Metabolomická analýza založená na NMR pre účinky suplementácie -ketoglutarátu na myoblasty C2C12 v rôznych energetických stavoch

Kliknite sem a získajte doplnky Cistanche proti starnutiu a únave

1. Úvod

Kostrové svalstvo je najväčším orgánom v ľudskom tele a zabezpečuje normálnu životnú činnosť.Predĺžený cvičebný tréningalebo patologickél procesy chorôb vyvolávajú poškodenie svalovalebonedostatočné zásobovanie svalov energiou, v tejto dobe je obzvlášť dôležité obnovenie svalovej sily a funkcie. Na podporu hypertrofie kostrového svalstva a zvýšenie športového výkonu sa používajú rôzne výživové doplnky [1]. Ako priesečník metabolizmu organického uhlíka a dusíka a súčasne kritický medziprodukt v cykle TCA, ketoglutarát (AKG) preukázal pleiotropné účinky na zlepšenie svalovej výkonnosti v klinických experimentoch a experimentoch na zvieratách [2–9]. Napríklad AKG môže znížiť poškodenie črevnej sliznice [8] a zápal [9], zmierniťrozvoj kolorektálneho karcinómu[4] a fibróza pečene [5], podporujú rast [6] a znižujú morbiditu aoddialiť starnutie[7]. Predchádzajúce práce ukázali, že suplementácia AKG môže zmierniť stratu svalovej hmoty pri parenterálnom podaní v modeli traumy u pacientov podstupujúcich totálnu náhradu bedrového kĺbu [2] a podporiť svalovú hypertrofiu a syntézu proteínov prostredníctvom signálnych dráh Akt/mTOR [10,11]. V prípade Duchennovej svalovej dystrofie môže suplementácia AKG zabrániť svalovej atrofii a dysfunkcii prostredníctvom PHD3/ADRB2-sprostredkovanej dráhy [12]. Naša predchádzajúca práca tiež ukázala, že suplementácia AKG môže výrazne uľahčiť proliferáciu myoblastov C2C12 a zmierniť atrofiu myotrubíc C2C12 kultivovaných v médiu bez glukózy [13]. Vzhľadom na to, že glukóza je hlavným zdrojom energie na udržanie normálnych fyziologických funkcií kostrového svalstva, účinky suplementácie AKG na zlepšenie svalového výkonu sú značne závislé od hladiny glukózy v kostrovom svale. Rozdiely v účinkoch vyvolaných AKG v kostrovom svale medzi rôznymi energetickými stavmi sú nejasné.

AKG sa podieľa na syntéze aminokyselín, vitamínov aorganické kyselinyaenergetický metabolizmusv organizme, čo zahŕňa premenu AKG na glutamát pomocou glutamátdehydrogenázy a následnú amidáciu glutamátu amoniakom pomocou glutamínsyntetázy. AKG poskytuje energiu pre rast buniek prostredníctvom cyklu TCA a oxidatívnej fosforylácie a podporuje bunkový metabolizmus a signalizáciu interakciou s jeho receptorom OXGR (receptor spojený s G proteínom) na bunkovej membráne [14,15]. Okrem toho môže AKG regulovať mitochondriálny oxidačný metabolizmus a podporovať permisívny epigenetický stav sprostredkovaním skorého prechodu embryonálneho bunkového stavu a vývoja zárodočných buniek [16]. Okrem toho, cvičením indukovaný AKG môže stimulovať svoj receptor OXGR1 v nadobličkách, aby kontroloval termogenézu a rozklad triglyceridov v tukovom tkanive a produkoval priaznivé účinky na metabolizmus [17].

Uskutočnilo sa však málo štúdií na odhalenie metabolických zmien kostrových svalov vyvolaných AKG v rôznych energetických stavoch a základných metabolických mechanizmoch. Nedávno sa metabolomická analýza použila na systematické objasnenie molekulárnych mechanizmov, ktoré sú základom priaznivých účinkov výživových doplnkov. Striedanie metabolitov pôsobiacich ako následné produkty génovej transkripcie môže intuitívne odrážať celkové metabolické zmeny. Ako obzvlášť vhodné techniky na kvantitatívnu detekciu zmien hladín metabolitov v biofluidoch, tkanivách a bunkách sa v metabolomických analýzach vo veľkej miere používa 1H nukleárna magnetická rezonančná (NMR) spektroskopia s vysokým rozlíšením. Metabolomické profilovanie založené na NMR má významné výhody, ako je vysoká reprodukovateľnosť, kvantitatívne meranie bez predsudkov a pohodlná príprava vzorky [18,19]. Predtým sme vykonali metabolomické analýzy založené na NMR na objasnenie účinkov suplementácie kreatínu na myoblasty C2C12 [20] a účinkov suplementácie alanyl-glutamínu na myoblasty poškodené energetickou depriváciou [21].

2. Výsledky

2.1. Proliferácia a diferenciácia myoblastov C2C12 so suplementáciou AKG

Myoblastové bunky C2C12 kultivované v normálnom rastovom médiu s a bez suplementácie AKG boli zoskupené ako Nor-A a Nor, zatiaľ čo bunky v nízkoglukózovom rastovom médiu s alebo bez suplementácie AKG boli zoskupené ako Low-A a Low. V súlade s predchádzajúcou štúdiou [10] bunky Nor-A so suplementáciou AKG v koncentrácii 2 mm vykazovali významne zvýšenú životaschopnosť buniek v porovnaní s bunkami Nor (obrázok S1).

Preto sa v experimentoch na hodnotenie zmien v proliferácii a diferenciácii myoblastov indukovaných AKG použila koncentrácia AKG 2 mm. V porovnaní s bunkami Nor vykazovali nízke bunky výrazne zníženú rýchlosť proliferácie v dôsledku nedostatku energie (obrázok 1A). Aj keď suplementácia AKG nespôsobila výrazne odlišnú morfológiu myoblastov v dvoch energetických stavoch, nielen zvýšila rýchlosť proliferácie buniek Low kultivovaných v médiu s nízkym obsahom glukózy, ale tiež zvýšila rýchlosť proliferácie buniek Nor kultivovaných v normálnom médiu v súlade s predchádzajúce štúdie [10,12]. Počet buniek na danú oblasť bol spočítaný pre štyri skupiny myoblastov (n=4 pre skupinu): ani, 563,8 ± 10,4; Nor-A, 624,0 ± 10,8; Nízka, 493,8 ± 14,5; Nízka A, 547,0 ± 11,7 (obrázok 1B). Stojí za zmienku, že bunky Low-A nevykazovali štatisticky odlišné počty buniek od buniek Nor, čo naznačuje, že suplementácia AKG by mohla obnoviť počet buniek pre myoblasty za podmienok kultivácie s nízkym obsahom glukózy (obrázok 1B).

Obrázok 1, Proliferačné a diferenciačné schopnosti C2C12 myoblastov v podmienkach normálnej a nízkej kultúry. glukózovej kultúry. (A) Morfológie myoblastov. (B) Čísla buniek zodpovedajúce panelu A (n=4). (C) Životaschopnosť buniek v porovnaní s bunkami Nor analyzovaná testom proliferácie buniek MTS (n=5). (D) Expresie MyoD1 v myoblastoch analyzované pomocou Western blotu. Anti-GAPDH protilátka sa použila na štandardizáciu množstva proteínu v každej dráhe. (E) Štatistická analýza zodpovedajúca panelom (D) (n=4). * p < 0.{{10}}5,** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001.

Okrem toho sa uskutočnil test MTS, aby sa kvantitatívne porovnali rýchlosti proliferácie štyroch skupín buniek (obrázok 1C). Nízke bunky mali zreteľne zníženú rýchlosť proliferácie v porovnaní s bunkami Nor, čo naznačuje, že médium s nízkym obsahom glukózy znevýhodňuje proliferáciu buniek. Suplementácia AKG významne zvýšila rýchlosť proliferácie buniek Nor-A a Low-A v porovnaní s bunkami Nor a Low. Všimnite si, že Low-A bunky vykazovali schopnosť proliferácie nižšiu ako Nor bunky, čo znamená, že suplementácia AKG len čiastočne obnovila proliferáciu buniek kultivovaných v médiu s nízkym obsahom glukózy

Na charakterizáciu diferenciačnej schopnosti buniek sa zvyčajne používa expresia proteínu myogénnej diferenciácie 1 (MyoD1). Kvantitatívne sme teda porovnali expresie MyoD1 medzi štyrmi skupinami buniek (obrázok 1D). Nízke bunky vykazovali výrazne zníženú schopnosť diferenciácie v porovnaní s bunkami Nor. Významne, suplementácia AKG up-regulovala diferenciačné schopnosti buniek kultivovaných v normálnom médiu aj v médiu s nízkym obsahom glukózy, ako naznačuje približne 30-percentné zvýšenie expresie MyoD1 v bunkách Nor-A a Low-A. Je pozoruhodné, že Low-A bunky nevykazovali štatisticky významne odlišnú expresiu MyoD1 od buniek Nor, čo naznačuje vysokú účinnosť suplementácie AKG na obnovenie diferenciačnej schopnosti buniek kultivovaných v médiu s nízkym obsahom glukózy.

Ďalej sme analyzovali diferenciačné schopnosti myotrubíc pre štyri skupiny myoblastov C2C12. Myotrubice sa vytvorili fúziou myoblastov kultivovaných v normálnych a nízkoglukózových diferenciačných médiách s alebo bez suplementácie AKG, obrázok S3). Morfológie myotrubíc C2C12 ukázali, že kultúra s nízkym obsahom glukózy narušila schopnosť buniek diferenciácie myotrubíc a suplementácia AKG by mohla podporiť diferenciáciu myotrubíc myoblastov kultivovaných v normálnom médiu aj v médiu s nízkou glukózou.

2.2. NMR spektrá vodných extraktov myoblastov C2C12

Typické 850 MHz1H NMR spektrá boli zaznamenané na vodných extraktoch odvodených zo skupín Nor, Nor-A, Low a Low-A myoblastov C2C12 (obrázok 2A). Celkovo bolo priradených 34 metabolitov, ktoré sú zhrnuté v tabuľke S1. Rezonančné priradenia metabolitov sa potvrdili použitím spektier 2D 1H-13C HSOC a 1H-H TOCSY (obrázky S4 a S5). Vizuálna kontrola NMR spektier ukázala, že kultivácia myoblastov s doplnením AKG viedla k významnej akumulácii intracelulárneho AKG v bunkách Nor-A a Low-A (obrázok 2B).

Obrázok 2, spektrá priemernej 850 MHz 1H nukleárnej magnetickej rezonancie (NMR) zaznamenané na vodných extraktoch odvodených zo skupín Nor, Nor-A, Low a Low-A myoblastov C2C12. (A) Porovnanie priemerných NMR spektier štyroch skupín. Vertikálne stupnice sa udržiavali konštantné vo všetkých 1H NMR spektrách. Vodná oblasť (4,2 ppm) bola odstránená (B) Lokálne amplifikované oblasti píkov a-ketoglutarátu (AKG). Modrá/zelená/žltá/červená čiara: spektrálne oblasti zo skupín Nor/Nor-A/Low/Low-A. AKG, a-ketoglutarát; PC, O-fosfocholín; GPC, sn-glycero-3-fosfocholínUDP-glukóza, uridíndifosfát-glukóza: CTP, sn-glycero-3-fosfocholín; NAD plus, nikotínamid adenín dinukleotid AXP adenín mono/di/trifosfát.

2.3. Multivariačná analýza údajov na skúmanie bunkových metabolických profilov

Ďalej sme vykonali viacrozmernú analýzu údajov na spektrálnych údajoch NMR pre metabolické profilovanie štyroch skupín myoblastov C2C12. Najprv sme vytvorili tri modely PCA bez dozoru s prvými dvoma zložkami (PC1, PC2), aby sme získali prehľad o trendoch zoskupovania a odhalili metabolické rozdiely medzi skupinami myoblastov. Grafy skóre ThePCA ukazujú, že metabolický profil buniek kultivovaných v médiu s nízkym obsahom glukózy sa zreteľne odlišoval od profilu kultivovaného v normálnom médiu (obrázok 3A) a suplementácia AKC významne zmenila metabolické vzorce buniek kultivovaných v normálnom médiu a v médiu s nízkym obsahom glukózy (obrázok 3B, C). Metabolický rozdiel medzi skupinami Nor-A a Nor bol však väčší ako medzi skupinami Low-A a Low, čo znamená, že účinky suplementácie AKG na metabolický profil myoblastov sú značne závislé od energetického stavu buniek.

Obrázok 3. Viacrozmerné analýzy 'HNMR spektier boli zaznamenané na vodných extraktoch odvodených z C2C12 myoblastov skupín Nor, Nor-A, Low a Low-A. (AC) PCA grafy skóre skupín Low a Nor, skupín Low-A a Low skupín Nor-A a Nor; (DF) Grafy skóre OPIS-DA pre skupiny Low a Nor (R2: 0,999, 02: 0,996), skupiny Low-A a Low (R2: 0.918: 02: 0.761), skupiny Nor-A a Nor (R2: 0,927: 02: 0,838). Elipsy označujú 95-percentný limit spoľahlivosti.

Ďalej sme vytvorili tri kontrolované modely OPLS-DA na ilustráciu metabolických separácií medzi štyrmi skupinami myoblastov (obrázok 3D-F). Ako sa očakávalo, modely OPLSDA maximalizovali metabolické rozdiely medzi štyrmi skupinami vyhradením informácií o korelovaných ortogonálnych premenných a odfiltrovaním informácií o nekorelovaných ortogonálnych premenných. Ďalej sme vykonali náhodné permutačné testy (n=200), aby sme vyhodnotili spoľahlivosť modelov OPLS-DA (obrázok S6), ktoré naznačujú platnosť zavedených modelov OPLS-DA.

2.4. Identifikácia diferenciálnych a dôležitých metabolitov

Na kvantitatívne porovnanie hladín metabolitov medzi štyrmi skupinami myoblastov C2C12 sme vypočítali relatívne hladiny identifikovaných metabolitov na základe ich relatívnych integrálov (tabuľka S2). Suplementácia AKG dramaticky zvýšila intracelulárne hladiny AKG v skupinách Nor-A a Low-A, ale významne nezmenila hladiny v skupine Nor a Low. Vykonali sme Studentov t-test na identifikáciu rozdielnych metabolitov s kritériom p < 0,05 (obrázok 4). Porovnanie Nor vs. Low identifikovalo 29 rozdielnych metabolitov (obrázok 4A), vrátane 18 zosilnených metabolitov (leucín, izoleucín, valín, acetát, glutamát, glutamín, metionín, aspartát, lyzín, kreatín, PC (O-fosfocholín), taurín, tyrozín fenylalanín, histidín, NAD plus, formiát, AXP) a 11 odmietli Metabo. lites (glutatión, pyroglutamát, fosfokreatín, beta-alanín, GPC, glukóza, glycín, acetát, treonín, GTP, UDP-glukóza). Porovnanie diferenciálnych metabolitov s nízkou hodnotou A vs. s nízkou identifikovanou hodnotou (obrázok 4B), vrátane 7 zvýšených metabolitov (etanol, AKGbeta-alanín, PC, taurín, glycín a GTP) a 3 znížených metabolitov (glutamín, lyzín a myoinozitol). Porovnanie Nor-A vs. Nor identifikovalo 18 rozdielnych metabolitov (obrázok 4C), vrátane 6 upregulovaných metabolitov (AKG, pyroglutamát, glutamín, lyzín, glukóza, laktát) a 12 downregulovaných metabolitov (alanín, acetát, glutatión metionín, fosfokreatín, PC, myoinozitol, glycín, treonín, GTP, UDP-glukóza a AXP).

Obrázok 4. Relatívne intenzity rôznych metabolitov boli identifikované z párových porovnaní medzi štyrmi skupinami myoblastov C2C12. (A) Nízka vs. (B) Low-A vs. Low; (C) Nor-A vs. Nor. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001.n { {13}} pre každú skupinu.

Ďalej sme použili modely OPLS-DA na identifikáciu dôležitých metabolitov s kritériom VIP > 1 (obrázok 5). Celkovo bolo identifikovaných 12, 10 a 10 dôležitých metabolitov z OPLS-DA modelov Nor-A vs. Nor, Nor vs. Low, Low-A vs.

Obrázok 5. VIP skóre dôležitých metabolitov sa identifikovalo z párových porovnaní medzi štyrmi skupinami C2C12myoblastov. (A) Nízka vs. (B) Low-A vs. Low; (C) Nor-A vs. Nor. Červené/modré písmo označuje zvýšené/znížené hladiny metabolitu.

Kombinácia identifikovaných dôležitých metabolitov a rozdielnych metabolitov poskytla charakteristické metabolity (tabuľka 1). Párové porovnania Low vs. Nor, Low-A vs. Low a Nor-A vs. Nor identifikovali 10, 6, respektíve 10 charakteristických metabolitov, čo naznačuje, že účinky suplementácie AKG na myoblasty boli úzko spojené s energiou stav buniek.

2.5. Identifikácia významne zmeneného metabolizmu

Dráhy Vykonali sme analýzu metabolických dráh, aby sme identifikovali významne zmenené metabolické dráhy (významné dráhy) na základe hladín metabolitov identifikovaných z párových porovnaní medzi štyrmi skupinami myoblastov C1C12 (obrázok S7; tabuľka 2 a tabuľka S3). Analýza Nor vs. Low identifikovala 11 významných dráh: (1) metabolizmus alanínu, aspartátu a glutamátu; (2) metabolizmus glycínu, serínu a treonínu; (3) metabolizmus glutatiónu; (4) metabolizmus D-glutamínu a D-glutamátu; (5) metabolizmus škrobu a sacharózy; (6) metabolizmus beta-alanínu; (7) metabolizmus taurínu a hypotaurínu; (8) metabolizmus fenylalanínu; (9) biosyntéza fenylalanínu, tyrozínu a tryptofánu; (10) metabolizmus nikotinátu a nikotínamidu; (11) Metabolizmus histidínu. Táto významná dráha bola spojená s energetickým metabolizmom, oxidačným stresom a anaplerotickým tokom cyklu TCA.

Analýza Nor-A vs. Nor identifikovala iba prvých päť významných ciest 1–5 s vylúčením ďalších šiestich ciest 6–11. Na rozdiel od toho analýza Low-A vs. Low identifikovala iba šesť významných ciest: prvé štyri cesty 1–4 zdieľané porovnaním Low vs. Nor, Nor-A vs. dve cesty 6–7 zdieľané porovnaním Low vs. Nor. Všimnite si, že suplementácia AKG významne nezmenila dráhu 5 (metabolizmus škrobu a sacharózy) v bunkách kultivovaných v médiu s nízkym obsahom glukózy, ale interferovala s dvoma ďalšími dráhami (metabolizmus beta-alanínu a metabolizmus taurínu a hypotaurínu). Aby sme vizualizovali zmeny v charakteristických metabolitoch vyvolané AKG, premietli sme tieto metabolity na metabolickú mapu založenú na databáze Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) (obrázok 6). KEGG sa vo veľkej miere používa ako jeden z hlavných zdrojov údajov na rekonštrukciu metabolických sietí a zdôrazňuje významné metabolické dráhy. Zmenené charakteristické metabolity a výrazne zmenené metabolické dráhy poskytujú nový pohľad na molekulárne mechanizmy, ktoré sú základom účinkov suplementácie AKG na myoblasty C2C12.