NGF moduluje metabolizmus cholesterolu a stimuluje sekréciu ApoE v gliových bunkách, čím poskytuje neuroprotekciu proti oxidačnému stresu, časť 2

2.6. NGF-sprostredkovaná sekrécia ApoE pomocou U373 chráni neurónové bunky pred oxidačným poškodením

Hromadné dôkazy poukazujú na to, že ApoE zvyšuje odolnosť neurónov voči oxidačným inzultom, čím zabraňuje apoptóze a neurodegenerácii [17,18,37]. V tejto súvislosti sme hodnotili, či NGF-indukovaná sekrécia ApoE bunkami U373 môže chrániť neuróny N1E-115 pred oxidačným stresom. Plne diferencované N1E-115 boli vopred ošetrené rotenónom, ktorý indukuje oxidačný stres inhibíciou mitochondriálneho komplexu I.

Apoptóza je proces sebadeštrukcie a je to dôležitý spôsob, akým si bunky za určitých okolností udržiavajú homeostázu tela prostredníctvom naprogramovanej sebadeštrukcie. Apoptóza hrá v rôznych fázach života rôzne úlohy.

Nedávne štúdie ukázali, že existuje určitý vzťah medzi apoptózou a pamäťou. Už vieme, že pamäť je komplexný nervový proces v mozgu, ktorý zahŕňa spojenia a koordináciu medzi viacerými oblasťami mozgu. Apoptóza môže hrať úlohu v tomto nervovom procese.

Na jednej strane môže apoptóza stabilizovať sieťovú štruktúru neurónov vyčistením nepotrebných neurónov a synapsií, čím sa spoje neurónov prepracujú, čím sa zlepší kvalita a účinnosť pamäte. Na druhej strane nadmerná apoptóza môže viesť aj k zníženiu počtu mozgových buniek, čo môže negatívne ovplyvniť ukladanie a zachytávanie spomienok.

Preto pri zachovaní primeranej úrovne apoptózy môžeme zlepšiť pamäť prostredníctvom série správania a zručností, ako je čítanie, učenie, cvičenie a úprava myslenia. Toto správanie a zručnosti môžu podporiť rast a spojenie mozgových buniek a zlepšiť kvalitu a účinnosť pamäte stimuláciou spojení a koordinácie medzi mozgovými neurónmi.

Záverom, vzťah medzi apoptózou a pamäťou je zložitý. Iba pri zachovaní správnej apoptózy môžeme stimulovať náš mozog a zlepšiť našu pamäť prostredníctvom rôznych spôsobov správania a zručností. Z tohto hľadiska si musíme zlepšiť pamäť. Cistanche deserticola nám môže výrazne pomôcť zlepšiť pamäť, pretože Cistanche deserticola dokáže regulovať aj rovnováhu neurotransmiterov, ako je zvýšenie hladín acetylcholínu a rastových faktorov. Tieto látky sú dôležité pre pamäť. Je to veľmi dôležité pre učenie a učenie. Navyše mäso z mäsa môže tiež zlepšiť tekutosť krvi a podporiť transport kyslíka, čo môže zabezpečiť, že mozog dostane dostatok živín a energie, čím sa zlepší mozgová vitalita a vytrvalosť.

Kliknite na vedieť doplnky na zlepšenie pamäte

Po 16 hodinách vystavenia rotenónu sa neuróny N1E-115 kultivovali v čerstvom médiu (Ctrl), upravenom médiu z buniek U373 (U373-Ctrl), upravenom médiu z U373 vopred ošetrenom NGF počas 48 hodín (U373-NGF), alebo upravené médium z ApoE-umlčaného U373 vopred ošetreného NGF počas 48 hodín (U373-NGF ApoE siRNA). Predbežná úprava rotenónom výrazne znížila počet N1E-115 kultivovaných v kontrolnom médiu, čo naznačuje, že podávanie tohto pesticídu vážne ovplyvňuje prežitie N1E{18}}.

Rotenónová cytotoxicita tiež určovala intenzívnu retrakciu neuritov, ako bolo pozorované podľa dĺžky neuritov. Poškodenie neuritov vyvolané liečbou rotenónom bolo obzvlášť evidentné pri hodnotení buniek nesúcich neurity, keďže počet N1E-115 s neuritmi klesol na 50 %. Podobné výsledky sa získali, keď sa bunky N1E-115 kultivovali v kondicionovanom médiu U373-Ctrl, čo naznačuje, že prítomnosť supernatantu odvodeného z nestimulovaných astrocytov nie je dostatočná na ochranu neurónových buniek pred toxicitou sprostredkovanou rotenónom. Nanešťastie, aplikácia kondicionovaného média odvodeného z U373 ošetreného NGF účinne zabránila smrti neurónov, ako aj zníženiu počtu buniek nesúcich neurity a dĺžky neuritov spôsobeného podávaním rotenónu (obrázok 5).

Ešte dôležitejšie je, že kondicionované médium odvodené od ApoE-umlčaných buniek U373 úplne stratilo priaznivé účinky vyvolané d médiom upraveným U373-NGF, čo naznačuje, že neuroprotekcia je riadená uvoľňovaním ApoE v kultivačnom médiu sprostredkovaným NGF. Pozoruhodné je, že kondicionované médium z U373 ošetreného NGF transfekovaného zmiešanou siRNA si plne zachovalo ochranné účinky, ktoré má kondicionované médium U373-NGF, čo dokazuje, že strata neuroprotekcie pozorovaná v kondicionovanom médiu z buniek umlčaných ApoE je účinne závislá od ApoE downregulácia (obrázok S3C).

Obrázok 5. Účinky média upraveného U373 na oxidačný stres v neurónoch. Reprezentatívne snímky vo svetlom poli a kvantitatívne hodnotenie morfológie neurónov N1E-115. Bunky boli predtým ošetrené (+) alebo nie (-) rotenónom (0.1 µM) počas 16 hodín a potom kultivované v čerstvom DMEM (Ctrl), v upravenom médiu odvodenom z kontroly U373 (U{{ 9}Ctrl), U373 vopred ošetrený NGF (U373-NGF) a U373 vopred ošetrený NGF umlčaný pre apoE (U373-NGF ApoE siRNA) počas 48 hodín. n=5 rôznych experimentov. Údaje predstavujú priemer ± SD. Štatistická analýza bola hodnotená použitím jednosmernej ANOVA, po ktorej nasledoval Tukeyho post hoc test. ** p < 0.01, *** p < 0,001.

Na posilnenie výsledkov získaných z upraveného média sme uskutočnili kokultivácie U373/N1E115. Na začiatok boli bunky U373 vopred ošetrené alebo neošetrené NGF počas 48 hodín. Okrem toho boli diferencované bunky N1E-115 vopred ošetrené alebo neošetrené rotenónom počas 16 hodín. Následne sa médium U373 nahradilo čerstvým médiom obsahujúcim 0,5 % FBS a krycie sklíčka naočkované N1E-115 sa preniesli na vrstvu U373, aby sa pripravili spoločné kultúry (obrázok 6A).

Oxidačné poškodenie vyvolané liečbou rotenónom značne ovplyvnilo bunky nesúce viabilineurity a dĺžku neuritov kontrolných N1E-115 a N1E-115 spoločne kultivovaných s U373-Ctrl astrocytmi (obrázok 6B). V súlade s experimentmi s kondicionovaným médiom boli bunky N1E-115 spoločne kultivované s bunkami U373-NGF chránené pred oxidačným poškodením, zatiaľ čo umlčanie ApoE v U373 zrušilo neuroprotekciu udržiavanú NGF.

Obrázok 6. Sekrécia ApoE bunkami U373 ošetrenými NGF poskytuje neuroprotekciu pred oxidačným stresom. (A) Reprezentatívna schéma kokultúr astrocytov a neurónov zostavená tak, ako je opísané v časti Materiály a metódy. Bunky nesúce neurity, dĺžka neuritov a počet buniek sa hodnotili hodiny po vytvorení spoločnej kultúry. (B) Reprezentatívne snímky vo svetlom poli a kvantitatívne hodnotenie morfológie neurónov buniek N1E-115, predtým ošetrených (+) alebo neošetrených (-) rotenónom (0,1 µM) počas 16 hodín.

N1E-115 sa potom uchovávali v čerstvom DMEM (Ctrl) alebo sa kultivovali spoločne s kontrolným U373 (U373-Ctrl), U373 vopred ošetreným NGF (U373-NGF) a U373 vopred ošetrený NGF umlčaný pre ApoE (U373-NGF ApoE siRNA) počas 48 hodín. n=5 rôznych experimentov. Údaje predstavujú priemer ± SD. Štatistická analýza sa uskutočnila s použitím jednosmernej ANOVA, po ktorej nasledoval Tukeyho post hoc test. * p < 0.05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.

3. Diskusia

Nerovnováha v neurotrofínových signálnych dráhach, ako aj zmeny v metabolizme cholesterolu v mozgu, sú silne spojené s neurologickými a neurodegeneratívnymi ochoreniami, ako je Rettov syndróm, HD, Alzheimerova choroba (AD) a Parkinsonova choroba (PD) [2,38,39]. . V tomto kontexte je základný výskum biologickej aktivity neurotrofínov kľúčový pre rozbor molekulárnych mechanizmov spájajúcich metabolizmus cholesterolu a fyziopatológiu mozgu. Počas niekoľkých posledných rokov jedna zaujímavá štúdia uvádzala úlohu BDNF v regulácii metabolizmu cholesterolu v astrocytoch [38].

Napriek tejto predstave nie sú dostupné žiadne informácie o údajnom zapojení NGF do regulácie astrocytického cholesterolu. Preto sme sa v tejto práci zamerali na perspektívnu úlohu, ktorú má NGF pri regulácii metabolizmu cholesterolu, s osobitným odkazom na vplyv sekrécie ApoE na neuronálnu diferenciáciu a prežitie. U373, bunková línia astrocytómu používaná ako experimentálny model ľudských astrocytov, si zachováva potenciál úplne reagovať na NGF, pretože exprimuje značné hladiny TrkA aj p75NTR.

Hlavné výsledky ukázali, že NGF upreguluje hladiny hlavných proteínov zapojených do biosyntézy cholesterolu (HMGCR), intracelulárneho prenosu (NPC1) a sekrécie (ABCA1). Tieto udalosti sú sprevádzané súčasným zvýšením ApoE a cholesterolu lein do kultivačného média, čo naznačuje, že NGF zvyšuje biosyntézu cholesterolu a extrúziu z gliových buniek. Bolo publikované, že NGF indukuje expresiu proteínu ApoE zvýšením jeho transkripcie [40]. Nepozorovali sme však žiadnu významnú zmenu v intracelulárnej expresii ApoE. Túto zjavnú nekonzistentnosť možno vysvetliť, pretože nahromadenie ApoE nemožno oceniť kvôli jeho zvýšenému odtoku z UIn ošetreného NGF
V snahe lepšie rozobrať molekulárne mechanizmy sme ošetrili U373 s LM11A-31 a zistili sme, že modulátor p75NTR bol schopný iba napodobňovať nárast expresie HMGCR sprostredkovaný NGF. Účasť p75NTR na modulácii hladín HMGCR je v súlade s predchádzajúcimi údajmi získanými v iných typoch buniek, čo ukazuje, že tento receptor riadi transkripciu cholesterogénnych enzýmov [41]. Avšak LM11A-31 neindukoval žiadne zmeny ani v iných proteínoch analyzovaných v tejto štúdii, vrátane ABCA1, ani v hladinách cholesterolu a ApoE v kultivačnom médiu, čo naznačuje, že selektívna modulácia p75NTR nie je dostatočná na podporu cholesterolu extrúzia cez častice bohaté na ApoE pozorovaná v bunkách ošetrených NGF. Tieto výsledky nás vedú k hypotéze, že NGF riadi metabolizmus cholesterolu v gliových bunkách prostredníctvom zapojenia receptorov p75NTR aj TrkA.

Je dobre známe, že väzba neurotrofínu na Trk receptory aktivuje ERK1/2, čím reguluje niekoľko dráh zapojených do bunkovej diferenciácie, proliferácie a prežitia [2,38]. Je zaujímavé, že bolo pozorované, že aktivácia ERK1/2 tiež reguluje expresiu ABCA1 a ApoE v rôznych typoch buniek [38,42,43]. Tieto zistenia spolu s dôkazom, že os BDNF/TrkB/ERK podporuje extrúziu ApoE a expresiu ABCA1 v gliových bunkách [38], naznačujú, že dráha prenosu signálu zahŕňajúca os TrkA/ERK môže vysvetliť časť účinkov vyvolaných NGF v našej štúdii.

Zatiaľ čo pri raste neuritov neboli pozorované žiadne zmeny, použitie U373- kondicionovaného média a zavedenie kokultivačných experimentov naznačilo, že zvýšená sekrécia ApoE z gliových buniek sprostredkovaná NGF je určujúca na zabránenie škodlivým výsledkom vyvolaným oxidačným stres v neurónových bunkách. Na vyvolanie cytotoxicity sme použili rotenón, pesticíd bežne používaný v predklinickom výskume na vyvolanie reaktívnych foriem kyslíka odvodených od mitochondrií (ROS) a následnej apoptózy [44].

Naše výsledky zdôrazňujú, že NGF stimuluje sekréciu ApoE gliovými bunkami, čo je nevyhnutné na zaručenie neuroprotektívnych účinkov proti podávaniu rotenónu v diferencovaných N1E-115 bunkách. Úloha ApoE pri prevencii oxidačného stresu je dobre zdokumentovaná. Napríklad deplécia ApoE u myších modelov zhoršuje oxidačné poškodenie v mozgovom tkanive [45,46]. Podávanie exogénneho ApoE teda chráni pred ireverzibilným oxidačným poškodením pri liečbe peroxidom vodíka tým, že pôsobí proti sekundárnej toxicite glutamátu [18]. Okrem toho lipoproteíny obsahujúce ApoE sú účinné pri zoslabovaní apoptózy indukovanej stiahnutím trofickej podpory v neurónoch ganglií sietnice [47].

V našej štúdii použitie rotenónu naznačuje, že neuroprotekcia sprostredkovaná ApoE, podporovaná gliovými bunkami stimulovanými NGF, môže byť relevantná v kontexte neurodegeneratívnych stavov, ako je PD. Je pozoruhodné, že rotenón reprodukuje dopamínergnú neuronálnu degeneráciu podobnú tej, ktorá sa pozoruje pri PD, a to na zvieracích modeloch aj na bunkových kultúrach vrátane neurónov odvodených od N1E-115- [48–50]. V súlade s tým naše výsledky podporujú predchádzajúce dôkazy ukazujúce, že ApoE vyvoláva neuroprotekciu po podaní 6-hydroxydopamínu (6-OHDA), ďalšieho neurotoxínu schopného vyvolať fenotyp podobný PD [51]. Naša štúdia spoločne ukazuje, že NGF je kľúčovým modulátorom metabolizmu cholesterolu a extrúzie ApoE z gliových buniek. Najdôležitejšie je, že zvýšenie sekrécie ApoE podporované týmto neurotrofínom je potrebné na zabezpečenie neuroprotekcie proti cytotoxicite rotenónu.

BDNF je najhojnejší neurotrofín v mozgu dospelých. Napriek týmto dôkazom sa ukázalo, že NGF môže hrať kľúčovú úlohu nielen počas vývoja, ale aj v centrálnom nervovom systéme dospelých. Napríklad NGF ovplyvňuje aktivitu hipokampu a v dôsledku toho aj priestorovú pamäť a učenie [52]. Ďalšie zistenia naznačujú, že NGF vykazuje neuroprotektívny účinok na nigrostriatálne dopaminergné neuróny a že táto aktivita môže položiť základ pre nové terapeutické prístupy pre PD založené na NGF [53].

Podľa tejto predstavy sa ukázalo, že produkcia NGF je hlboko regulovaná v astrocytoch počas dospelosti a má modulačné účinky na neurozápal, poranenie mozgu a neurodegeneráciu [54–56]. V tejto súvislosti by bolo zaujímavé v budúcich štúdiách vyhodnotiť, či by tieto účinky mohli byť aspoň čiastočne sprostredkované moduláciou gliového cholesterolu podporovanou NGF. Súčasná práca predstavuje niektoré obmedzenia, ktoré by sa mali prekonať pri ďalších experimentálnych výskumoch; napríklad by bolo dôležité lepšie rozobrať molekulárne mechanizmy spájajúce liečbu NGF a metabolizmus cholesterolu v gliových bunkách.

Široké porozumenie je užitočné na identifikáciu špecifických molekulárnych cieľov prístupných farmakologickej manipulácii, ktoré by sa mohli použiť v neurodegeneratívnych kontextoch. Okrem toho, hoci sa bunky U373 a N1E-115 široko používajú ako zvládnuteľné bunkové línie na reprodukciu astrocytických a neurónových znakov [27–29,57], tieto zistenia by sa mali ďalej potvrdiť v primárnych bunkových kultúrach. Hoci by sa malo vynaložiť ďalšie úsilie na posilnenie zapojenia neurotrofínovej signalizácie do homeostázy cholesterolu v mozgu, táto práca prvýkrát ukazuje, že NGF môže nepriamo vykonávať neuroprotekciu ovplyvňovaním metabolizmu gliového cholesterolu.

4. Materiál a metódy

4.1. Bunková kultúra

Bunky neuroblastómu N1E-115 a bunky U373 sa kultivovali pri 5 % CO2 v DMEM pri vysokej glukóze (Merck Life Science, Miláno, Taliansko), s 10 % (v/v) fetálnym bovinným sérom (FBS) (Merck Life Science , Miláno, Taliansko) a pridal sa roztok penicilín/streptomycín.

Na vyvolanie diferenciácie neurónov sa bunky N1E-115 naočkovali pri 30% konfluencii a prešli na DMEM s 0,5% FBS na 96 hodín.

Na vyvolanie diferenciácie neurónov sa bunky N1E-115 naočkovali pri 30% konfluencii a prešli na DMEM s 0,5% FBS na 96 hodín.

Spoločné kultúry astrocytov a neurónov boli vytvorené podľa protokolu opísaného Ioannouom a kolegami s modifikáciami [59]. Parafínové rozpery boli natlačené na krycie sklíčka, aby sa zabezpečila priľnavosť; použili sme rozpery na neurónové krycie sklíčka, aby sme účinne zabránili mechanickému poškodeniu, keď boli bunky umiestnené oproti sebe. Krycie sklíčka boli potom sterilizované v etanole a potiahnuté poly-D-lyzínom (Merck Life Science, Miláno, Taliansko). N1E-115 sa naočkovali na potiahnuté krycie sklíčka v požadovanej hustote a keď boli pripravené na spoločnú kultiváciu, použili sa sterilné kliešte na zdvihnutie krycích sklíčok s neurónmi N1E{8}} a ich umiestnenie lícom nadol do { {10}}jamky naočkované astrocytmi U373.

Predbežné ošetrenie buniek N1E-115 sa uskutočnilo podávaním 0,1 uM rotenónu (Sigma-Aldrich, Miláno, Taliansko, R8875) počas 16 hodín. Kontrolné bunky dostali DMSO (riedenie 1:1000 v médiu bunkovej kultúry) ako vehikulum. Bunky U373 boli ošetrené NGF (Alomone Labs, Jerusalem, Israel, N-245) v dávke 100 ng/ml počas 48 hodín vo všetkých experimentoch.

4.2. Príprava lyzátu a Western blot analýza

Bunky U373 boli sonikované (pracovný cyklus 20 %, výstup 3) vo vzorkovom pufri (0,1 Tris-HClisHCl obsahujúci 10 % SDS, koktail inhibítora proteázy, pH 6,8), aby sa získal celkový lyzát, ako už bolo opísané [ 60,61]. Pridal sa Laemmliho pufor a vzorky sa denaturovali pri 95 °C počas 5 minút. Proteínové extrakty (dvadsať mikrogramov proteínov) sa rozdelili na SDS-PAGE a prenos na nitrocelulózovú membránu sa uskutočnil pomocou systému trans-blot turbo prenosu (Biorad Laboratories, Miláno, Taliansko), ako už bolo uvedené [62].

Následne bola membrána inkubovaná pri teplote miestnosti počas 1 hodiny s 5 % odtučneným sušeným mliekom v Tris-pufrovanom fyziologickom roztoku (25 mM Tris-HCl, 138 mM NaCl, 27 mM KCl, 0,05 % Tween{ {10}}, pH 6,8) a sondovali cez noc pri 4 ◦C s nasledujúcimi primárnymi protilátkami: anti-p75NTR (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-271708, riedenie 1:500), anti- TrkA (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-118, riedenie 1:500), anti-SREBP-1 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-8984 , riedenie 1:1000), anti-SREBP-2 (Abcam, Cambridge, Spojené kráľovstvo, ab30682, riedenie 1:1000), anti-HMGCR (Abcam, Cambridge, Spojené kráľovstvo, ab242315, riedenie 1:1000), anti-LDLr (Abcam, Cambridge, Spojené kráľovstvo, ab30532, riedenie 1:500), anti-NPC1 (Novus Biologicals, Centennial, CO, USA, NB400-148, riedenie 1:3000 ), antiABCA1 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-58219, riedenie 1:400), anti-ApoE (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc{51}}, riedenie 1 :400), anti-vinkulín (SigmaAldrich, Miláno, Taliansko, V9264, riedenie 1:10 000) a anti{59}}aktín (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-47778, riedenie 1 :10 000).

Membrány sa postupne inkubovali počas 1 hodiny pri teplote miestnosti s HRP-konjugovanými sekundárnymi anti-myšími alebo anti-králičími protilátkami (Bio-Rad Laboratories, Miláno, Taliansko). Protilátky naviazané na proteín sa vizualizovali pomocou čírosti ECL Western blotting (Bio-Rad Laboratories, Miláno, Taliansko, č. 1705061) a chemiluminiscencia sa registrovala prostredníctvom systému ChemiDoc MP (Bio-Rad Laboratories, Miláno, Taliansko). Potom sa uskutočnila denzitometrická analýza odvodená z Western blotov s použitím softvéru ImageJ verzie 1.52t (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) pre Windows. Vinculin alebo -aktín boli použité ako upratovacie proteíny, ktoré slúžili ako interné kontroly na nakladanie proteínov. Denzitometrické výpočty boli získané ako arbitrárne jednotky odvodené z pomeru medzi intenzitou proteínového pásu a príslušným housekeeping proteínom.

4.3. Farbenie olejovou červenou O

Bunky U373 sa naočkovali na krycie sklíčka potiahnuté poly-L-lyzínom (Sigma-Aldrich, P6282-5MG) v 6-jamkových platniach a farbenie olejovou červeňou O sa uskutočnilo, ako už bolo uvedené [60]. V stručnosti, bunky boli fixované v paraformaldehyde (4% roztok) počas 10 minút a jemne premyté trikrát PBS. Fixované bunky sa inkubovali so 60% izopropanolom počas 5 minút a potom sa premyli destilovanou vodou. Následne sa bunky sondovali s 1 ml pracovného roztoku Oil Red O (Sigma-Aldrich, O1391-250ML) počas 15 minút pri teplote miestnosti umiestnením 6-jamkovej platne na orbitálnu rotátorovú trepačku. Po inkubácii s farbiacim roztokom sa jamky trikrát premyli destilovanou vodou, aby sa odstránilo prebytočné farbivo.

Krycie sklíčka sa nakoniec namontovali pomocou montážneho média Fluoroshield (Sigma-Aldrich, F6182) a autofluorescencia Oil red O sa vizualizovala pomocou konfokálnej mikroskopie (TCS SP8; Leica, Wetzlar, Nemecko). Obrázky boli zachytené pomocou Leica TCS SP8 vybaveného 63-násobným zväčšením a softvérom Leica LAS X (Milán, Taliansko). Kvantifikácia farbenia olejovou červeňou O sa uskutočnila pomocou softvéru ImageJ pre Windows a vypočítala sa ako priemerná intenzita fluorescencie na oblasť buniek.
4.4. Filipínske farbenie

Filipínske farbenie sa uskutočňovalo s použitím filipínskeho komplexu (Sigma-Aldrich, F9765). Filipínsky zásobný roztok (10 mg/ml v PBS) bol vždy pripravený bezprostredne pred použitím. Bunky boli fixované v paraformaldehyde (4% roztok) počas 10 minút a premyté PBS. U373 sa potom farbili s 1 ml pracovného roztoku Filipin (0,05 mg/ml v PBS) počas 1 hodiny v tme pri teplote miestnosti. Následne boli bunky trikrát premyté PBS a krycie sklíčka boli pripevnené montážnym médiom Fluoroshield a okamžite analyzované pomocou konfokálnej mikroskopie s použitím sady UV filtrov (340–380 nm excitácia). Obrázky boli získané pri 40-násobnom zväčšení. Filipínska kvantifikácia sa vypočítala ako priemerná intenzita fluorescencie na oblasť buniek pomocou softvéru ImageJ pre Windows.

4.5. Kvantifikácia cholesterolu

Kvantifikácia cholesterolu sa uskutočnila pomocou kolorimetrického testu (Cholesterol Quantitation Kit, MAK043, Sigma-Aldrich, Miláno, Taliansko) podľa pokynov výrobcu.

4.6. ELISA
Hladiny ApoE v kultivačnom médiu boli hodnotené pomocou súpravy Human Apolipoprotein E ELISA Kit (Abcam, Cambridge, UK, ab108813), podľa pokynov výrobcu.

4.7. Imunofluorescencia

Imunofluorescencia buniek U373 sa uskutočnila tak, ako už bolo opísané [60]. U373 boli fixované v paraformaldehyde (4 % v PBS) a testované cez noc s primárnymi protilátkami: anti-p75NTR (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc{6}}, riedenie 1:100) a anti-TrkA ( Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc{10}}, riedenie 1:100). Následne boli bunky inkubované 1 hodinu s kozou anti-myšou sekundárnou protilátkou Alexa Fluor 555 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA, A28180) a kozou anti-králičou sekundárnou protilátkou Alexa Fluor 488 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA , A27034). Vykonalo sa farbenie DAPI na vizualizáciu jadier a krycie sklíčka sa nakoniec namontovali pomocou montážneho média Fluoroshield. Vzorky sa analyzovali konfokálnou mikroskopiou, ako je opísané vyššie.

4.8. Umlčanie ApoE

Umlčanie ApoE mRNA sa uskutočnilo na bunkách U373 s použitím ApoE siRNA (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-29708) podľa pokynov výrobcu. Transfekcia sa uskutočnila v 6-jamkovej platni pre tkanivové kultúry, kde sa 100000 buniek na jamku vysialo do rastového média DMEM bez antibiotík doplneného 10 % FBS počas 24 hodín. Pre každú jamku sa do roztoku siRNA Transfection Reaction, pripraveného s použitím duplexu siRNA a siRNA transfekčného činidla (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, pridalo transfekčné médium siRNA (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc{8}}), USA, sc29528). Bunky sa potom raz premyli transfekčným médiom siRNA a prekryli sa predtým vyrobenou transfekčnou zmesou. Následne bola kultivačná platňa inkubovaná počas 7 hodín pri 37 °C v inkubátore s 5 % CO2.

Rastové médium DMEM s 20 % FBS a antibiotikami (2-násobok normálnej koncentrácie) sa pridalo do transfekčnej zmesi v každej jamke v pomere 1:1. Bunky boli inkubované počas 18 hodín a potom bolo médium vypustené a nahradené čerstvým normálnym rastovým médiom; 24 hodín po tomto poslednom kroku boli bunky pripravené na použitie na ďalšie experimenty. Účinnosť umlčania ApoE sa hodnotila pomocou RT-qPCR v bunkách U373 a pomocou ELISA v bunkovom supernatante; ApoE siRNA účinne zabránila indukcii ApoE prostredníctvom NGF v porovnaní so zmiešanou siRNA (ApoE mRNA: 83 % pokles; ApoE ELISA: 78 % pokles). Je pozoruhodné, že expresia ApoE po umlčaní siRNA bola nižšia ako základné hladiny expresie pozorované v kontrolnom U373 (ApoE mRNA: 72 % zníženie; ApoE ELISA: 58 % zníženie) (obrázok S 3A, B).

4.9. Extrakcia RNA a PCR v reálnom čase

Analýza mRNA sa uskutočnila tak, ako už bolo uvedené [22,63]. Stručne, celková RNA z buniek U373 sa extrahovala s TRI činidlom (Merck Life Science, Miláno, Taliansko) podľa pokynov výrobcu. Uskutočnilo sa ošetrenie DNAázou (Ambion, Thermo Fisher Scientific, Miláno, Taliansko) a potom sa RNA purifikovala pomocou súpravy na čistenie RNA (Zymo, Taliansko). RNA sa postupne reverzne transkribovala na cDNA pomocou vysokokapacitnej cDNA reverznej transkripčnej bunkovej súpravy (Applied Bio-System, Foster City, CA, USA) a použila sa na analýzu qPCR.

Priméry použité v qRT-PCR pre apoE boli: forward 5 0 -GGGTCGCTTTTGGGATTACCTG-30 a reverzný 50 -CAACTCCTTCATGGTCTCGTCC3 0. Priméry použité v qRT-PCR pre gapdh (vybrané ako referenčný gén) boli: forward 50 - GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-30 a reverzný 50 -ACCACCCTGTTGCTGTAGCCA-30. Produkcia správneho amplikónu bola hodnotená vyhodnotením krivky topenia. Každá biologická vzorka bola testovaná v troch vyhotoveniach so zeleným IQ činidlom SYBR (Bio-Rad Laboratories, Miláno, Taliansko) a s použitím detekčného systému CFX Connect (Bio-Rad Laboratories, Miláno, Taliansko).

4.10. Kvantitatívne hodnotenie neuronálnej morfológie

Neurónová morfológia v bunkách N1E-115 bola odhadnutá zachytením obrázkov pomocou inverzného mikroskopu. Morfometrická analýza sa uskutočnila pomocou softvéru ImageJ pre Windows a odhadol sa počet celkových buniek (vyjadrené ako percentuálna odchýlka kontroly), priemerná dĺžka neuritov (vyjadrená ako percento kontroly) a bunky nesúce neurity. Pre bunky nesúce neurity sa percento vypočítalo vydelením počtu diferencovaných buniek celkovým počtom buniek na pole. N1E-115 boli deva diferencované, keď mali aspoň jeden neurit a s dĺžkou rovnou alebo väčšou ako je priemer soma. Morfologické vyhodnotenie sa uskutočnilo na najmenej piatich nezávislých experimentoch, v ktorých sa analyzovali najmenej tri obrázky.

4.11. Štatistická analýza

Všetky výsledky prezentované v tejto štúdii boli vyjadrené ako priemer ± SD (štandardná odchýlka normálnej distribúcie údajov bola skontrolovaná pomocou Shapiro–Wilkovho testu. Keď sa porovnávali dve experimentálne skupiny, použili sa nepárové testy. Ak však tri alebo viac skupín Boli porovnané jednosmerná analýza rozptylu (ANOVA) nasledovaná Tukeyho post hoc testom.Pokiaľ ide o experimenty s rotenónom, kde boli prítomné dve premenné, bola použitá dvojcestná ANOVA nasledovaná Bonferroniho post-testom. p < 0.05 sa považovali za štatisticky odlišné. Štatistická analýza sa uskutočnila pomocou GraphPad Prism 5 (GraphPad, La Jolla, CA, USA) pre Windows.

Príspevky autora:

Konceptualizácia, MS; metodika, MS a MC; validácia, MS a MC; formálna analýza, MS, MC, DP a MP; vyšetrovanie, MC, NM, LL, MP a DP; zdrojov, MS a VP; spracovanie údajov, MS a MC; písanie – príprava pôvodného návrhu, MS a MC; písanie—recenzia a úprava, MP, LL, DP, NM a VP; vizualizácia, MS, MC a MP; dozor, MS; administrácia projektov, MS; získanie financií, MS Všetci autori si prečítali a súhlasili s publikovanou verziou rukopisu.

Financovanie:

Tento výskum bol financovaný z Fondov pre výskum rezortu 2021 (University of Molise) pre MS a z výzvy Nadácie Jeromea Lejeuna na grantové zasadnutie 2021a, #2043 pre MS

Vyhlásenie inštitucionálnej revíznej rady:

Nepoužiteľné.

Vyhlásenie informovaného súhlasu:

Nepoužiteľné.

Vyhlásenie o dostupnosti údajov:

Nepoužiteľné.

Poďakovanie:

Ďakujeme Claudii Tonini za pomoc pri stanovení cholesterolu

Konflikt záujmov:

Autori nedeklarujú žiadny konflikt záujmov.

Referencie

1. Björkhem, I.; Meaney, S.; Fogelman, AM Brain Cholesterol: Dlhý tajný život za bariérou. Arterioskler. Thromb. Vasc. Biol. 2004, 24, 806-815. [CrossRef] [PubMed]

2. Colardo, M.; Martella, N.; Pensabene, D.; Siteni, S.; Di Bartolomeo, S.; Pallottini, V.; Segatto, M. Neurotrofíny ako kľúčové regulátory bunkového metabolizmu: Dôsledky pre homeostázu cholesterolu. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 5692. [CrossRef] [PubMed]

3. Goritz, C.; Mauch, DH; Pfrieger, FW Synaptogenézu indukovanú cholesterolom v neuróne CNS sprostredkúva viacero mechanizmov. Mol. Bunka. Neurosci. 2005, 29, 190-201. [CrossRef] [PubMed]

4. Pfenninger, KH Expanzia plazmovej membrány: Herkulovská úloha neurónu. Nat. Neurosci. 2009, 10, 251–261. [CrossRef]

5. Takamori, S.; Holt, M.; Stenius, K.; Lemke, EA; Grønborg, M.; Riedel, D.; Urlaub, H.; Schenck, S.; Brügger, B.; Ringler, P.; a kol. Molekulárna anatómia organely obchodovania s ľuďmi. Cell 2006, 127, 831-846. [CrossRef] [PubMed]

6. Suzuki, S.; Kiyosue, K.; Hazama, S.; Ogura, A.; Kashihara, M.; Hara, T.; Koshimizu, H.; Kojima, M. Neurotrofický faktor odvodený od mozgu reguluje metabolizmus cholesterolu pre vývoj synapsií. J. Neurosci. 2007, 27, 6417–6427. [CrossRef]

7. Segatto, M.; Leboffe, L.; Trapani, L.; Pallottini, V. Zlyhanie homeostázy cholesterolu v mozgu: dôsledky pre synaptickú dysfunkciu a kognitívny pokles. Curr. Med. Chem. 2014, 21, 2788–2802. [CrossRef] [PubMed]

8. Jeske, DJ; Dietschy, JM Regulácia rýchlosti syntézy cholesterolu in vivo v pečeni a jatočnom tele potkana meraná pomocou [3H]vody. J. Lipid Res. 1980, 21, 364-376. [CrossRef]

9. Pfrieger, FW; Ungerer, N. Metabolizmus cholesterolu v neurónoch a astrocytoch. Prog. Lipid Res. 2011, 50, 357–371. [CrossRef]

10. Nieweg, K.; Schaller, H.; Pfrieger, FW Výrazné rozdiely v syntéze cholesterolu medzi neurónmi a gliovými bunkami z postnatálnych potkanov. J. Neurochem. 2009, 109, 125–134. [CrossRef]

11. Oram, JF; Heinecke, JW ATP-viažuci kazetový transportér A1: Bunkový exportér cholesterolu, ktorý chráni pred kardiovaskulárnymi ochoreniami. Physiol. Rev. 2005, 85, 1343–1372. [CrossRef]

12. Pfrieger, FW Outsourcing v mozgu: Sú neuróny závislé od dodávania cholesterolu astrocytmi? BioEssays 2003, 25, 72-78. [CrossRef]

13. Christopherson, KS; Ullian, EM; Stokes, CCA; Mullowney, CE; Peklo, JW; Agah, A.; Lawler, J.; Mosher, DF; Bornstein, P.; Barres, BA trombospondíny sú proteíny vylučované astrocytmi, ktoré podporujú synaptogenézu CNS. Cell 2005, 120, 421-433. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com