Omega-3 mastné kyseliny upregulujú SIRT1/3, aktivujú PGC-1 prostredníctvom deacetylácie a indukujú produkciu Nrf1 v modeli potkana s 5/6 nefrektómiou
Mar 10, 2022
Úvod
Obličkysa podieľajú na regulácii niekoľkých funkcií, vrátane rôznych metabolických dráh, rovnováhy vody a elektrolytov, kontroly krvného tlaku a produkcie niekoľkých hormónov. Keďže tieto funkcie spotrebúvajú obrovské množstvo energie,obličkysú bohaté na mitochondrie [1]. Mitochondrie sa môžu prispôsobiť rôznym metabolickým podmienkam prostredníctvom regulácie mechanistických cieľov rapamycínu (mTOR) a dráh snímania živín sprostredkovaných AMP-aktivovanou proteínkinázou (AMPK), aby sa zachovala zdravá mitochondriálna populácia [2]. Medzi štúdiami o mitochondriách je k dnešnému dňu len niekoľko štúdií o mitochondriálnej biogenéze. Väčšina štúdií súvisiacich s mitochondriálnou biogenézou je založená naobličkovétkaniva [3,4] a štúdie oobličkysúvisia najmä s akútpoškodenie obličiek(AKI) zvieracie modely, proximálne tubulárne bunky a diabetická nefropatia [5–7]. Hoci mitochondriálna biogenéza môže súvisieť s patogenézou mitochondriálnej dysfunkcie u nediabetických chronickýchochorenie obličiek (CKD), výskum na túto tému je tiež veľmi obmedzený. CKD a mitochondriálna biogenéza súvisia s kardiovaskulárnym ochorením [8,9]. Zlepšenie mitochondriálnej biogenézy môže byť prospešné pre kardioprotekciu pri CKD. Štúdia naznačujúca, že omega-3 mastné kyseliny (MK) uľahčujú biogenézu mitochondrií, bola vykonaná s použitímobličkytkanivách [3,10]. Nedávna štúdia preukázala sľubnú úlohu omega-3 FA v mitochondriálnej biogenéze na zvieracích modeloch s kardiovaskulárnymi a neurodegeneratívnymi ochoreniami [11]. Preto sme sa v tejto štúdii zamerali na skúmanie mitochondriálnej biogenézy vobličky5/6 potkanov s nefrektómiou (Nx). Okrem toho sme pomocou tohto modelu hodnotili účinok omega-3 FA na mitochondriálnu biogenézu.
Kľúčové slová:jadrový respiračný faktor 1; nukleárny faktor erytroidný 2-súvisiaci faktor 2; sirtuín 1; sirtuín 3; omega-3 mastná kyselina; oblička, oblička
CISTANCHE ZLEPŠÍ OCHORENIE OBLIČIEK/OBLIVÍN
2. Výsledky
2.1. Zmeny funkcie obličiek a histologické nálezy
V porovnaní s kontrolnou skupinou bola hladina močovinového dusíka (BUN) v krvi v Nx a Nx liečených omega{0}}} FA významne zvýšená (kontrolná skupina 17,7 ± 1,5, Nx skupina 77,7 土 28,4 a sýkorka s omega-3 FA skupina 63,9 土 17.0 mg/dl, p = 0.{{20}}07). Hoci medzi skupinami Nx a Nx liečenými omega-3 FA nebol žiadny významný rozdiel, hladiny BUN boli numericky nižšie v skupine Nx liečenej omega-3 FA. Hladina sérového kreatinínu (sCr) medzi týmito tromi skupinami bola podobná hladine BUN (kontrolná skupina, 0,4 0,0 U; skupina Nx, 1,3 µg 0,6; omega-3 FA, 1,0 ± 0,3 mg/dl; y=0,008). V porovnaní s kontrolnou skupinou sa pozorovala závažná tubulárna dilatácia a atrofia pomocou farbenia PAS v skupine Nx (doplnkový obrázok S1). Okrem toho výsledky ukázali, že skupina Nx liečená omega-3 FA vykazovala menšie tubulointersticiálne zmeny ako skupina Nx. Thefunkcie obličieka histologické zmeny v týchto troch skupinách už boli zaznamenané v predchádzajúcej štúdii [12].
22 Zmeny vo faktoroch súvisiacich s mitochondriálnou biogenézou
2.2.1. Expresia Nrf1 a Nrf2.V porovnaní s kontrolnou skupinou skupina Nx vykazovala významne zníženú úroveň expresie jadrového respiračného faktora 1 (Nefl) a faktora 2 súvisiaceho s jadrovým faktorom erytroidným 2-faktorom 2 (Nrf2). Avšak v skupine Nx liečenej omega-3 FA bola hladina expresie Nrf1 a Nrf2 významne zvýšená v porovnaní so skupinou Nx, ale nedosiahla úroveň kontrolnej skupiny (Oigure P, doplnkový obrázok St) . Tieto výsledky sa tiež našli kvantitatívnou analýzou PCR v reálnom čase cn Nrf1 mRNA (doplnkový obrázok S3).
2.2.3. Vyjadrenie faktorov súvisiacich s PGC-1 Aktivita: pAMPK, SIRT1/3.V porovnaní s kontrolnou skupinou vykazovali skupiny Nx a Nx liečené omega-3 významne nižšie hladiny fosforylovaného AMPK (pomer tekvice k AMPK) (obrázok 3A). Okrem toho skupina Nx vykazovala významne nižšiu úroveň expresie sirtuínu 1 (SIRT1) v porovnaní s kontrolnou skupinou (obrázok 3B, doplnkový obrázok S6). Po pridaní omega-3 FA sa však expresia SIRT1 relatívne zvýšila, ale tento rozdiel nebol štatisticky významný. Tieto výsledky sa našli v kvantitatívnej analýze mRNA SIRT1 v reálnom čase PCR (doplnkový obrázok S7). Naopak, expresia sirtuínu 3 (SIRT3) bola významne znížená v skupine Nx v porovnaní s kontrolnou skupinou, ktorá bola významne zachránená v skupine Nx liečenej omega-3 FA (obrázok 3C).
2.2.4. Expresia Keap1, mTOR, FoxO1 a FoxO3, V porovnaní s kontrolnou skupinou bola v skupine Nx významne zvýšená expresia Kelchovho EC H-asociovaného proteínu 1 (Keap1) a Forkhead box proteínov O1 a O3 (FoxO1/3). . V skupine Nx liečenej omega-3 FA bola hladina expresie Keap1 a FoxO1/3 významne znížená v porovnaní so skupinou Nx (obrázok 4C,E,F). V porovnaní s kontrolnou skupinou bola expresia mTOR významne znížená v skupine Nx. Avšak v skupine Nx liečenej omega-3 FA bola expresia mTOR zachránená, ale nedosiahla úroveň v kontrolnej skupine (obrázok 4B)
2.2.5. Obsah mitochondriálnej DNA (mtDNA), Významné zníženie mtDNA bolo pozorované v skupine Nx v porovnaní s kontrolnou skupinou. Znížené množstvo mtDNA sa však významne obnovilo v skupine omega-3 Nx liečenej Nx (doplnkový obrázok S9).
3. Diskusia
PGC-1, ktorý sa aktivuje fosforyláciou a deacetyláciou, je hlavným regulátorom mitochondriálnej biogenézy a produkcie energie. Zistili sme zníženie expresie a deacetylácie PGC-1 v modeli CKD. Je pozoruhodné, že znížená PGC-1 deacetylácia je hlavným mechanizmom, ktorý prispieva k dysfunkčnej mitochondriálnej biogenéze a zníženej produkcii energie pri CKD. AMPK aktivuje PGC-1 prostredníctvom fosforylácie jeho treonínových alebo serínových zvyškov [13,14]. AMPK sa tiež aktivuje po fosforylácii, keď je pomer AMP/ATP vysoký. Je však známe, že AMPK je pri CKD inaktivovaný v dôsledku zhoršeného snímania vysokých hladín AMP [15,16]. Podobne ako v predchádzajúcich štúdiách sme preukázali, že fosforylácia AMPK bola významne znížená vobličkytkaniva skupiny Nx. Hoci sa zdá, že pPGC-1/PGC-1 je do určitej miery zvýšené v skupine Nx, je nepravdepodobné, že by sa úroveň fosforylácie PGC-1 zvýšila v dôsledku zníženého PGC{{3 }} výraz. Okrem toho skupina Nx liečená omega-3 FA tiež vykazovala podobné výsledky ako skupina Nx, čo naznačuje, že podávanie omega-3 FA neovplyvnilo fosforyláciu AMPK a PGC{{6} } . Deacetylácia sa môže vyskytnúť v celej sekvencii PGC-1 a SIRT1 a 3 hrajú hlavnú úlohu v procese deacetylácie [13,14]. Po podaní omega-3 FA sa hladina expresie PGC-1, SIRT1 a 3 zvýšila, čo viedlo k záchrane deacetylovaného PGC-1 na rovnakú úroveň ako v normálnej kontrolnej skupine . Záchrana úrovne expresie Nrf1 a Nrf2, ktorá je preukázaná v skupine Nx liečenej omega-3 FA, priamo súvisí so zvýšením úrovne expresie SIRT1 a 3, čo ďalej viedlo k deacetylácii PGC{ {22}}.
CISTANCHE ZLEPŠÍ FUNKCIU OBLIČIEK/RENÁL
Nedávne štúdie o mitochondriách vochorenie obličiekukázali, že zvýšenie úrovne expresie PGC{0}} alebo SIRT prostredníctvom genetických alebo farmakologických zásahov zlepšilopoškodenie obličiekna zvieracích modeloch AKI [5–7,17,18]. Základný mechanizmus zahŕňa účinok zlepšenia oxidačnej alebo antioxidačnej odpovede FA. Predchádzajúca štúdia uvádza, že podávanie omega-3 FA zlepšilo mitochondriálnu beta-oxidáciu FA a vykazovalo antioxidačné účinky na modeli potkanov 5/6 Nx [19]. Existujú aj správy naznačujúce, že omega-3 FA zvyšuje expresiu PGC-1, Nrf1 a SIRT1 vo svalových bunkách, makrofágoch a nervových bunkách [3,10,11]. Keďže účinky omega{16}} FA na mitochondrie v modeli CKD ešte neboli hlásené, preukázali sme, že omega{17}} FA je účinný pri obnove molekúl súvisiacich s mitochondriálnou biogenézou a mtDNA pomocou modelu CKD v tomto štúdium.
mTOR aj AMPK sa podieľajú na mitochondriálnej biogenéze, ale ich úlohy sa líšia v závislosti od stavu výživy. mTOR, cieľ rapamycínového komplexu 1 (mTOC1), môže byť aktivovaný prostredníctvom energetických stimulov, ako je aminokyselina alebo glukóza, a môže spustiť dráhy, ktoré vedú k anabolickým procesom a mitochondriálnej biogenéze. Naopak, AMPK sa môže aktivovať hypoxiou a nutričným deficitom, čo vedie k aktivácii katabolického procesu a mitochondriálnej biogenéze a inhibuje spotrebu energie prostredníctvom mTOC1 [2]. V tejto štúdii sme preukázali nielen pokles pAMPK/AMPK, ale aj pokles mTOR v modeli CKD. Okrem toho podávanie omega-3 FA viedlo k takmer obnoveniu expresie mTOR, ale k žiadnemu zotaveniu poklesu pAMPK/AMPK. Preto omega-3 FA môžu zmierniť zníženú mitochondriálnu biogenézu zvýšením expresie mTOR vobličkyzvieracieho modelu CKD. Je však potrebné vykonať ďalšie štúdie, aby sa objasnilo, či je mTOR znížený u pacientov s CKD a ako zvýšenie expresie mTOR prostredníctvom liečby omega-3 FA ovplyvní mitochondriálne zdravie a progresiu CKD.
FoxO1 a 3 sa viažu na PGC-1 promótor a zvyšujú jeho transkripciu [20,21]. V tejto štúdii sa však zistilo, že FoxO1 a 3 boli zvýšené v skupine Nx a znížené v kontrolnej skupine a skupine Nx liečenej omega-3 FA. Preto sa predpokladá, že expresia FoxO1 a 3 je relevantná pre kompenzačnú odpoveď na zníženie PGC-1 pri CKD alebo zvýšenie PGC-1 prostredníctvom podávania omega-3 FA. Nrf2 hrá dôležitú úlohu v bunkovej redoxnej homeostáze a mitochondriálnej biogenéze. Existujú tri systémy ubikvitín ligázy súvisiace s degradáciou Nrf2 (Keap1, proteín obsahujúci repetície transducínu a synoviálna E3 ubikvitín ligáza) [22]. V tejto štúdii sme preukázali významný pokles Nrf2 a významný nárast Keap1 v skupine Nx v porovnaní s kontrolnou skupinou. d Avšak v skupine Nx liečenej omega-3 FA bola zistená expresia Keap1 sa zníži a Nrf2 sa zvýši. Výsledky naznačujú, že zlepšený antioxidačný účinok podávania omega-3 FA v modeli potkanov CKD môže súvisieť so znížením expresie Keap1 a degradácie Nrf2, čo môže zvýšiť mitochondriálnu biogenézu. Na základe výsledkov získaných v tejto štúdii je potrebný ďalší výskum na objasnenie kauzálneho vzťahu medzi FoxO1/3 a Nrf2 v prostredí CKD a účinku podávania omega-3 FA.
CISTANCHE ZLEPŠÍ INFEKCIU OBLIČIEK/OBLIVÍN
Molekulová hmotnosť Nrf2 bola v tejto štúdii a ďalších nedávnych štúdiách zistená na ploche 68 kilodaltonov (kDa) [23,24]. Predchádzajúce štúdie však preukázali, že biologicky relevantná molekulová hmotnosť Nrf2 je 95–110 kDa [25,26]. Našli sme tiež pásy, ktoré boli podozrivé ako biologicky relevantné Nrf2 (doplnkový obrázok S8). Na nájdenie molekulovej hmotnosti biologicky dôležitého Nrf2 sú potrebné ďalšie štúdie. V predchádzajúcich štúdiách boli hlásené zmeny v mitochondriách na 28. deň po 5/6 Nx, čo naznačovalo zníženie expresie génu alebo proteínu spojeného s beta-oxidáciou, oxidačnou fosforyláciou a štrukturálnym proteínom vnútornej membrány, ale nedošlo k žiadnemu výsledku súvisiaci s výrazom PGC-1 [27,28]. V tejto štúdii sme potvrdili, že molekuly súvisiace s mitochondriálnou biogenézou a mtDNA odrážajúce mitochondriálnu biogenézu boli modulované počas chronického štádia, keďže zmeny boli pozorované na 45. deň po 5/6 Nx u potkanov. Napriek histologickým a biologickým zlepšeniam liečba omega-3 FA neviedla k funkčnej obnoveobličkyv porovnaní s modelom Nx. Preto je potrebný ďalší výskum, aby sa zistilo, či sú omega-3 mastné kyseliny účinné pri obnovefunkcie obličiekindukciou účinkov, ktoré môžu zlepšiť mitochondriálnu funkciu. V tejto štúdii je niekoľko obmedzení. Po prvé, nehodnotili sme aktivitu citrátsyntázy a tvorbu superoxidu v mitochondriálnom dýchacom reťazci. Po druhé, neexperimentovali sme s tým, ktoré zložky FA Omacoru sú ovplyvnené hlavne molekulami súvisiacimi s mitochondriálnou biogenézou. Po tretie, nepreukázali sme jasný mechanizmus na zlepšenie molekúl súvisiacich s mitochondriálnou biogenézou. Len navrhujeme, že protizápalový účinok, ktorý znižuje oxidačný stres a samotné omega-3 mastné kyseliny ako metabolické zlúčeniny, môžu súvisieť s týmto mechanizmom.
4. Materiály a metódy Mitochondriálna biogenéza
4.1. Zvieratá a experimentálny dizajnŠtúdie sa uskutočnili na samcoch potkanov Sprague-Dawley (vo veku 9-týždňov) zakúpených od Japan SLC, Inc. (Shizuoka, Japonsko). Všetky potkany boli podrobené buď simulovanej kontrole alebo 5/6 Nx. Všetky postupy zahŕňajúce zvieratá boli vykonané v súlade so súhlasom Inštitucionálneho výboru pre starostlivosť o zvieratá na univerzite Dong-A (DIACUC-14-4). Potkany boli chované za štandardných podmienok a bol im umožnený voľný prístup k vode z vodovodu a štandardnej strave. Všetky potkany boli zaradené do nasledujúcich skupín: skupina 1 (simulovaná kontrola, n=6), kontrolné potkany udržiavané na fyziologickom roztoku (1 ml/kg/deň výplachom žalúdka); skupina 2 (Nx skupina, n=6), Nx potkany udržiavané na fyziologickom roztoku (1 ml/kg/deň výplachom žalúdka); skupina 3 (skupina omega-3 FA), potkany Nx liečené omega-3 FA. Dávka a spôsob podávania omega-3 FA (Omacor, 300 mg/kg/deň žalúdočnou sondou, Pronova Biocare, Sandefjord, Nórsko) boli stanovené na základe predchádzajúcich štúdií [19]. Omacor je omega-3 MK pochádzajúca z mora a pozostáva zo 460 mg kyseliny eikozapentaénovej (EPA) a 380 mg kyseliny dokosahexaénovej (DHA) v 1 g lieku Omacor. Omacor sa zvyčajne predpisuje na sekundárnu prevenciu po infarkte myokardu a liečbe hypertriglyceridémie [29]. Dve omega-3 FA (EPA plus DHA) sú hlavnými (84 percent) a aktívnymi zložkami Omacoru, ktoré sú farmaceuticky pripravené
kompozície, ktoré prekonávajú minoritné zložky (16 percent). Omacor sme si vybrali na suplementáciu omega-3 FA s protizápalovým účinkom a znižovaním oxidačného stresu, pretože v klinických štúdiách znížil riziko kardiovaskulárnych ochorení [30]. Potkany boli kŕmené rovnomerne a ich hmotnosť bola denne pozorovaná. Potkanom bol umožnený voľný prístup k vode z vodovodu počas 15 týždňov po operácii a potom boli usmrtené pod anestéziou dietyléterom. Po smrti sa odobrala vzorka krvi z aorty a potom sa centrifugovala pri 3000 ot./min. počas 10 minút. Na identifikáciu zmien vfunkcie obličiekHladiny BUN a sCr boli merané pomocou automatického analyzátora (Roche, Nemecko).
4.2. Histopatologické vyšetrenie.Zafixované formalínomobličkytkanivá boli zaliate do parafínu, narezané na plátky (4 um) a zafarbené kyselinou jodistou-Schiff. Histopatologické zmeny boli pozorované pomocou Aperio ScanScope (Aperio Technologies, Vista, CA, USA).
4.3. Izolácia RNA a kvantitatívna analýza PCR v reálnom čase.Celková RNA bola extrahovaná zobličkytkanivách s použitím činidla TRIzol. Potom sa 1 ug celkovej RNA premenil na jednovláknovú cDNA pomocou súpravy na syntézu M-MLV cDNA (Enzynomics, Daejeon, Kórea). Priméry boli navrhnuté z príslušných génových sekvencií pomocou softvéru Primer3 a mfold. Pre kvantitatívnu PCR analýzu v reálnom čase bola cDNA podrobená PCR amplifikácii s použitím génovo špecifických primérov: potkan PGC1 50- CCG AGA ATT CAT GGA GCA AT-30(sense), 50- GTG TGA GGA GGG TCA TCG TT-30(antisense); potkan Nrf1 50- GTT TCA TGG ACC CAA GCA TT-30(zmysel), 50- GGT GGC CTG AGT TTG TGT CT-30(protizmysel); potkan SIRT3, 50- GAG ACT TGG TGG GGT CCT TT -30(zmysel), 50- ATC CTG CAG CTC TTG TGT CC -30(protizmysel); potkan SIRT1, 50- CAG GTT GCA GGA ATC CAA AG -30(zmysel), 50- CTC CAC GAA CAG CTT CAC AA -30(protizmysel); potkaní aktín, 50- GCG CAA GTA CTC TGT GTG GA -30 (zmysel), 50- CAT CGT ACT CCT GCT TGC TG -30 (protizmysel). PCR v reálnom čase sa uskutočnila s použitím SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) s prístrojom ABI 7500 (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA).
CISTANCHE ZLEPŠÍ BOLESŤ OBLIČIEK/OBLIVÍN
4.4. Western blotting a imunoprecipitácia.Western blotting bol analyzovaný tak, ako bolo opísané vyššie, s miernymi modifikáciami [10].Obličkytkanivá boli homogenizované lyzačným pufrom (PRO-PREP proteínový extrakčný roztok), inkubované (30 minút pri 4 °C) a centrifugované (14,000 rpm počas 20 minút pri 4 °C). Koncentrácia proteínu bola stanovená pomocou Bradfordovho proteínového testovacieho činidla (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Rovnaká vzorka proteínu bola nanesená na 7,5-15% SDS-PAGE a prenesená na nitrocelulózovú membránu (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA). Potom boli proteíny imunoblotované s každou protilátkou. Protilátky proti PGC-1 a SIRT1 boli získané od Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Protilátky proti AMPK, pAMPK, Nrf1, SIRT3, Fox01, Fox03a a mTOR boli zakúpené od Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Protilátky proti Nrf2, Keap1 (monomér) a -aktín boli zakúpené od Abcam (Cambridge, MA, USA) a Sigma (St. Louis, MO, USA). Na imunoprecipitáciu sa celkovo 500 ug proteínu inkubovalo s PGC-1 protilátkami (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) a proteínovými A/G plus-agarózovými guľôčkami (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) a nechal sa miešať pri 4 ◦C cez noc. Imunoprecipitáty sa potom separovali pomocou elektroforézy SDS-PAG a imunoblotovali s použitím protilátok acetyl-lyzín (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) a fosfoserín (MerckMillipore, Burlington, MA, USA). Membrány sa následne inkubovali so sekundárnou protilátkou konjugovanou s chrenovou peroxidázou počas 60 minút pri teplote miestnosti. Hladiny proteínov boli štandardizované pomocou -aktínu (ImageJ verzia 1.48q). Western blotting a imunoprecipitačná analýza s protilátkami sa uskutočnila s použitím chemiluminiscenčného substrátu zosilneného Super Signal West Pico (Thermo Scientific, Hudson, NH, USA) a detegovala sa pomocou LAS-3000} Plus (Fuji Photo Film, Tokio, Japonsko).
4.5 Meranie obsahu mtDNANa stanovenie relatívneho obsahu mtDNA sa použila qPCR. Reakcia sa uskutočnila pomocou SYBR Green chemistry s použitím 3 ng celkovej DNA ako templátu a nasledujúcich primérov: potkania mtDNA 5'-GGTTCTTACTTCAGGGCCATCA-3' (sense), 5,-TGATTAGACCCGTTACCA TCGA-3}' ( antisense); potkaní p-aktín, 5'-CCCAGCCATGTACGTAGCCA (sense), C- CGTCTC- CGGAGTCCATCACf (antisense). Obsah mtDNA vo vzťahu k jadrovej DNA bol uvedený v [31].
4.6 Štatistická analýzaŠtatistické analýzy sa uskutočnili pomocou softvéru SPSS 18.0 (IBM Corp., Armonk, NYP USA). Výsledky sú vyjadrené ako priemer ± SD. Priemery pre skupiny sa porovnávali analýzou rozptylu, po ktorej nasledovali Tukeyho viacnásobné porovnania. p e 0.05 sa považovalo za štatisticky významné.
5. Závery
Presvedčivo sa v modeli potkanov CKD pozorovali významné modulácie v expresii mediátorov súvisiacich s mitochondriálnou biogenézou. Omega-3 FA môže zlepšiť mitochondriálnu biogenézu zvýšením regulácie Nrf1 a Nrf2. Tento ochranný mechanizmus môže byť spustený prostredníctvom zvýšenia expresie PGC-1 a deacetylácie PGC-1, ktorá bola spustená zvýšenou produkciou SIRT1/3 (obrázok 5). Obrázok 5. Účinok omega-3 FA na mitochondriálnu biogenézu pri CKD. Tučné čierne šípky označujú expresiu mediátorov súvisiacich s mitochondriálnou biogenézou v modeli potkanov CKD. Červené šípky označujú vyjadrenie mediátorov po podaní omega-3 FA. Šípky hore / dole označujú zvýšenie a zníženie expresie mediátorov.
