávali účinky troch rôznych ITC na produkciu ROS a na expresiu matricovej metaloproteinázy (MMP)-2 a -9, ktoré predstavujú dôležité patogenetické faktory rôznych neurologických ochorení. Primárne kultúry potkaních astrocytov boli aktivované LPS a súčasne ošetrené rôznymi dávkami alylizotiokyanátu (AITC), 2-fenetylizotiokyanátu (PEITC) a 2-sulforafanu (SFN). Výsledky ukázali, že SFN a PEITC boli schopné pôsobiť proti produkcii ROS indukovanej H2O2. Zymografická analýza supernatantov bunkových kultúr preukázala, že PEITC a SFN boli najúčinnejšími inhibítormi MMP-9, zatiaľ čo iba SFN významne inhiboval aktivitu MMP-2. Analýza PCR ukázala, že všetky použité ITC významne inhibovali expresiu MMP-2 aj MMP{9}}. Výskum signálnej dráhy mitogénom aktivovanej proteínkinázy (MAPK) ukázal, že ITC modulujú transkripciu MMP inhibíciou aktivity extracelulárne regulovanej proteínkinázy (ERK). Výsledky tejto štúdie naznačujú, že ITC by mohli byť sľubnými nutraceutickými činidlami na prevenciu a doplnkovú liečbu neurologických ochorení spojených s účasťou MMP.

Kľúčové slováAntioxidant · Protizápalový · Izotiokyanát · Matrixové metaloproteinázy · Neurodegeneratívne ochorenia

Úvod

Neurozápal je komplexná reakcia na poranenie mozgu zahŕňajúca kaskádu biochemických dejov vedúcich k aktivácii rezidentných buniek centrálneho nervového systému (CNS). Aberantná aktivácia astrocytov ohrozuje ich neuroprotektívnu úlohu, čo vedie k uvoľňovaniu zápalových mediátorov, ako sú reaktívne formy kyslíka (ROS), oxid dusnatý (NO), cytokíny, chemokíny a matricové metaloproteinázy.

(MMP).

MMP sú veľkou rodinou neutrálnych endopeptidáz závislých od Zn2 plus, ktoré majú ako hlavné ciele zložky extracelulárnej matrice (ECM), ako je fibronektín, kolagén, elastín a laminín (Latronico a Liuzzi 2017).

Tiziana Latronicová

tiziana.latronico@uniba.it

Katedra biologických vied, biotechnológií a biofarmaceutiky, Univerzita v Bari"Aldo Moro",

Bari, Taliansko

Katedra vied, University of Basilicata, Potenza,

Taliansko

V CNS sa MMP podieľajú na rôznych fyziologických odpovediach, ako je morfogenéza, obrat a remodelácia ECM, embryogenéza a hojenie rán; keď však MMP uniknú regulačným mechanizmom, stanú sa škodlivými (Rosenberg 2009; Agrawal et al. 2008).

V tomto ohľade je známe, že zmeny v expresii a aktivite MMP sú kľúčovými patogenetickými udalosťami pri niekoľkých neurologických poruchách (Latronico a Liuzzi 2017; Mastroianni a Liuzzi 2007; Brkic et al. 2015). Experimentálne dôkazy naznačujú, že medzi MMP sa na neurozápale podieľajú najmä želatinázy A (MMP-2) a B (MMP-9), pretože ich zvýšená regulácia môže ohroziť integritu hematoencefalickej bariéry (BBB). To vedie k zvýšenému náboru a infiltrácii imunitných buniek periférnej krvi do mozgového parenchýmu, čím sa udržiava zápalový proces, ktorý je príčinou progresívnej straty neurónov a zhoršenej funkcie neurónov (Rivest 2009). Niekoľko štúdií in vitro a in vivo ukázalo, že produkcia ROS je jedným z faktorov zapojených do upregulácie expresie MMP-9 v mozgových bunkách prostredníctvom mechanizmov závislých od signálnej dráhy mitogénom aktivovanej proteínkinázy (MAPK) (Hsieh a Yang 2013).

Na základe týchto dôkazov je jasné, že downregulácia neurotoxických faktorov, ktorá vedie k zníženiu neurozápalových reakcií, môže predstavovať účinnú terapeutickú stratégiu na prevenciu nástupu alebo zmiernenie progresie mozgových ochorení.

V posledných rokoch sa biomedicínsky záujem v neurologickej oblasti čoraz viac zameriava na výskum prírodných zlúčenín schopných modulovať procesy spojené s neurozápalovými odpoveďami. V tomto ohľade niekoľko štúdií ukázalo, že fytochemické zlúčeniny, ako sú polyfenoly, izotiokyanáty (ITC) a iné, majú neuroprotektívny potenciál, ktorý tiež vyplýva z ich schopnosti inhibovať expresiu MMP a pôsobiť proti produkcii ROS (Dinková-Kostova a Kostov 2012; Liuzzi a kol., 2007, 2011).

Izotiokyanáty sú metabolity produkované niekoľkými rastlinami patriacimi do čeľade Brassicaceae ako systém obrany proti napadnutiu patogénmi (Bones a Rossiter 2006). Vznikajú enzymatickou degradáciou glukozinolátov (GSL) enzýmom myrozinázou. ITC sú prítomné v bežne konzumovanej krížovej zelenine, ako je brokolica, ružičkový kel, kapusta, repa, chren, kaleráb, horčica, reďkovka, žerucha a kel. Ich množstvá v potravinách sú veľmi variabilné a závislé od spracovania a prípravy jedla.

Nedávno sa ukázalo, že ITC majú rôzne terapeutické účinky, vrátane antioxidačného, ​​antibakteriálneho, protizápalového a chemopreventívneho účinku (Dufour et al. 2015; Marzocco et al. 2015).

Ochranná aktivita ITC sa uskutočňuje prostredníctvom modulácie rôznych signálnych dráh zapojených do detoxikácie, zápalu, apoptózy a regulácie bunkového cyklu. Niekoľko dôkazov naznačuje, že antikarcinogénne a protizápalové vlastnosti ITC možno pripísať najmä ich schopnosti aktivovať dráhu nukleárneho faktora erytroidného 2-faktora 2 (Nrf2). Nrf2 je redox-senzitívny transkripčný faktor, ktorý sa v prítomnosti elektrofilných činidiel a podmienok oxidačného stresu translokuje do jadra, kde viaže prvky antioxidačnej odozvy (ARE), indukuje expresiu cytoprotektívnych génov zapojených do detoxikácie a modulácie oxidačných podmienok a zápalové procesy (Heiss et al 2001). V tomto ohľade sa uvádza, že ITC sú schopné zvýšiť antioxidačnú kapacitu ľudských buniek indukciou expresie detoxikačných enzýmov fázy II a up-reguláciou produkcie GSH (Wagner et al 2010). Okrem toho sa uvádza existencia krížovej komunikácie medzi Nrf2 a dráhou jadrového faktora (NF)-KB, ktorá vedie k modulácii zápalu (Sturm a Wagner 2017; Lee a Johnson 2004). V tomto ohľade rôzne experimentálne in vitro a in vivo modely neurozápalu preukázali, že ITC sú schopné významne znížiť translokáciu NF-κB s následnou inhibíciou prozápalových cytokínov a MMP (Lee et al. 2015; Subedi et al. 2017).

V tomto článku sme skúmali účinok troch ITC, tj alylizotiokyanátu (AITC), 2-fenetylizotiokyanátu (PEITC) a 2-sulforafanu (SFN) na uvoľňovanie MMP-2 a -9, ako aj na produkciu ROS astrocytmi aktivovanými LPS. Naše výsledky preukázali, že PEITC, SFN a AITC sú schopné in vitro inhibovať expresiu MMP-9 a MMP-2 v astrocytoch aktivovaných LPS a pôsobiť proti produkcii ROS indukovanej H2O2. Okrem toho sme demonštrovali, že ITC modulujú nadmernú expresiu MMP mechanizmami súvisiacimi s inhibíciou aktivity extracelulárne regulovanej proteínkinázy (ERK). Tieto výsledky naznačujú, že strava bohatá na krížovú zeleninu môže mať potenciálne výhody pri prevencii a doplnkovej liečbe neurologických ochorení.

Materiály a metódy

Chemikálie a činidlá

Dulbeccovo modifikované Eaglovo médium (DMEM), fetálne bovinné sérum (FBS), penicilín a streptomycín poskytla spoločnosť GIBCO (Paisley, Škótsko). Želatína, DNáza 1, poly-L-lyzín

(PLL), trypsín, lipopolysacharid (LPS), trypánová modrá a 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2.5-difenyltetrazóliumbromid (MTT ), alylizotiokyanát (AITC) [cod. 377 430, čistota 95 percent (HPLC)], 2-fenetylizotiokyanát (PEITC) [kód. 253 731, čistota 99 percent)], 2-sulforafan (SFN) [cod. S6317, čistota väčšia alebo rovná 95 percent (HPLC)] boli poskytnuté od Sigma (St. Louis, MO, USA). 2',7'-dichlórfluoresceín diacetát (DCFH-DA) bol zakúpený od Calbiochem. Štandardné proteíny a R-250 Coomassie Brilliant Blue boli od Bio-Rad (Hercules, CA, USA). Protilátky proti gliálnemu fibrilárnemu kyslému proteínu (GFAP) (RRID: AB_2294571) boli zakúpené od spoločnosti Serotec (Oxford, UK). Protilátky proti extracelulárne regulovaným proteínkinázam (ERK) 1/2 a fosforylovanému ERK 1/2 (p-ERK 1/2) boli od Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Hybond-P PVDF membrány, zosilnená chemiluminiscencia (ECL) Western blotting Analysis System a anti-myšia-HRP sekundárna protilátka boli od GE

Healthcare Life Sciences (Little Chalfont, Buckinghamshire,

Spojené kráľovstvo). Páry primerov špecifické pre MMP-2, MMP-9 a 18S rRNA boli od Sigma Genosys (Cambs, Spojené kráľovstvo). RNeasy mini kit a QuantiTect reverzná transkripčná súprava boli zakúpené od Qiagen (Valencia, CA, USA). Reagencie Econo-Taq PLUS GREEN 2X Master Mix pre PCR boli zakúpené od Lucigen Corporation (Middleton, WI, USA).

Etické vyhlásenie

Experimenty so zvieratami sa uskutočnili v súlade s odporúčaniami v príručke NIH pre starostlivosť a používanie laboratórnych zvierat a so súhlasom Inštitucionálneho výboru pre starostlivosť o zvieratá a ich používanie na Univerzite v Bari, Taliansko (číslo povolenia: 23-98- A).

Príprava kultúr astrocytov

Astrocyty boli pripravené z neokortikálnych tkanív {{0}}deň starých potkanov Wistar (RRID: RGD_737960, Harlan Laboratories srl, Udine, Taliansko). Na prípravu astrocytov bolo použitých 6 vrhov po 12 mláďat, každé z oboch pohlaví. Zvieratá boli usmrtené vystavením oxidu uhličitému (CO2) a usmrtené rýchlou dekapitáciou. Neokortikálne tkanivá boli rozrezané a použité na purifikáciu primárnych gliových bunkových kultúr podľa metódy, ktorú opísali Latronico et al. (2018). Stručne, po pitve boli potkanie mozgy zbavené mozgových blán a krvných ciev, mechanicky rozomleté ​​a natrávené 0,25 percent trypsínu v prítomnosti 0,01 percent DNázy. Po odstredení a vyhodnotení životaschopnosti buniek sa bunky naniesli do fliaš potiahnutých PLL (75 cm2) v hustote 1,5 x 107 buniek/fľaša v DMEM, 10 percent FBS, 100 IU ml -1 penicilín, 100 ug ml -1 streptomycín a udržiavaná na 37 stupňoch pri 5 percentách CO2. Po 7 dňoch boli banky pretrepané, aby sa odstránili oligodendrocyty a mikroglie. Čistota astrocytov, získaných trypsinizáciou (0,25 percent trypsínu/0,02 percent EDTA), bola hodnotená imunofarbením na GFAP.

Liečba astrocytov aktivovaných LPS allylizotiokyanátom, fenetylizotiokyanátom alebo 2-sulforafanom

Konfluentné astrocyty, nasadené na 96-jamkové platne, boli stimulované 10 µg ml -1 LPS a súčasne ošetrené rôznymi koncentráciami alylizotiokyanátu (AITC), 2-fenetylizotiokyanátu (PEITC) alebo 2-sulforafanu (SFN) v DMEM bez séra. Astrocyty v bezsérovom DMEM a astrocytoch aktivovaných LPS predstavovali negatívne a pozitívne kontroly. Okrem toho, keďže zásobné roztoky AITC (100 uM), PEITC (67 uM) a SFN (56,4 uM) boli vyrobené v DMSO, krivka odozvy na dávku pre DMSO, zriedená v kultivačnom médiu pri rovnakej koncentrácii rozpúšťadla prítomnej v analyzovaných vzoriek sa uskutočnila analýza toxicity zlúčeniny. Po 20 hodinách inkubácie pri 37 stupňoch, 5 % CO2 sa supernatanty zhromaždili a skladovali pri -20 stupňoch až do použitia, zatiaľ čo bunky sa podrobili testu MTT na posúdenie životaschopnosti buniek.

Test životaschopnosti buniek MTT

Cytotoxicita AITC, PEITC a SFN na astrocytoch bola zistená pomocou MTT [{{0}}(4,5-dimetyltiazol-2-yl)- 2,{{5 }}difenyltetrazoliumbromid]. Tento test je založený na redukcii MTT mitochondriálnou sukcinátdehydrogenázou v životaschopných bunkách na nerozpustný modrý formazanový produkt, ktorý možno spektrofotometricky merať. Stručne, po 20 hodinovom ošetrení s AITC, PEITC alebo SFN sa kultivačné médium odstránilo a bunky sa naniesli 0, 5 mg ml-1 MTT. Po inkubácii počas 2 hodín pri 37 stupňoch sa odstránilo 5 percent C02 média a kryštály formazanu v bunkách sa solubilizovali s 90 percentami etanolu. Po trepaní doštičiek počas 15 minút, aby sa dosiahlo úplné rozpustenie kryštálov, sa množstvo formazanového produktu určilo optickou absorbanciou pri 560 nm s referenčnou vlnovou dĺžkou 690 nm. Životaschopnosť buniek bola vyjadrená ako percento kontroly (CTRL), reprezentované neošetrenými bunkami, ktoré bolo nastavené na 100 percent. Pre každú zlúčeninu sa získala krivka závislosti bunkovej životaschopnosti na dávke.

Detekcia reaktívnych foriem kyslíka

Detekcia reaktívnych foriem kyslíka (ROS) sa uskutočňovala naplnením astrocytov 10 μM 2',7'-dichlórfluoresceín diacetátu (DCFH-DA) v DMEM bez fenolovej červene pri 37 stupňoch počas 30 minút. Potom sa z jamiek odstránil DCFH-DA a bunky sa ošetrili 1 hodinu s AITC (400 μM), PEITC (10 μM) alebo SFN (25 μM) v DMEM bez fenolovej červene v prítomnosti H2O2 v konečnej koncentrácii 100 μM. . Bunky ošetrené iba DCFH-DA alebo H2O2 predstavovali negatívnu (CTRL) a pozitívnu kontrolu (H2O2). Po inkubácii boli bunky premyté PBS a lyzované

Tris-HCl 10 mM/NaCl 150 mM/Triton X-100 0,5 percent, pH 7,5,

potom sa centrifuguje pri 10,000×g, 4 stupňoch počas 10 minút. Supernatanty sa odobrali a ich spektrofluorimetrická analýza sa uskutočnila pri 525 nm za excitácie pri 485 nm. Výsledky boli normalizované na celkový obsah proteínu a produkcia ROS bola vyjadrená ako relatívne percento intenzity fotoluminiscencie (PL) oproti pozitívnej kontrole.

Detekcia želatináz

Gelatinázová aktivita v bunkových supernatantoch (SN) bola detegovaná zymografickou analýzou, ako uvádza Latronico et al. (2013). V stručnosti, množstvo SN, zodpovedajúce približne 10 ug celkových proteínov, sa solubilizovalo s 30 ul Laemmliho vzorkového pufra bez -merkaptoetanolu. Vzorky boli analyzované v 7,5 % polyakrylamidovom géli kopolymerizovanom s 0,1 % (hmotn./obj.) želatínou. Po elektroforetickom cykle sa gély dvakrát premyli 2,5 percentami Triton X-100/10 mM CaCl2 v 50 mM Tris-HCl, pH 7,4 a inkubovali sa 24 hodín pri 37 stupňoch v 1 percente Triton X-100 /50 mM Tris-HCl/10 mM CaCl2, pH 7,4. Gély boli zafarbené Coomassie brilantnou modrou R-250 a odfarbené v zmesi metanol/kyselina octová/H20 (4:1:5 v/v). Želatinázová aktivita bola vizualizovaná ako číry pás štiepenia na modrom pozadí gélu a bola kvantifikovaná počítačovou denzitometrickou obrazovou analýzou pomocou Image LabTM Software (Bio-Rad Laboratories). želatináza

aktivita bola vyjadrená ako optická hustota (OD) x mm2, čo predstavuje skenovaciu plochu pod krivkami, ktorá zohľadňuje jas aj šírku zóny lýzy substrátu. Údaje boli vyjadrené pomocou nasledujúcej rovnice: percento inhibície=[100 - (OD vzorka/OD pozitívna kontrola) x 100].

Reverzná transkripcia-polymerázová reťazová reakcia (RT-PCR)

Astrocyty nasadené na 6-jamkové platne boli aktivované LPS (10 ug ml-1) a súčasne ošetrené ITC v maximálnej netoxickej koncentrácii. Po 20 hodinách inkubácie sa celková RNA extrahovala z astrocytov pomocou mini súpravy Qiagen RNeasy podľa pokynov výrobcu. Komplementárna DNA (cDNA) sa syntetizovala z 500 ng RNA s použitím súpravy QuantiTect Reverse Transscription kit podľa pokynov výrobcu. Celkovo 25 ng produktov reverznej transkripcie sa použilo na amplifikáciu 591 bp fragmentu pomocou špecifických primerov (sense 5'-GTC ACT CCG CTG CGC TTT TCT CG-3′; antisense 5'-GAC ACA TGG GGC ACC TTC TGA-3′) pre potkaniu MMP-2 sekvenciu a 541 bp fragment s použitím špecifických primérov (sense 5'-CGG AGC ACG GGG ACG GGT ATC 3′; anti-sense 5'-AAG ACG AAG GGG AAG ACG CAC ATC 3′) pre potkaniu MMP-9 sekvenciu. Paralelne bola vykonaná amplifikácia 308 bp fragmentu potkanej 18S rRNA (sense 5′-GCCTAGATA CCGCAGCTAGGA-3′; antisense 5′-TCATGGCCTCAG TTCCGAA-3′), relatívne invariantný interný referenčný gén . Sady primérov, už overené v iných štúdiách (Latronico et al. 2013; Liuzzi et al. 2004; Gramegna et al. 2011) špecificky rozpoznávajú iba požadované gény, ako je indikované amplifikáciou jedného pásu očakávanej veľkosti PCR Produkty. PCR amplifikácia sa uskutočnila počas 25 cyklov , z ktorých každý pozostával z denaturácie pri 94 stupňoch , žíhania pri 59 stupňoch a extenzie pri 72 stupňoch . Po amplifikácii sa produkty analyzovali v 1,5 % agarózových géloch. Po denzitometrickej analýze gélov sa amplifikácia cieľových génov normalizovala na expresiu 18S rRNA a výsledky sa vyjadrili ako percento inhibície v porovnaní s pozitívnou kontrolou, ako sa uvádza pri kvantifikácii želatinázy.

Detekcia fosforylácie ERK 1/2 pomocou analýzy Western blot

ERK 1/2 boli detegované imunoblotovou analýzou, ako je uvedené v Latronico et al. (2018). Stručne povedané, splývajúce primárne

astrocyty nanesené na {{0}}jamkové platne, ponechané v pokoji v médiu bez séra na 24 hodín, boli vopred ošetrené počas 1 hodiny s AITC (40}0 μM), PEITC (10 μM), alebo SFN (25 uM) v DMEM bez fenolovej červene. Po stimulácii počas 2 hodín s 10 ug ml-1 LPS sa bunky lýzovali s 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2,5 mM pyrofosfátom sodným, 1 mM glycerofosfátom 1 percentom Triton X-100, 1 mM fenylmetylsulfonyl fluorid, 20 ug/ml aprotinínu, 1 mM EGTA, 1 mM Na-fuorid, 1 mM Na3V04, pH 7,5. Šesťdesiat ug celkových proteínov každej vzorky sa rozdelilo elektroforézou na 10% SDS-polyakrylamidovom géli a proteíny sa potom imunoblotovali na polyvinylidéndifluoridové membrány. Po blokovaní cez noc pri 4 stupňoch pomocou 0,05 percenta Tween 20, 1 percenta mlieka, 1 percenta hovädzieho sérového albumínu v 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) boli membrány cez noc sondované pri 4 stupňoch monoklonálnou anti-p- ERK 1/2 protilátka (1:500). Potom sa membrány trikrát premyli 0,05 % Tween 20 vo fyziologickom roztoku pufrovanom Tris, sondovali sa sekundárnou protilátkou proti myšacej a chrenovej peroxidáze (1:20,000) počas 2-h pri 24 stupňoch a detegovali sa so zvýšenou chemiluminiscenciou. Na vyhodnotenie celkového množstva ERK boli membrány stripované a inkubované s protilátkou špecifickou pre nefosforylovanú ERK 1/2 (1:500). Intenzity pásov boli kvantifikované denzitometrickým skenovaním blotov a hladiny fosforylácie ERK 1/2 boli normalizované na nefosforylovanú ERK 1/2 a vyjadrené ako percento v porovnaní s pozitívnou kontrolou (astrocyty ošetrené LPS), podľa nasledujúca rovnica:

percento pERK 1/2=(ODvzorka/ODpozitívna kontrola) × 100.

Štatistická analýza

Analýza údajov sa uskutočnila pomocou GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). Údaje boli vyjadrené ako stredné hodnoty ± SD. Štatistická analýza sa uskutočnila s použitím jednosmernej analýzy rozptylu (ANOVA), po ktorej nasledoval post hoc test Dunnett's Multiple Comparison.

Výsledky

Účinok izotiokyanátových zlúčenín na životaschopnosť astrocytov

Uskutočnili sa predbežné experimenty na vyhodnotenie cytotoxicity AITC, PEITC alebo SFN. Na tento účel boli purifikované astrocyty ošetrené počas 20 hodín zlúčeninami ITC v koncentráciách v rozmedzí medzi 5 a 400 uM alebo DMSO zriedeným v kultivačnom médiu, ako je opísané v časti metódy. Ako je znázornené na obr. 1, DMSO nebol toxický vo všetkých použitých koncentráciách, ktoré sa zhodujú s testovanými roztokmi ITC. Medzi skúmanými ITC, AITC

Obr. 1 Životaschopnosť buniek astrocytov ošetrených izotiokyanátovými zlúčeninami. Konfluentné primárne astrocyty boli ošetrené počas 20 hodín alylizotiokyanátom (AITC), 2-fenetylizotiokyanátom (PEITC) alebo 2-sulforafanom (SFN) v uvedených koncentráciách, potom boli podrobené testu MTT. Okrem toho, keďže je v zásobných roztokoch rozpustených v dimetylsulfoxide (DMSO), v každom experimente bola vykonaná krivka závislosti odozvy na dávke pre DMSO, zriedený v kultivačnom médiu pri rovnakej koncentrácii rozpúšťadla (v percentách) prítomnej vo vzorkách ITC, aby sa získal spoľahlivý odhad toxicity ITC. Ovládanie (CTRL) bolo repre-

s vôňou z neošetrených astrocytov v DMEM bez séra. Grafy predstavujú krivky závislosti životaschopnosti buniek na dávke, vyjadrené ako percento prežitia buniek v porovnaní s kontrolou. Dávky zlúčenín, ktoré určovali životaschopnosť buniek nad 60 percent, boli zvolené ako maximálne netoxické koncentrácie. Hodnoty sú priemer ± SD z n=3 experimentov uskutočnených na rôznych populáciách buniek. Mikrografy ukazujú reprezentatívne výsledky bunkovej morfológie pozorované pod mikroskopom s fázovým kontrastom (50-násobné zväčšenie) po ošetrení rôznymi zlúčeninami

bol menej toxický pre astrocyty. Najmä AITC nebol toxický pre bunky do 400 uM, zatiaľ čo PEITC a SFN boli toxické pri koncentráciách nad 10 a 25 uM. Mikroskopické pozorovanie potvrdilo výsledky testu MTT ukazujúce, že pri toxických koncentráciách PEITC a SFN bol počet astrocytov znížený a tie, ktoré zostali, vykazovali cytotoxické zmeny v ich cytoplazme.

Ochranný účinok zlúčenín ITC na produkciu ROS v astrocytoch ošetrených peroxidom vodíka

Na vyhodnotenie ochranného účinku ITC voči oxidačnému stresu boli astrocyty vopred ošetrené PEITC, AITC a SFN v maximálnej netoxickej koncentrácii a potom stimulované H202. Intracelulárna produkcia ROS, indukovaná H202, bola testovaná pomocou DCFH-DA. Ako je znázornené na obr. 2, expozícia H202 zosilnila fluorescenčný signál v

Obr. 2 Produkcia reaktívnych foriem kyslíka (ROS) v astrocytoch ošetrených ITC. Prítomnosť ROS sa testovala meraním zmien fluorescenčného signálu 2',7'-dichlórfluoresceínu (DCFA), ako je uvedené v časti Materiály a metódy. Astrocyty nasadené na 6-jamkové doštičky sa vopred ošetrili 30 minúty DCFA, potom sa 1 hodinu ošetrili 10 μM PEITC, 400 μM AITC alebo 25 μM SFN v prítomnosti H2O2 pri konečnej koncentrácii 100 μM . Astrocyty ošetrené samotným DCFA (CTRL) alebo 100 uM H202 predstavovali negatívnu a pozitívnu kontrolu. Fluorescenčný signál detegovaný v bunkových lyzátoch sa meral fluorometrom pri 525 nm pri excitácii pri 485 nm. Produkcia ROS bola vyjadrená ako percento (percento) intenzity fotoluminiscencie (PL) v porovnaní s pozitívnou kontrolou. Hodnoty sú priemer ± SD z n=3 experimentov uskutočnených na rôznych populáciách buniek. Štatisticky významný pokles v porovnaní s H2O2 je označený hviezdičkami (jednosmerná ANOVA nasledovaná Dunnetovým post hoc testom; *p <>

astrocytov v porovnaní s kontrolou (CTRL). Ako dokazuje pokles intenzity fluorescencie DCF, predbežné ošetrenie astrocytov zlúčeninami ITC pôsobilo proti tvorbe ROS indukovanej H2O2. Spomedzi testovaných ITC boli iba PEITC a SFN schopné významne znížiť produkciu ROS o približne 20 a 24 percent v porovnaní s pozitívnou kontrolou (H2O2).

Izotiokyanátové zlúčeniny inhibujú hladiny MMP-2 a MMP-9 v astrocytoch aktivovaných LPS

Účinok zlúčenín ITC na hladiny MMP{0}} a MMP{1}} sa hodnotil na astrocytoch aktivovaných LPS, o ktorom je známe, že indukuje expresiu želatináz (Gottschall a Deb 1996), a súčasne liečených AITC, PEITC alebo SFN v rozsahu koncentrácií, ktoré neboli toxické pre bunky. Ako je znázornené na obr. 3a, na géli boli prítomné dva jasné pásy štiepenia 72 a 92 kDa zodpovedajúce MMP-2 a MMP-9. Aktivácia astrocytov pomocou LPS zvýšila hladiny MMP-2 a vyvolala syntézu MMP-9. Liečba pomocou AITC (obr. 3b), PEITC (obr. 3c) alebo SFN (obr. 3d) určila dávkovo závislú

zníženie hladín MMP-9, ktoré sa líšili v závislosti od použitej zlúčeniny. Konkrétne, spomedzi použitých ITC bol SFN najúčinnejší pri inhibícii MMP-9, pretože určil 70 percentnú inhibíciu pri dávke 10 uM a 100 percentnú inhibíciu pri dávke 25 uM. Okrem toho iba SFN v maximálnej netoxickej koncentrácii bol schopný významne inhibovať MMP-2 (obr. 2d).

Izotiokyanátové zlúčeniny inhibujú expresiu génov MMP-2 a MMP-9 v astrocytoch aktivovaných LPS

Aby sa určilo, či študované zlúčeniny ITC boli schopné inhibovať expresiu MMP-2 a MMP-9, uskutočnila sa RT-PCR na astrocytoch aktivovaných LPS ošetrených maximálnou netoxickou koncentráciou ITC. Ako je znázornené na reprezentatívnych géloch na obr. 4a, ošetrenie LPS-aktivovaných astrocytov jednotlivými ITC bolo schopné pôsobiť proti zvýšenej expresii MMP-2 a MMP{8}} mRNA. Ako je znázornené na obr. 4b, kvantitatívna analýza výsledkov preukázala, že pri maximálnej netoxickej koncentrácii ITC zlúčeniny stanovili štatisticky významnú inhibíciu expresie MMP-2 a MMP-9 v porovnaní na pozitívnu kontrolu (LPS). Konkrétne, PEITC a SFN vykazujú rovnaké percento inhibície na MMP-2 (85 percent) a MMP-9 (100 percent), zatiaľ čo AITC bola pri inhibícii MMP menej účinná ako PEITC a SFN{{17} } (65 percent ) a MMP-9 (90 percent ).

ERK 1/2 sa podieľa na inhibícii expresie MMP prostredníctvom ITC

Keďže ERK 1/2 je hlavná signálna transdukčná dráha zapojená do regulácie expresie MMP-2 a MMP-9 v astrocytoch aktivovaných LPS (Lee et al. 2003), účinok zlúčenín ITC na testovala sa aktivácia extracelulárne regulovaných proteínkináz (ERK) 1/2.

Ako je znázornené na obr. 5, LPS indukoval štatisticky významné zvýšenie hladín fosforylovanej ERK 1/2 (p-ERK), proti ktorému pôsobilo predbežné ošetrenie zlúčeninami ITC.

Diskusia

Prevláda názor, že hlavné obranné stratégie proti mnohým ochoreniam spočívajú najmä vo vyhýbaní sa rizikovým faktorom a osvojení si správneho životného štýlu. Existuje množstvo vedeckých dôkazov, ktoré podporujú hypotézu, že niektoré prírodné metabolity, typicky produkované rôznymi druhmi ovocia a zeleniny, sú schopné modulovať patologické javy, ako je rakovina, neurologické ochorenia a iné multifaktoriálne ochorenia. V tomto scenári vzbudili veľký záujem izotiokyanáty (ITC) vzhľadom na ich protiplesňové, antibakteriálne,

Obr. 3 Účinok izotiokyanátových zlúčenín na hladiny MMP-2 a MMP-9 v astrocytoch aktivovaných LPS. V a je uvedený reprezentatívny zymografický gél analýzy kultivačných supernatantov z astrocytov aktivovaných LPS (10 ug ml-1) a súčasne ošetrených 20 hodín AITC, PEITC alebo SFN v uvedených koncentráciách (μM). Negatívne a pozitívne kontroly boli získané z nestimulovaných a neošetrených astrocytov v médiu bez séra (CTRL) a LPS-

aktivované bunky (LPS), resp. Histogramy b–d predstavujú výsledky (priemer ± SD) n {{0}} experimentov vykonaných na rôznych populáciách buniek, vyjadrené ako percento inhibície MMP v porovnaní s LPS, vypočítané po skenovacej denzitometrii a počítačovej analýze gélov . Štatisticky významný pokles v porovnaní s LPS je označený hviezdičkami (jednosmerná ANOVA nasledovaná Dunnetovým post hoc testom; *p < 0,05,="" **p=""><>

antikarcinogénne, antimutagénne, antioxidačné a protizápalové biologické vlastnosti (Dufour a kol. 2015; Marzocco a kol. 2015; Vig a kol., 2009; Talalay a Fahey 2001). Izotiokyanáty vznikajú enzymatickou degradáciou glukozinolátov (GSL), ktoré sú sekundárnymi metabolitmi prítomnými v 15 botanických čeľadiach radu Capparales a sú veľmi hojné v čeľade Brassicaceae (Fahey et al. 2001). GSL sú hydrolyzované myrozinázou (-tioglukozid glukohydroláza e; EC 3.2.3.147) v rôznych zložkách, ako sú ITC, dusitany, tiokyanáty, epitionitrily, SFGate, glukóza a oxazolidíny (Li a Kushad 2005). Hoci ITC boli rozsiahle študované v chemoterapeutickej oblasti (Grundemann a Huber 2018), vykonalo sa len málo výskumov o ich terapeutickom potenciáli pri neurologických ochoreniach napriek tomu, že sa preukázala schopnosť SFN a AITC prechádzať cez BBB a akumulovať sa v mozgovom parenchýme. (Clarke a kol. 2011; Jazwa a kol. 2011; Zhang 2010). V tomto článku sme porovnali účinky troch ITC,

prítomný v niekoľkých bežne konzumovaných krížových zeleninách, na produkciu reaktívnych foriem kyslíka (ROS) a expresiu matricovej metaloproteinázy (MMP) v in vitro modeli neurozápalu reprezentovaného astrocytmi aktivovanými lipopolysacharidom (LPS) alebo ošetrenými H2O2. Astrocyty, najrozšírenejší typ gliových buniek CNS, hrajú kľúčovú úlohu pri udržiavaní homeostázy mozgu a sú charakteristickým znakom rôznych neurologických ochorení (Cekanaviciute a Buckwalter 2016; Colombo a Farina 2016). Sú považované za kľúčové regulátory vrodenej imunitnej odpovede a ich reakcia na škodlivé urážky, ako je oxidačný stres, môže zhoršiť zápalové reakcie a poškodenie tkaniva alebo podporiť opravu tkaniva. Je dobre známe, že aktivované astrocyty produkujú neurotoxické faktory, ako sú MMP, ktoré majú kľúčovú úlohu pri podpore neurozápalu a progresívnej strate neurónov pri neurologických ochoreniach (Hsieh a Yang 2013). Preto modulácia

Obr. 4 Vplyv ITC zlúčenín na expresiu MMP-2 a MMP-9 v astrocytoch aktivovaných LPS. Astrocyty nasadené na 6-jamkové doštičky sa aktivovali LPS (10 ug ml-1) a súčasne sa na ne 20 hodín pôsobilo AITC (400 μM), PEITC (10 μM) alebo SFN (25 μM), potom sa podrobili RT-PCR. Reprezentatívne agarózové gély s expresiou MMP{12}} a MMP{13}} sú uvedené v (a). Histogramy v (b) predstavujú výsledky (priemer ± SD) n=3 experimentov vykonaných na rôznych bunkách

udalosti, ktoré nastanú po aktivácii astrocytov, by mohli zmierniť zápalovú odpoveď a poškodenie neurónov.

Výsledky tejto štúdie ukázali, že spomedzi študovaných ITC bol AITC menej toxický, pretože neviedol k žiadnemu zníženiu životaschopnosti buniek pri všetkých použitých koncentráciách. Na rozdiel od toho, podobne ako to, čo pozorovali iní autori na rôznych gliových bunkových líniách, PEITC a SFN vykazovali bunkovú toxicitu pri koncentráciách vyšších ako 10 a 25 uM, v danom poradí (Lee a kol. 2015; Eren a kol. 2018; Su a kol. 2015).

V súčasnej vedeckej literatúre existuje veľa kontroverzných údajov o molekulárnych mechanizmoch, ktoré sú základom účinkov ITC na životaschopnosť buniek. V tomto ohľade väčšina štúdií naznačila, že ITC inhibujú apoptózu indukujúcu bunkový rast, zastavenie bunkového cyklu, tvorbu ROS v rakovinových bunkách, ale nie v normálnych bunkách (Fofaria et al. 20}15; Qin et kol 2018; Sestili a Fimognari 2015). Zistili sme, že SFN a PEITC, ale nie AITC, majú ochrannú úlohu proti oxidačnému stresu v astrocytoch, skutočne pri maximálnych netoxických koncentráciách boli schopné pôsobiť proti produkcii ROS vyvolanej expozíciou H2O2. CNS je obzvlášť citlivá na oxidačný stres kvôli vysokej spotrebe kyslíka, slabým antioxidačným systémom a vysokému obsahu biomakromolekúl náchylných na oxidáciu. Predpokladá sa, že tvorba ROS a oxidačné poškodenie sa podieľajú na patogenéze neurologických porúch, ako je Alzheimerova choroba (AD), Parkinsonova choroba (PD), amyotrofická laterálna skleróza (ALS) a roztrúsená skleróza (MS) (Lee a kol. 2015). Preto, aj keď v našich in vitro experimentoch SFN a PEITC pôsobili proti produkcii ROS v miernom rozsahu, mohli by sme predpokladať, že in vivo dlhodobé podávanie ITC môže viesť k výraznejšiemu zníženiu ROS, čo môže časom viesť k zmysluplnému pre populácie vyjadrené ako percento inhibície MMP v porovnaní s pozitívnou kontrolou (LPS), vypočítané po skenovacej denzitometrii a počítačovej analýze gélov. Štatisticky významný pokles expresie MMP-2 a MMP{10}} v porovnaní s LPS je označený hviezdičkami (jednosmerná ANOVA nasledovaná Dunnetovým post hoc testom; *p <>

prevencia a modulácia mozgových chorôb. ROS pôsobí ako kritická signálna molekula na spustenie kaskády zápalovej odpovede do CNS. V tomto ohľade je dobre známe, že ROS reguluje expresiu mnohých génov zapojených do neurozápalu prostredníctvom aktivácie prozápalových transkripčných faktorov, ako je nukleárny faktor-KB (NF-KB) (Lee et al. 2015; Chiurchiù et al. 2016; Martorana a kol. 2019). V tomto scenári zohrávajú dôležitú úlohu MMP, ktorých expresia je up-regulovaná ROS prostredníctvom aktivácie NF-κB (Yan a Boyd 2007).

Keďže dysregulácia MMP prispieva k patogenéze mnohých neurozápalových a neurodegeneratívnych ochorení, ich inhibícia predstavuje dôležitú terapeutickú stratégiu. Z tohto dôvodu sa v poslednom desaťročí sústredil rastúci záujem na potenciál liečiv a prírodných zlúčenín inhibovať MMP. Početné štúdie in vitro dokázali, že protizápalové a antioxidačné pôsobenie niekoľkých liečiv a bioaktívnych zlúčenín prítomných v zelenine a morských organizmoch súvisí s ich schopnosťou inhibovať expresiu MMP (Latronico et al. 2016, 2018; Di Bari et al. 2015). V tejto štúdii sme preukázali, že spomedzi testovaných ITC boli SFN a PEITC najúčinnejšie pri inhibícii hladín a expresie MMP-2 a MMP-9 v astrocytoch aktivovaných LPS. Inhibícia MMP prostredníctvom ITC bola hlásená v iných štúdiách in vivo a in vitro. Najmä Li a kol. (2013) preukázali, že SFN je schopná zmierniť poškodenie BBB inhibíciou expresie MMP-9 v in vivo modeli experimentálnej autoimunitnej encefalomyelitídy. Iní autori uviedli, že SFN bol schopný zmierniť expresiu MMP-9 po poranení miechy u myší (Mao et al. 2010a). Okrem toho štúdie in vitro preukázali, že potlačenie migrácie buniek pomocou ITC a

Obr. 5 Extracelulárnym signálom regulovaná kináza 1/2 (ERK 1/2) sa podieľa na inhibícii expresie MMP zlúčeninami ITC. Reprezentatívne autorádiografické filmy analýzy westernovým prenosom lyzátov z astrocytov vopred ošetrených počas 1 hodiny pomocou AITC (400 μM), PEITC (10 μM) alebo SFN (25 μM) a potom aktivovaných počas 2 hodín pomocou LPS (10 ug ml{{ 13}}). Neošetrené a nestimulované bunky predstavujú negatívnu kontrolu (CTRL). Histogram v (b) predstavuje inváziu hladín pERK1/2 v bunkách gliómu C6, ktorá bola spojená s inhibíciou expresie MMP-9 sprostredkovanou NF-κB (Lee et al. 2015).

Molekulárne mechanizmy, ktorými ITC inhibujú MMP, sú nejasné a neexistujú žiadne štúdie skúmajúce antioxidačné a protizápalové vlastnosti ITC na primárne kultúry astrocytov. Niekoľko štúdií podporuje hypotézu, že inhibičný účinok ITC je dôsledkom ich schopnosti blokovať NF-KB signálnou dráhou Nrf2. V tomto ohľade in vivo štúdia dokazuje, že Nrf2 knockout myši boli náchylnejšie na NF-κB-sprostredkovanú zápalovú reakciu miechy a na zvýšenú expresiu NFκB-dependentných génov vrátane MMP-9 (Mao et al. 2010b ). Aj keď sa dráhy NF-KB a Nrf2 mohli vzájomne prelínať, preukázali sme, že k regulácii NF-KB dochádza aj prostredníctvom modulácie molekulárnych mechanizmov, ktoré sú nezávislé od Nrf2. Zistili sme, že AITC, PEITC a SFN inhibovali aktiváciu ERK1/2, ktorá hrá kľúčovú úlohu v kaskáde udalostí prenosu signálu, ktoré v konečnom dôsledku regulujú transkripciu génu MMP.

Experimentálny dôkaz, že SFN v maximálnej netoxickej koncentrácii úplne inhiboval expresiu aj hladiny MMP-9, zatiaľ čo AITC a PEITC maximálne inhibovali expresiu MMP-9, ale iba znížili MMP{{3} } na približne 50 percent, môže naznačovať, že tieto zlúčeniny modulujú transkripciu MMP-9 rôznymi mechanizmami účinku. V tomto ohľade sa uvádza, že SFN okrem inhibície aktivácie NF-KB indukovanej LPS interferuje s väzbou LPS na receptor TLR4 (Koo et al 2013). Inhibičný účinok SFN na TLR4 by mohol zabrániť aktivácii astrocytov pomocou LPS, čo môže viesť k upstream inhibícii expresie MMP{11}} s následným nedostatkom produkcie MMP{12}}.

získané po denzitometrickom skenovaní autorádiografických filmov a normalizácii na nefosforylovanú ERK 1/2. Údaje predstavujú priemer ± SD z n=3 experimentov uskutočnených na rôznych populáciách buniek. Hviezdičky predstavujú hodnoty štatisticky odlišné od pozitívnej kontroly (astrocyty aktivované LPS), ktorá bola nastavená na 100 percent (jednosmerná ANOVA nasledovaná Dunnettovým viacnásobným porovnávacím post hoc testom; *p <>

Závery

Stručne povedané, naše údaje naznačujú, že ošetrenie astrocytov pomocou ITC znižuje tvorbu ROS a inhibuje uvoľňovanie MMP-2 a MMP-9, čo poskytuje nový pohľad na antioxidačné a protizápalové vlastnosti ITC na gliové bunky bunky. Tieto výsledky naznačujú, že ITC by mohli byť sľubnými nutraceutickými činidlami pre vývoj neuronutričných intervencií založených na používaní zdravých potravín na prevenciu a doplnkovú liečbu neurologických ochorení.

Financovanie Financovanie s otvoreným prístupom poskytuje Università Degli Studi di Bari Aldo Moro v rámci dohody CRUI-CARE.

Dodržiavanie etických noriem

Konflikt záujmov Autori nevyhlasujú žiadny konflikt záujmov.

Otvorený prístup Tento článok je licencovaný na základe Creative Commons Attribution 4.{1}} Medzinárodná licencia, ktorá povoľuje používanie, zdieľanie, adaptáciu, distribúciu a reprodukciu na akomkoľvek médiu alebo formáte, ak uvediete pôvodného autora (s) a zdroj, uveďte odkaz na licenciu Creative Commons a uveďte, či boli vykonané zmeny. Obrázky alebo iný materiál tretích strán v tomto článku sú zahrnuté v licencii Creative Commons článku, pokiaľ nie je uvedené inak v úverovom limite k materiálu. Ak materiál nie je zahrnutý v licencii Creative Commons k článku a vaše zamýšľané použitie nie je povolené zákonnými predpismi alebo prekračuje povolené použitie, budete musieť získať povolenie priamo od držiteľa autorských práv. Ak chcete zobraziť kópiu tejto licencie, navštívte stránku http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.