Nanočastice lipidov s obsahom extraktu z olivových listov (Olea Europaea L): Optimalizácia parametrov spracovania podľa Box-Behnkenovho štatistického návrhu, charakterizácie in vitro a hodnotenia antioxidačnej a antimikrobiálnej aktivity, časť 2

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPre viac informácií

2.5.6 Hodnotenie stability

Stabilita optimalizovaného prípravku (F9) sa skúmala podľa pokynov Medzinárodnej rady pre harmonizáciu (ICH). Disperzia SLN sa odobrala do troch samostatných sklenených fľaštičiek (10 ml v každej). Spomedzi troch liekoviek bola jedna uložená v chladničke (4 stupne ± 2 stupne), druhá pri izbovej teplote (25 ± 2 stupne / 60 ± 5 percent relatívnej vlhkosti) a posledná bola uložená v stabilizačnej komore (termo Scientific, Švédsko) pri 40 ± 2 stupňoch / 75 ± 5 stupňoch percent relatívnej vlhkosti. V konkrétnom časovom bode, tj 1, 3, 6 mesiaci, boli vzorky odobraté a skúmané na určité parametre, ako je veľkosť častíc, účinnosť zachytávania, zeta potenciál & PDI, atď., ktoré boli stanovené a štatisticky porovnané s údajmi o nulovom čase (počiatočné). . 2.5.7 Antioxidačná aktivita

Jednou z najužitočnejších metód na detekciu antioxidačného potenciálu je metóda 2,2-difenyl-1-pikryl-hydrazyl-hydrátu voľných radikálov (DPPH)2. Aktivita zachytávania radikálov (tj. analýza ich schopnosti zachytávať voľné radikály DPPH) OLP-SLN bola hodnotená spektrofotometricky pri 517 nm. Antioxidačná aktivita OLP, ako aj OPL-SLN bola stanovená pomocou metódy (DPPH). Pripravil sa roztok DPPH ({{10}},1 mM) v etanole. OLP-SLN (ekvivalentné 0,2 mg/ml OLP) sa dispergovali vo fosfátovom pufri a nechali sa 24 hodín, aby sa uvoľnilo liečivo. V rovnakom médiu sa tiež pripravila ekvivalentná koncentrácia OLP (0,2 mg/ml) a slepých SLN. V tejto štúdii sa kyselina askorbová s koncentráciou 0,2 mg/ml použila ako štandard a zatiaľ čo roztok DPPH sa použil ako kontrola.cistanche Austrália3300 μl DPPH sa zmiešalo v každom roztoku OLP-SLN (500 μl), slepých SLN a roztoku OLP (500 μl). Každá reakčná zmes sa udržiavala vo vodnom kúpeli trepačky pri 37 ± 0,5 stupňoch počas 30 minút za podmienok chránených pred svetlom. Nakoniec sa stanovila absorbancia každej vzorky UV-viditeľným spektrofotometrom (Shimadzu 1800, Japonsko) pri 517 nm s použitím etanolu ako slepého pokusu. Každý experiment bol hodnotený trikrát a hodnoty sú prezentované ako priemer ± SD. Hodnota antioxidačnej aktivity vo forme percenta aktivity vychytávania DPPH bola určená nasledujúcim vzorcom (rovnica 2):

2.5.8 Antimikrobiálna štúdia

Antimikrobiálna štúdia SLN naplnených OLP (optimalizovaná šarža F9) sa uskutočnila s použitím agarovej jamkovej difúznej metódy. Na vyhodnotenie boli použité bakteriálne kmene ako Staphylococcus aureus (Gramov pozitívny) a Pseudomonas aeruginoza (Gramov negatívny). ml) každej baktérie sa umiestnilo jednotlivo na každú sterilnú živnú agarovú platňu pomocou sterilných tampónov inkubovaných pri 37 ± 0, 5 stupňoch počas 1 hodiny.cistanche benefityNa každej platni boli pomocou sterilného korkovrtu vytvorené štyri jamky s priemerom približne 8 mm. Tu sa na antimikrobiálnu štúdiu použili slepé SLN, pozitívna kontrola (čistý extrakt), fyzikálna zmes (OLP extrakt plus slepý pokus) a SLN a optimalizovaný prípravok OLP-SLN（100 μl） a umiestnili sa do každej jamky . Platne boli inkubované pri teplote 37 ± 0,5 stupňa. Vo vopred určených časových bodoch (6, 12, 24 h) sa platne vytiahli a inhibičné zóny okolo stien sa merali v mm pomocou posuvného meradla.

Ak chcete vedieť viac, kliknite sem

3. Výsledky a diskusia

3.1 Predbežný skríning a predoptimalizácia formovo latentných premenných

The highest solubility of OLP was found to be in compri-to 888 ATO as depicted in Fig.1. The descending order of OLP solubility/100 gm in different lipid was compritol 188 ATO(36.93±4.92mg)>Precirol ATO 5(29.37±3.01 mg)>GMS(23.84±2.73mg)>palmitic acid(21.41±2.81 mg)>kyselina stearová (16,25±1,65 mg). Comppritol 888 ATO sa použil ako lipid na prípravu perorálnych SLN na prípravu SLN.

Na základe výsledkov predbežnej skríningovej štúdie sa ako povrchovo aktívna látka vybral tween 80 a kompritol 888 ATO ako lipid. Ďalšie parametre, ako je pomer liečiva k lipidu (1:3-1:6), koncentrácia povrchovo aktívnej látky (percento ,1.5-4,5 percenta) a rýchlosť homogenizácie (ot./min., 3000-6000 ot./min.), čas homogenizácie (2 h), čas sonikácie (10 min) sa určili vykonaním predbežných experimentov. Faktory ako pomer liečiva k lipidu (A), koncentrácia povrchovo aktívnej látky (B) a homogenizácia (C) boli opäť optimalizované pomocou metodológie povrchu odozvy (RSM) v spojení s 3-faktormi a 3-úrovňami BBD a ich vplyv bol zistený na závislých faktoroch, akými sú veľkosť častíc (Y1), účinnosť zachytávania (Y2) a PDI (Y3).

3.2 Príprava SLN a optimalizácia OLP zaťažených SLNS

Hodnoty vopred optimalizovaných parametrov, ako je opísané

vyššie boli namontované na BBD expertného dizajnu. Zloženie celkovo sedemnástich formulácií skúmal BBD s 5 stredovými bodmi. Všetky formulácie boli vyvinuté a hodnoty závislých parametrov, ako je veľkosť častíc, účinnosť zachytávania a PDI, boli skúmané a ďalej prispôsobené BBD, aby sa získal konečný výsledok. Boli vytvorené polynomické rovnice a 3D grafy ukazujúce vplyv nezávislých faktorov na závislé faktory. Kladné znamienko polynomickej rovnice skúmalo pozitívny vplyv a záporné znamienko označovalo negatívny vplyv na závislé premenné. Hodnota regresnej analýzy skutočných a predpokladaných závislých premenných a analýza údajov rozptylu modelov sú uvedené v tabuľkách 1, 2 a 3, v tomto poradí. Kvadratický model bol považovaný za najlepšie vyhovujúci model pre všetky odpovede, keďže v tomto prípade bola pozorovaná najvyššia hodnota regresného koeficientu.

3.3 Vplyv určitých parametrov na veľkosť častíc (Y1)

Nasledujúca polynomická rovnica bola získaná z BBD, čo naznačuje vplyv rôznych nezávislých faktorov na veľkosť častíc (Y1):

Vyššie uvedená rovnica ukázala, že kompritol 888 ATO vykazoval pozitívny vplyv na veľkosť častíc, zatiaľ čo Tween 80 a homogenizácia vykazovali negatívny vplyv na veľkosť častíc.

Tu mali premenné A, B, C, AB, BC a B“ významný vplyv na veľkosť častíc.cistanche cholesterolAt a 95% confidence interval, the lack of fit was insignificant(p>0.05), pričom sa zistilo, že ostatné parametre sú významné (s<0.0001)with adequate="" precision（="">4) (Tabuľka 3). Na základe R²

(0.9996) sa kvadratický model považoval za najlepšie prispôsobený model s primeraným signálom (tabuľka 4).

Zistilo sa, že veľkosť častíc rôznych dávok je v rozsahu 112.35-277.46 nm. Ak sa ostatné premenné udržiavali konštantné, veľkosť častíc sa zvýšila zvýšením pomeru liečiva k lipidu (tabuľka 1, šarža F1 237,05 nm a F2 259,57 nm). To môže byť spôsobené agregáciou častíc v dôsledku nedostatočnej povrchovo aktívnej látky na rozptýlenie častíc. Na druhej strane povrchovo aktívna látka (1.5-4,5 percenta) mala negatívny vplyv na veľkosť častíc (tabuľka 1, šarža F1 237,05 nm a F3 112,35 nm ). Môže to byť spôsobené znížením medzifázového napätia medzi vodnou a lipidovou fázou, ktoré zabraňuje agregácii častíc). Rýchlosť homogenizácie mala negatívny vplyv (tabuľka 1, šarža F5 187.46 nm a F7 134.27 nm) na veľkosť častíc v dôsledku vytvárania vysokej sily, ktorá rozbíja častice, a tým znižuje veľkosť častice. Rovnica 3 naznačila, že účinok povrchovo aktívnej látky (hodnota koeficientu-40.87) vykazoval výraznejší účinok na veľkosť častíc v porovnaní s rýchlosťou homogenizácie (hodnota koeficientu -24.97).vedľajšie účinky cistanche deserticolaObrázok 2 skúmal vplyv rôznych nezávislých parametrov na veľkosť častíc.

Cistanche môže proti starnutiu

3.4 Vplyv určitých parametrov na účinnosť zachytávania (Y2)

Nasledujúca polymérna rovnica bola získaná z BBD, ktorá ukazuje vplyv rôznych nezávislých parametrov na účinnosť zachytávania:

Tu mali premenné A, B, C, AB, AC, BC, A a B² významný vplyv na účinnosť zachytenia. Pri 95-percentnom intervale spoľahlivosti bol nedostatok zhody nevýznamný (str<0.05)while the="" remaining="" parameters="" were="" found="" to="" be=""><0.0001)with adequate="" precision(="">4) (Tabuľka 3). Kvadratický model（R²=0.9991）bol považovaný za najlepšie prispôsobený model s primeraným signálom (tabuľka 4).

Z vyššie uvedenej rovnice 4 je zrejmé, že lipid (kompritol 888ATO) vykazoval pozitívny účinok, zatiaľ čo zvyšné dva parametre vykazovali negatívny vplyv na účinnosť zachytávania. Povrchovo aktívna látka (hodnota koeficientu -7,23) mala výraznejší účinok v porovnaní s rýchlosťou homogenizácie (hodnota koeficientu -5,76). Pozitívny účinok lipidu na účinnosť zachytávania (tabuľka 1, šarža F1 a F2) bol spôsobený dostupnosťou väčšieho množstva lipidov na akomodáciu dostupných liečiv. Pozoroval sa premenlivý účinok na účinnosť zachytávania. V počiatočnom štádiu sa pri zvyšovaní povrchovo aktívnej látky hodnota účinnosti zachytávania zvýšila, ale pri ďalšom zvyšovaní povrchovo aktívnej látky sa znížila v dôsledku úniku lieku do vonkajšieho prostredia (tabuľka 1, šarža F1 a F3). Rýchlosť homogenizácie mala negatívny vplyv na účinnosť zachytenia v dôsledku väčšej šmykovej sily, ktorá by mohla byť zodpovedná za vypudenie liečiva (tabuľka 1, šarža F5 a F7). Obrázok 3 skúmal vplyv rôznych nezávislých parametrov na

3.5 Vplyv nezávislých parametrov na PDI(Y3)

Nasledujúca polynomická rovnica znázorňujúca vplyv rôznych parametrov na PDI:

Here,variables like A,B, C,AB,AC,BC,A2,and C°had a significant effect on the PDI. At a 95% confidence interval, the lack of fit was insignificant(p>0.05), pričom sa zistilo, že ostatné parametre sú významné (s<0.0001)with adequate="" precision(="">4) (Tabuľka 3). Kvadratický model (R=0.9991) bol považovaný za najlepšie prispôsobený model s primeraným signálom (tabuľka 4).

Z rovnice 5 je uvedené, že všetky tri nezávislé parametre, ako je pomer liečiva a lipidov, povrchovo aktívna látka a rýchlosť homogenizácie, mali pozitívny vplyv na PDI. Dominantný účinok bol spôsobený rýchlosťou homogenizácie (hodnota koeficientu 0.048) nasledovaný lipidom (hodnota koeficientu 0.046) a najmenej povrchovo aktívna látka (hodnota koeficientu 0,014). V dôsledku homogenizácie sa kinetická energia systému trochu zvýšila, čo spôsobilo kolíziu a agregáciu lipidových nanočastíc (tabuľka 1, šarža F9 a F11). Vysoká koncentrácia povrchovo aktívnej látky vytvorila viac malých častíc, ktoré tvoria mostík s veľkými časticami, a preto vytvárajú nerovnomernosť, ktorá zvyšuje PDI. Zvýšenie koncentrácie lipidov pri konštantnej hladine povrchovo aktívnej látky spôsobilo koaguláciu častíc, čo malo za následok nerovnomernú distribúciu veľkosti častíc. Obrázok 4 skúmal vplyv rôznych nezávislých premenných na PDI). Na základe troch charakteristík, tj veľkosti častíc, účinnosti zachytenia a PDI, bola šarža F9 považovaná za optimalizovanú formuláciu s hodnotou veľkosti častíc, účinnosti zachytenia a PDI 277,46 nm, 80,48 percent a 0,275, v tomto poradí.

3.6 Charakterizácia OLP-SLN

3.6.1 Hodnotenie veľkosti častíc, PDI a zeta potenciálu

Zistilo sa, že hodnota veľkosti častíc, PDI a zeta potenciálu optimalizovanej dávky (F9) je 277,46 nm, 0 0,282, (obr. 5A) a -23,18 mV, v tomto poradí. Malá hodnota PDI (<0.5)indicates the="" uniform="" or="" mono="" distribution="" of="" particles="" without="" any="" aggregation="" in="" the="" developed="" slns="" dispersion.="" a="" similar="" finding="" was="" observed="" by="" yasir="" et="" al.="">cistanche dávkovanie redditpočas výroby SLN naplnených buspirónom na podávanie z nosa do mozgu. Veľkosť častíc aj povrchový náboj sú dôležité v prípade dodávania liečiva vo forme nanočastíc. Predpokladá sa, že veľkosť častíc menšia ako 500 nm uniká z mechanizmu fagocytózy indukovaného makrofágmi. Zeta potenciál vo forme negatívneho povrchového náboja (okolo -20 mV) je žiaduci pre správnu stabilitu nano-formulácie. Pozorovaná hodnota zeta potenciálu bola -23,18 mV, čo naznačuje dobrú fyzickú stabilitu

rozptylu SLN. Dôležitou úlohou negatívnych povrchových nanočastíc je ich priťahovanie ku kladne nabitým proteínom z poškodených tkanív a pomáha pri regulácii oxidačného procesu." Vyvinutá optimalizovaná formulácia

(F9) spĺňal obe kritériá veľkosti častíc a povrchových nábojov.

3.6.2 Morfologická štúdia

Optimalizovaná séria vyvinutých OLP-SLN (F9) označuje zhruba guľový tvar, ako sa pozoroval v štúdii TEM (obr. 5B).

3.6.3 Účinnosť zachytávania (v percentách)

Zistilo sa, že účinnosť zachytenia vyvinutých šarží OPL SLN je v rozsahu 50.{1}},46 percent, pričom 80,48 percent optimalizovanej formulácie (F9) naznačuje dobrú schopnosť vyvinutých SLN zachytiť liečivo. 3.6.4 Štúdia diferenciálnej skenovacej kalorimetrie (DSC) Vlastnosti ako kryštalinita a tepelné správanie vyvinutých OLP-SLN sú dôležité vlastnosti, ktoré zabezpečujú ich aplikáciu pri podávaní liečiv. DSC termogram OLP (liečivo), lipidu (kompritol 888 ATO) a optimalizovanej formulácie (F9) je znázornený na obr. 6. Tepelné spektrum OPL ukázalo krátky a široký endotermický pík pri 65,23 stupňoch, ale zvýšil sa na 100,96 stupňa . Kompritol 88ATO vykázal endotermický pík pri 70,5 stupňoch, ktorý sa znova zhodoval s teplotou topenia. Charakteristický vrchol OLP chýbal v termograme optimalizovanej formulácie (F9). Tu bol pozorovaný iba jeden pomerne široký vrchol okolo 67, 81 stupňa, čo znamená zachytenie OLP v lipidovej matrici, čo vedie k tvorbe OLP-SLN4.

3.6.5 Uvoľňovanie liečiva in vitro

Zistilo sa, že uvoľňovanie liečiva z optimalizovanej formulácie OLP-SLN (F9) je 95,29 ± 8,13 percent, ako je znázornené na obr. Uvoľňovanie z optimalizovanej formulácie vykazovalo bi-

fázový vzor, ​​tj. počiatočné rýchle uvoľňovanie (23,83 ± 4,51 počas prvej 1 hodiny) v dôsledku uvoľnenia povrchovo absorbovaného liečiva a neskôr trvalé (95,29 ± 8,13 percent počas 24 hodín) v dôsledku uvoľnenia liečiva z matrice SLN. Kinetika uvoľňovania formulácie s optimalizovanou formou OLP sa detegovala vložením získaných údajov o uvoľňovaní liečiva do rôznych kinetických modelov, ako je graficky znázornené na obr. Zistilo sa, že maximálna hodnota R²（0.9984） je pre kinetický model prvého rádu. Preto sa kinetika prvého rádu považovala za najlepšie prispôsobený model. Zistilo sa, že mechanizmus uvoľnenia je Fickovský typ difúzie s hodnotou exponentu uvoľnenia(n)0.441.

3.6.6 Hodnotenie stability

Za správnych skladovacích podmienok sa očakáva, že každá vyvinutá dávková forma bude stabilná až do doby používania (dátum exspirácie). Tu sa vyvinutá optimalizovaná formulácia OLP-SLN (F9) skladovala za určitých podmienok skladovania podľa špecifikácie poskytnutej usmerneniami ICH. Formulácia skladovaná pri 4 ± 2 stupňoch (chladnička) a izbové podmienky (25 ± 2 stupne / 60 ± 5 percent RH) neboli významne (p<0.05) differ="" from="" the="" initial="" data(zero="" time)in="" respect="" of="" particle="" size,="" pdi,="" surface="" charge(zeta="" potential)="" and="" entrapment="" efficiency.="" a="" significant=""><0.05)in zeta="" potential(-19.27="" mv)and="" entrapment="" efficiency="" (73.29%)and="" a="" significant=""><0.05)in particle="" size(388.37="" nm)was="" observed="" in="" the="" formulation="" stored="" at="" 40±2℃/75±5%="" rh.it="" might="" be="" due="" to="" the="" partial="" loss="" of="" surfactant="" covering(hence="" zeta="" potential="" reduced)which="" leads="" to="" aggregation="" of="" particles(hence="" particle="" size="" increased)and="" leakage="" of="" a="" drug="" in="" the="" external="" environment="" (hence="" entrapment="" efficiency="">

3.6.7 Antioxidačná aktivita

Hlavným účinkom OLP je zabrániť peroxidácii čistením voľných radikálov a prispievaním k zmierneniu zranení spôsobených oxidačným stresom. Ako je znázornené na obr. 9, voľný OLP vykazoval 48,38 ± 5.28 5 percent antioxidantu, čo je významne (p<0.01)less than="" the="" anti-oxidant="" activity="" (67.93±7.37%)of="" optimized="" formulation(f9).="" this="" could="" be="" due="" to="" the="" nano-size="" of="" the="" lipid="" particles="" which="" offered="" a="" higher="" surface="" area="" for="" the="" chemical="" quenching="" and="" also="" protect="" the="" olp="" in="" the="" external="" environment.="" no="" absorbance="" was="" found="" for="" the="" blank="" slns="" and="" hence="" blank="" slns="" did="" not="" exhibit="" any="" radical="" scavenging="" activity.="" similar="" findings="" were="" reported="" previously".="" the="" value="" of="" anti-oxidation="" activity="" for="" ascorbic="" acid="" was="" supposed="" to="" be="" 69.42±5.38%="" which="" was="" not="" significantly=""><0.05)from the="" optimized="" formulation(f9).="" 3,6.8="" anti-microbial="">

Štúdia preukázala antimikrobiálny potenciál vyvinutej formulácie SLNs OLP(F9) proti baktériám ako Staphylococcus aureus (Gramov pozitívny) a Pseudomonas aeruginosa (Gramov negatívny), ako je znázornené na Obr. 10. Výsledok ukázal, že neexistovala žiadna zóna inhibície pre slepú formuláciu, pretože neobsahovala OLP extrakt.

Maximálna zóna inhibície pre pozitívnu kontrolu a fyzikálnu zmes (OLP extrakt plus slepé SLN) sa pozorovala počas prvých 6 hodín. Po tomto čase (prvých 6 h) nenastala žiadna zmena v zóne inhibície pozitívnej kontroly a fyzikálnej zmesi. Hodnota zóny inhibície pre pozitívnu kontrolu proti Pseudomonas aeruginosa a Staphylococcus aureus bola 7,5 ± 1,25 mm, respektíve 8 ± 1,30 mm. Podobne sa zistilo, že hodnota zóny inhibície pre fyzikálnu zmes (extrakt OLP plus blank SLN) proti Pseudomonas aeruginosa a Staphylococcus aureus je 8,25 ± 1,9 mm a 8,60 ± 2,1 mm. Na druhej strane, SLN naplnené OLP vykazovali antimikrobiálny účinok dlhší čas (až 24 hodín) v porovnaní s voľným OLP a fyzikálnou zmesou. Je to spôsobené predĺženým uvoľňovaním OLP z formulácie SLN. Antimikrobiálny účinok SLN naplnených OLP proti grampozitívnym

a gramnegatívne baktérie boli pozorované až 24 hodín. Antimikrobiálny účinok OLP-SLN bol významne (str<0.001)more than="" that="" of="" olp="" extract="" and="" physical="" mixture="" against="" pseudomonas="" aeruginosa="" and="" staphylococcus="" aureus.="" the="" value="" of="" the="" zone="" of="" inhibition="" of="" opl-slns="" against="" pseudomonas="" aeruginosa="" and="" staphylococcus="" aureus="" was="" observed="" at="" 14.75±2.25="" mm="" and="" 16.30±2.1="" mm="" in="" 24="" h="" respectively.="" moreover,="" study="" findings="" indicated="" that="" all="" formulations="" containing="" olp="" extract="" exhibited="" better="" anti-microbial="" efficiency="" towards="" gram-positive="" staphylococcus="" aureus="" as="" compared="" to="" gram-negative="" pseudomonas="" aeruginosa,4".="" to="" the="" best="" of="" our="" knowledge,="" the="" previous="" report="" showed="" that="" the="" major="" constituents="" for="" antimicrobial="" activity="" present="" in="" the="" olive="" extract="" are="" cyclotrisiloxane="" hexamethyl(36.98%),="" cyclo-tetrasiloxane="" octamethyl(15.18%),="" and="" cyclopentasilox-ane="">

4. Záver

V tejto štúdii sa prášok extraktu z olivových listov, ktorý bol menej stabilný v normálnych podmienkach prostredia, úspešne premenil na stabilnú formuláciu SLN. Optimalizovaná formulácia vykazovala sľubnú veľkosť častíc, účinnosť zachytávania, ako aj povrchové náboje. Optimalizovaná formulácia vykazovala postupné uvoľňovanie liečiva až do 24 hodín po kinetike uvoľňovania liečiva prvého poriadku a Fickianovom difúznom type mechanizmu uvoľňovania liečiva. Uskutočnila sa štúdia stability a optimalizovaná formulácia (F9) bola stabilná za uvedených podmienok skladovania. OLP formulácia vykazovala sľubné antioxidačné vlastnosti, ako je odôvodnené metódou testu DPPH. Antimikrobiálna aktivita proti Gramovým pozitívnym (Staphylococcus aureus) a Gramovým negatívnym (Pseudomonas aeruginosa) baktériám. Nakoniec sa dospelo k záveru, že SLN by mohli byť sľubnými nosičmi na dodávanie prášku extraktu z olivových listov.

Tento článok je prevzatý z J. Oleo Sci. 70, (10) 1403-1416 (2021)