Optogenetické frekvenčné miešanie hipokampálnych théta oscilácií disociuje získavanie pracovnej pamäte z hipokampálnych časopriestorových kódov 3. časť

Optogenetická stimulácia neurónov MS vedie k nefyziologickej synchrónii theta

Prekvapivo 8 Hz optogenetické stimulácie, ktoré sú spojené so stimuláciou oscilácií theta, viedli k zníženému výkonu, keď sa aplikovali buď počas kódovania alebo získavania epizodickej pamäte v úlohe NPOR, ako aj pri získavaní priestorovej pracovnej pamäte v DNMTStask. Aby sme ďalej pochopili účinky stimulácie theta na hipokampalfyziológiu, analyzovali sme fázové uzamknutie oscilácie theta pred a počas 8 Hz optogenetickej stimulácie (doplnkový obrázok 7a) a zistili sme, že takáto stimulácia viedla k zvýšenej fázovej synchronizácii medzi stimulačnými epochami (doplnkový obrázok 7b). Ďalej sme analyzovali krížovú koreláciu oscilácií theta cez dorzálny CA1 (vzdialenosť ~ 1 mm medzi elektródami pozdĺž septotemporálnej osi (doplnkový obrázok 7c) a zistili sme, že stimulácia rytmov theta pri 8 Hz viedla k zvýšenej krížovej korelácii medzi týmito dvoma elektródami ( Doplnkový obrázok 7d).

Genetika je veda, ktorá študuje genetickú dedičnosť a variácie a pamäť je aspektom veľkého záujmu. Čo má teda genetika spoločné s pamäťou? Tento článok bude skúmať problémy súvisiace s pamäťou z genetického hľadiska.

V prvom rade vieme, že genetické gény sú základom ľudského fyzického a intelektuálneho rozvoja a to, či sú tieto gény lepšie, ovplyvní pamäť ľudí. Najnovšie výskumy ukazujú, že IQ a pamäť ľudí ovplyvňujú genetické faktory. Výskum ukazuje, že genetické gény hrajú kľúčovú úlohu v inteligencii a pamäti. Niektorí ľudia sa preto rodia so silnejšími spomienkami, zatiaľ čo iní musia tvrdo pracovať a trénovať, aby si pamäť zlepšili.

Po druhé, faktory životného prostredia sú tiež dôležitými faktormi pri rozvoji pamäti. Potrebujeme nielen podporu genetických génov, ale tiež potrebujeme zlepšiť našu pamäť prostredníctvom vedeckého tréningu a dobrých životných návykov. Môžeme napríklad trvať na každodennom cvičení, dostatočnom spánku, dodržiavaní zásad priraďovania jedál atď., čo môže pomôcť zlepšiť funkciu nášho mozgu a pamäť.

Napokon, bežní ľudia, príliš nezdôrazňujte vplyv genetických faktorov na rozvoj pamäti. Pretože genetické faktory nie sú absolútne, ľudská pamäť a inteligencia sa môžu stále zlepšovať zlepšovaním svojho úsilia a tréningu. Vždy by sme si mali zachovať pozitívny a neustály prístup k učeniu a neustále skúmať a rozvíjať svoj pamäťový potenciál. Verím, že len tak sa môžeme stať múdrejšími a mať väčší pocit úspechu. Aby sme to zhrnuli, vzťah medzi genetikou a pamäťou je veľmi úzky, ale nemali by sme príliš zdôrazňovať genetické faktory, ale mali by sme neustále zlepšovať svoju pamäť a inteligenciu prostredníctvom sebazdokonaľovania a tréningu.

Je vidieť, že si musíme zlepšiť pamäť. Cistanche deserticola môže výrazne zlepšiť pamäť, pretože Cistanche deserticola je tradičný čínsky liečivý materiál s mnohými jedinečnými účinkami, z ktorých jedným je zlepšenie pamäte. Účinnosť mletého mäsa spočíva v rôznych aktívnych zložkách, ktoré obsahuje, vrátane kyselín, polysacharidov, flavonoidov atď. Tieto zložky môžu podporovať zdravie mozgu rôznymi spôsobmi.

Kliknite na spoznajte 10 spôsobov, ako zlepšiť pamäť

Diskusia

Within the septohippocampal system, the exact causal relationships between (1) MS activity, (2) hippocampal oscillations, (3) hippocampal neuron activity, and (4) behavior, including memory, remain an active area of research. In particular, whether and how the MS supports encoding of place and time in the hippocampus, as well as its specific contribution to memory function, remain unclear. Here, we leveraged more recent techniques that allowed us to record >1000 neurónov pri vykonávaní optogenetickej stimulácie MS neurónov so subsekundovým rozlíšením na kontrolu theta rytmov a posúdenie ich úlohy vo fyziológii a pamäti hipokampu. Dôležité je, že pomocou excitačnéhoopsínu a buď miešanej alebo 8 Hz stimulácie sme boli schopní dôsledne a robustne zrušiť alebo stimulovať hipokampálnu thetu.

V porovnaní s inhibíciou MS buď pomocou inhibičného opsínu alebo farmakologických zlúčenín (napr. muscimol), náš prístup umožňuje porovnanie dvoch protichodných stavov v rámci subjektu (temped vs. abolishedtheta) pri zachovaní úrovní aktivity v MS-PV bunkách. Skombinovali sme odčinenú úlohu lineárnej stopy, ktorá nám spolu s informačno-teoretickými prístupmi umožnila rozlúštiť priestorové a časové hipokampálne kódy. Táto metóda zmierňuje potrebu arbitrárnych prahov, čo umožňuje štandardizovaný prístup k zobrazovacej analýze vápnika. Zatiaľ čo veľká časť CA1 pyramídových neurónov exprimovala zmes časopriestorových kódov, naše analýzy sme zamerali na neuróny ladené špecificky na miesto, čas alebo prejdenú vzdialenosť.

Zatiaľ čo priestorové kódovanie sa vo veľkej miere skúmalo v CA1, v poslednej dobe sa viac zaujímalo o časové kódy a kódy vzdialenosti. Kódy času28, 35–37 a vzdialenosť37 boli extrahované upínaním vizuálnych priestorových podnetov alebo extrahované analyticky pomocou zovšeobecnených lineárnych modelov v paradigmách virtuálnej reality26,27,38. Tu navrhujeme prístup k rozuzleniu priestorových, časových a dištančných kódov pomocou informačného teoretického prístupu, ktorý spolu s našou úlohou cuedalternation umožňuje analýzu časopriestorových a multiplexných kódov v reálnom svete u voľne sa pohybujúcich zvierat. Veľké množstvo pyramídových neurónov CA1 kóduje okrem signálov vlastného pohybu, ako je zrýchlenie, rýchlosť a orientácia, aj multiplexné informácie o polohe, vzdialenosti a čase, ako už bolo uvedené26, 27, 38.

Zistili sme, že frekvenčné skramblovanie a 8 Hz optogenetické stimulácie drasticky zrušili alebo stimulovali theta rytmy a viedli k zníženiu celkovej aktivity v subpopulácii CA1 pyramidálnych buniek, pričom nespôsobili významné zmeny v bunkovej aktivite miesta, podobne ako predchádzajúce správy s použitím buď farmakologickej inhibície36, 46,47 alebo optogenetická9,48 stimulácia MS alebo septálnych vstupov do hipokampu. Keďže je známe, že MS neuróny sú primárnou hnacou silou hipokampálnych oscilácií, očakávali sme, že stimulácia MS bude spojená s narušenou časovou alebo vzdialenostnou bunkovou aktivitou v podmienkach znížených theta rytmov, ale nenastali žiadne zmeny, keď bola theta zrušená alebo stimulovaná. Okrem toho stimulácia hipokampálnych oscilácií na 8 Hz neviedla k zmenám v kvalite priestorových kódov, ako sa uvádzalo skôr9, a nezmenilo časové kódy, ako je pozorované v našej behaviorálnej paradigme.

Hoci sa uvádzalo, že časové (ale nie miesto) bunky môžu priamo závisieť od vstupov mediálneho entorinálneho kortexu (MEC)61, nedávne experimentálne dôkazy naznačujú, že lézie MEC nevedú k žiadnym zmenám vo fyziológii hipokampálnych časových buniek62. Predovšetkým novší výskum zistil, že optogenetická stimulácia MS nenarušila priestorové kódy mriežkových buniek v entorhinálnom kortexe63, čo ďalej naznačuje, že aktivita MS nie je priamo zapojená do priestorových kódov v hipokampálnej formácii. Spolu s našimi výsledkami to naznačuje, že časové kódy môžu byť buď výsledkom výpočtov závislých od MS v rámci entorhinálneho kortexu63 (1), alebo môžu byť generované vnútorne v rámci samotného hipokampu (2).

Zatiaľ čo skoré štúdie zistili, že SM zohrávala zásadnú úlohu pri udržiavaní časových buniek a podpore pracovnej pamäte36, nedávne experimentálne dôkazy ukazujú, že presný príspevok časových buniek k výkonu pracovnej pamäte môže byť menší, než sa pôvodne predpokladalo62. Pretože neuróny MS-PV si pravdepodobne udržiavajú významné úrovne aktivity počas optogenetickej stimulácie s kódovaním frekvencie (na rozdiel od inhibičných prístupov), naše výsledky silne podporujú úlohu presne načasovanej aktivity septa pri podpore pracovnej pamäte, ktorá bola predtým hypotetizovaná. Aj keď sme pozorovali znížený výkon pamäte pri použití optogenetickej stimulácie počas vyhľadávania, stimulácia počas fázy kódovania úloh DNMTS nebola spojená so zníženou pamäťou v úlohe DNMTS. Stimulácia thetaoscilácií pri 8 Hz počas kódovacej alebo vyhľadávacej fázy úlohy NOPR viedla k zhoršenému získavaniu pamäte. Naše elektrofyziologické analýzy ďalej odhaľujú, že takáto stimulácia spôsobila, že vzdialené oblasti dorzálneho CA1 boli strhávané v rovnakej fáze, s nefyziologickým blokovaním fázy. Aj keď sme priamo neskúmali kauzálny vzťah medzi fázovými zmenami a výkonnosťou pamäte, zistilo sa, že spiketiming a fázová precesia sú tiež spojené so zmenenou funkciou pracovnej pamäte napriek tomu, že kódovanie miesta zostalo nedotknuté64. Okrem toho sa už predtým ukázalo, že fázové uzamknutie pyramídových neurónov k thetaosciláciám je prediktorom výkonnosti pamäte65.

Jedným z obmedzení nášho prístupu k určovaniu vlastností temporálneho a vzdialenostného ladenia je najmä to, že vyžaduje štyrikrát viac vzorkovania ako bežná lineárna stopa, čo zvyšuje šance na odfarbenie pri pridávaní stimulačných podmienok do experimentálnej časovej osi. Aj keď sme zistili, že priestorové kódy zostali neovplyvnené optogenetickými stimuláciami v rámci tej istej relácie, novší zobrazovací hardvér, ktorý obsahuje senzory so zvýšenou citlivosťou, by mohol pomôcť zabrániť fotobieleniu a umožniť dlhšie relácie nahrávania, čím sa odoberú vzorky časových a vzdialených buniek spolu so stimuláciami. Zistili sme tiež, že skupina neurónov, ktoré významne a špecificky kódujú iba jednu premennú, je malá v porovnaní s počtom konjunktívnych neurónov, čím sú požiadavky na odber vzoriek pre tieto vysoko špecifické neuróny oveľa vyššie.

Poskytujeme experimentálny dôkaz, že manipulácia s MS nemení lokomotorickú rýchlosť a že naopak, lokomočná rýchlosť určuje frekvenciu theta. Aj keď sa počas našich stimulácií MS zachovali kódy miesta a času, časť (~ 6%) buniek bola priamo modulovaná a mohla zodpovedať za zhoršenie pamäti pozorované v našich behaviorálnych testoch. PV interneuróny v hipokampe sa už predtým uvádzali ako súčasť mikroobvodu, ktorý je nevyhnutný pri regulácii konsolidácie pamäte66, 67 a naše optogenetické manipulácie by mohli byť spojené s umlčaním časti týchto buniek. Okrem toho, aj keď sme nepozorovali zmeny vo frekvenčných pásmach iných ako theta, nemôžeme vylúčiť, že načasovanie špičiek CA1 pyramídových neurónov by sa mohlo drasticky zmeniť pri zakódovaní oscilácií theta, zatiaľ čo sa ukázalo, že stimulácia 8 Hz neviedla k zvýšeniu aktivity hipokampu18, čo by mohlo vysvetliť rozdielne účinky stimulačné vzorce na výkon pracovnej pamäte. Poruchy pamäti, ktoré sme pozorovali, boli pravdepodobne necholinergné: po prvé, v našich imunohistologických experimentoch sme nezistili prakticky žiadnu expresiu ChrimsonR v ChAT neurónoch MS. Po druhé, naše optogenetické stimulácie neboli spojené so zmenami v hipokampálnych vlnách, zatiaľ čo predchádzajúce správy naznačujú, že stimulácia Neuróny ChAT sú spojené so zníženou frekvenciou zvlnenia45,57. ChrimsonR transfekcia neurónov MS VGLUT2 je tiež nepravdepodobná, pretože aktivácia týchto neurónov je spojená s priamym zvýšením lokomotorickej aktivity 68, čo sme nepozorovali.

Hoci presné časové usporiadanie pyramídových hrotov CA1 by mohlo aspoň čiastočne vysvetliť účinky stimulácie MS na pamäť, mali by sa vziať do úvahy alternatívne mechanizmy. Je pozoruhodné, že okrem hipokampu a entorinálneho kortexu sa MS PVneuróny premietajú do retrospleniálneho kortexu3 a mohli by byť zodpovedné za niektoré tu pozorované poruchy pamäti.

Stručne povedané, pomocou kalciového zobrazovania, optogenetiky a elektrofyziológie sme zistili, že theta rytmy možno stimulovať alebo zrušiť pomocou stimulácie SM. Takáto stimulácia narušila epizodické, ako aj vyhľadávanie pracovnej pamäte. Tieto účinky boli necholinergné a nenarušili aktivitu hippocampu. Nakoniec, zatiaľ čo malá časť hipokampálnych neurónov reagovala priamo na optogenetickú stimuláciu MS, bunky miesta, času a vzdialenosti neboli narušené manipuláciami s osciláciami theta. Tieto výsledky spolu naznačujú, že zatiaľ čo vstup MS do hipokampu hrá zásadnú úlohu v pamäti, multiplexné kódy v CA1 pyramidálnych neurónoch nemusia byť priamym substrátom pre takéto funkcie.

Metódy

Zvieratá

Všetky postupy boli schválené výborom McGill University Animal CareCommittee a Kanadskou radou pre starostlivosť o zvieratá (protokol 2015-7650). Celkom n=41 samcov (n=20) a samíc (n=21) vo veku 8 až 16 týždňov, B6;129P2 PV-Cre myší (Jackson Laboratory, RRID: IMSR{{ 10}}JAX:017320) boli v tejto štúdii použité. n=5 myší sa použilo na kombináciu optogenetiky so zobrazovaním vápnika; n=3 myšiam bolo implantovaných na kalciové zobrazovanie, optogenetiku a elektrofyziologické kontroly; n=4 myší sa použilo v elektrofyziologických štúdiách; n=29 myší bolo transfekovaných a implantovaných na behaviorálne testy. Myši boli chované individuálne v 12-hodinovom cykle svetlo/tma pri 22 stupňoch a 40 % vlhkosti s potravou a vodou podľa chuti. Všetky experimenty sa uskutočnili počas svetlej časti cyklu svetlo/tma.

Adeno-asociované vírusové vektory

Adeno-asociovaný vírus AAV5.CamKII.GCaMP6f.WPRE.SV40 (Addgene# 100834, získaný z University of Pennsylvania Vector Core) sa použil vo všetkých experimentoch so zobrazovaním vápnika. Adeno-asociovaný vírus (AAV) sérotypu dj (hybridný kapsid vytvorený z ôsmich rôznych sérotypov AAV) AAVdj-hSyn-ChrimsonR-tdTomato sa získal zo zariadenia Vector Core Facility na Oregonskej zdravotníckej a vedeckej univerzite v Portlande, Oregon. Hoci ide o housekeeping gén, nepozorovali sme transfekciu v cholinergných bunkách (pozri „Výsledky“ a Obr. 2b–e). Ako kontrola sa použil konštrukt eYFP bez sekvencie ChrimsonR (v tomto rukopise nazývaný kontrola YFP).

Chirurgické zákroky

Myši sa anestetizovali izofluránom (5 % indukcia, 0,5–1 % udržiavanie) a umiestnili sa do stereotaxického rámu (David Kopf Instruments). Telesná teplota sa udržiavala pomocou vyhrievacej podložky, oči sa hydratovali gélom (Optixcare). a Carprofen (10 ml/kg) bol podávaný subkutánne. Lebka bola úplne zbavená všetkého spojivového tkaniva a boli vykonané malé kraniotómie pomocou zubnej vŕtačky na následnú injekciu alebo implantát.

Vírusové injekcie. Všetky vírusové injekcie sa uskutočnili pomocou sklenenej pipety pripojenej k injektoru Nanoject III (Drummond). 500 nl AAVdjhSyn-ChrimsonR-tdTomato (alebo kontrola eYFP) bolo dodaných do MS rýchlosťou 1 nL/s, pri nasledujúcich súradniciach založených na referenčnom myšom stereotaxickom atlase69 (vzdialenosť od Bregmy v mm): predozadná (AP) 0,85, mediolaterálna (ML) 0, dorzoventrálna (DV) −4,50 s použitím 5 stupňového uhla v rovine ML. Po operácii boli zvieratá monitorované až do zotavenia.

Implantát z optických vlákien. Dva týždne po injekcii boli myši anestetizované na implantáciu po rovnakom chirurgickom zákroku. Na rovnakých súradniciach bola implantovaná vláknová optika s priemerom 200 μm s keramickou objímkou ​​(Thorlabs). Implantáty boli cementované na mieste pomocou C&B-Metabond® (Patterson dental). Čierny lak na nechty bol aplikovaný na zubný cement, aby sa zablokovala emisia svetla počas optogenetickej stimulácie.

Elektródové implantáty. Súbor 7 volfrámových mikroelektród (~ 1 MΩimpedancia) bol znížený v dorzálnom CA1 presahujúcom stratumpyramidale (pyr), stratum radiatum (rad) a stratum lacunosummoleculare (lm). Skrutky umiestnené v kosti nad predným kortexom a mozočkom slúžili ako základ a referenčné. Po umiestnení elektródy, uzemnenia a referenčného umiestnenia bol aplikovaný dentálny cement na trvalé upevnenie implantátu k lebke.

Implantát na zobrazovanie vápnika. Injikovali sme vírus AAV5.CamKII.GCaMP6f (200 nL pri 1 nl s−1) do hipokampálneho CA1 pomocou nasledujúcich súradníc: anteroposterior (AP) − 1.86 mm od bregmy, mediolaterálne (ML) 1,5 mm, dorzoventrálne (DV) 1,5 mm. Dva týždne po injekcii boli myši anestetizované izofluránom a lebka bola vyčistená. A<2 mm diameter craniotomy was performed in the skull above the injection site. An anchor screw was placed on the posterior plate above the cerebellum. The dura was removed, and the portion of the cortex above the injection site was aspirated using a vacuum pump until the corpus callosum was visible. These fiber bundles were then gently aspirated without applying pressure on the underlying hippocampus, and a 1.8 mm diameter gradient index (GRIN; Edmund Optics) lens was lowered at the following coordinates: AP − 1.86 mm from bregma, ML 1.5 mm, DV 1.2 mm. The GRIN lens was permanently attached to the skull using C&B-Metabond (Patterson Dental), and Kwik-Sil (World Precision Instruments) silicone adhesive was placed on the GRIN to protect it. Four weeks later, the silicone cap was removed and CA1 was imaged using a miniscope mounted with an aluminum base plate while mice were under light anesthesia (<0.5% isoflurane) to allow the visualization of cell activity. When a satisfying field of view was found (large neuronal assembly, visible landmarks), the base plate was cemented above the GRIN lens, the mini scope was removed, and a plastic cap was placed on the base plate to protect the GRIN lens.

Simultánne zobrazovanie vápnika a elektrofyziologické záznamy. Aby sme kontrolovali účinky implantátov GRIN na hipokampálne theta, ako aj prehovory medzi mini-scope a optogenetickými excitačnými svetlami, na šošovky GRIN sme pripojili volfrámové mikroelektródy. Za týmto účelom sme šošovky GRIN umiestnili horizontálne pod mikroskop s nízkym zväčšením v bezprašnom prostredí. Na horný okraj šošovky GRIN bola pomocou mikromanipulátora jemne umiestnená volfrámová mikroelektróda. Použili sme známy priemer šošovky GRIN ako referenčnú jednotku na odhadnutie požadovaného vyčnievania elektródy (~50 µm, ďalej digitálne hodnotené po zhotovení mikrofotografie prípravku) podľa našich plánovaných implantačných súradníc. Malé množstvá (~ 50 ul) superglue boli nanesené na horný okraj šošovky GRIN s elektródou na mieste a ponechané sušiť po dobu ~ 10 minút, pred aplikáciou ďalšej vrstvy lepidla. Na udržanie elektródy pripojenej k šošovke GRIN bolo použitých päť tenkých vrstiev. Po implantácii týchto zostáv elektród GRIN pomocou protokolu opísaného vyššie boli vyčnievajúce drôty jemne ohnuté a skryté pod ochranným uzáverom (1–1, 5 cm vysoký) získaným z hrušky ručnej sacej pipety ako náhrada za Kwik-Sil.

In vivo behaviorálne postupy

Habituácia. S myšami sa jemne manipulovalo počas ~ 5 minút počas jedného týždňa s postupným privykaním na postup upchávania (optické vlákno, miniskop a elektrofyziologické predamplifikované ukotvenia). Zvieratá sa potom naplánovali na vodu (prístup 2 hodiny denne).

Záznamy z miniskopu. Miniskopy (V3) boli zostavené pomocou inštrukcií s otvoreným zdrojom (miniscope.org). Zobrazovacie údaje boli získané pomocou zobrazovacieho snímača CMOS (Aptina, MT9V032) a multiplexované cez odľahčený koaxiálny kábel. Dáta boli získané pomocou boxu na získavanie údajov (DAQ) pripojeného cez USB hostiteľský ovládač (Cypress, CYUSB3013). Správanie zvierat sa zaznamenávalo pomocou spotrebiteľskej webovej kamery (Logitech) namontovanej nad prostredím. Údaje o vápniku a správaní boli zaznamenané pomocou miniscope.org, zdrojového softvéru DAQ customacquisition. DAQ súčasne získal behaviorálne a celulárne zobrazovacie toky pri 30 Hz ako nekomprimované.avi súbory s 1000 snímkami pre 15-minútové záznamové relácie, spolu s príslušnými časovými pečiatkami na umožnenie presného časového zarovnania behaviorálnych a vápnikových zobrazovacích údajov.

Elektrofyziologické záznamy in vivo. Po 1 týždni po chirurgickom zotavení a jednom týždni privykania si na nastavenie uväzovania sa zaznamenal LFP z implantovaných myší. Všetky zaznamenané signály z implantovaných elektród boli zosilnené pripojovacím predzosilňovačom a potom boli digitalizované pri 22 kHz pomocou digitálneho záznamového systému (Neuralynx, USA). Záznamy každého kanálového signálu boli uložené spolu s videonahrávkami a TTL signálmi z laserovej diódy na následnú analýzu.

Optogenetická stimulácia. Laserová stimulácia bola dodávaná cez optický kábel (priemer 200 μm) s použitím svetelného zdroja s laserovou diódou (Doric Lenses). Intenzita svetla bola kalibrovaná a korigovaná vlnová dĺžka pomocou Power Meter Bundle s PM100D Console a S130C Slim Photodiode Sensorlight (Thorlabs). Každá stimulačná stimulácia (vrátane 8 Hz) sa uskutočnila pomocou 5 ms štvorcových impulzov. Na aplikáciu stimulácie zakódovaného svetla sme použili mikrokontrolér Arduino na generovanie signálu oscilácie bieleho šumu priamo privádzaného do analógového vstupu ovládača laserovej diódy. Na vykonanie náhodne vybranej frekvenčnej stimulácie sme použili štandardný protokol 5 s ON, 5 s OFF, ale pre každú stimulačnú epochu sme použili mikrokontrolér Arduino a náhodne vybrali stimulačnú frekvenciu v pásme theta. Pri aplikácii optogenetickej stimulácie počas správania sa okolo spojenia medzi patchcordom a implantátom ferule myši umiestnil voľný kus teplom zmršťovacej hadičky, aby sa obmedzila emisia viditeľného svetla. Intenzity svetla sú vyjadrené ako nominálny výkon, meraný na špičke zostavy implantátu z optických vlákien a kábla (pred chirurgickým umiestnením) a korigovaný na príslušnú vlnovú dĺžku.

Behaviorálne testy

Sekvenčná tónová lineárna stopa. Myši boli naprogramované vo vode a mali prístup k vode len 2 hodiny denne od 18 do 20 hodín. Aby sme rozlúštili priestorové, časové a vzdialenostné kódy, postavili sme 134 cm dlhú lineárnu dráhu pomocou stredne šedých kociek Lego®, čo umožňuje jednoduché úpravy a implementácie bez použitia potreba natrvalo upraviť štruktúru bludiska. Pyroelektrické senzory boli umiestnené na každom konci lineárnej dráhy a boli pripojené k mikrokontroléru Arduino. Každá detekcia spustila nový tón v poradí, čo naznačuje priebeh doručenia odmeny. Nasledujúce tóny boli použité a dodávané pomocou apiezo reproduktora: 1 s pípnutie pri 2000 Hz, 250 ms pípnutí pri 3000 Hz a súvislý tón pri 4000 Hz. Keď sa spustil posledný kontinuálny tón, odmena (10 % sacharóza vo vode) bola dodaná na začiatočný koniec lineárnej dráhy v uzávere 15 ml skúmavky Falcon. Zmeny smeru pred spustením ďalšieho tónu sa považovali za chyby a nespustili dodanie odmeny. Výkon sa meral ako počet správnych pokusov (bez chyby) vydelený počtom všetkých pokusov.

Rozpoznanie miesta nového objektu. Prvý deň sa myšiam umožnilo voľne skúmať 45 × 45 cm tmavosivé otvorené pole, ktoré obsahovalo vizuálne prvky (veľké biele horizontálne a vertikálne mriežky) na svojich stenách počas 10 minút. Na druhý deň boli na 10 minút prezentované dva rovnaké predmety (základňa pomocnej ruky). Tretí deň sa myšiam umožnilo preskúmať rovnaké otvorené pole, zatiaľ čo umiestnenie jedného z dvoch objektov bolo premiestnené. Na kontrolu potenciálnych priestorových preferencií bola počiatočná, ako aj posunutá poloha objektov randomizovaná. Myši si pripísali náhodné poradie testovania, ktoré bolo počas troch dní testovania rovnaké. Správanie bolo zaznamenané videokamerou (Logitech) a analyzované offline. Behaviorálna analýza sa uskutočňovala naslepo vzhľadom na genotyp a liečbu. Skúmanie objektov sa definovalo ako epochy, keď myši mali nos do 1 cm od objektu. RI bol vypočítaný nasledovne:

Automatizované oneskorené nesúlad so vzorovou úlohou. Myši boli naprogramované vo vode a trénované v kontinuálnom T-bludisku na oneskorenú úlohu nesúvisiacu so vzorkou. V stručnosti, každý pokus bol rozdelený do dvoch fáz: vzorka a test. Vo vzorkovej fáze bolo jedno rameno zablokované a myši boli nútené preskúmať opačné rameno, kde dostali odmenu 50 ul 10% sacharózovej vody. Po dokončení fázy vzorky boli myši vystavené oneskoreniu (10 s) v počiatočnom oddelení. Potom počas testovacej fázy bolo možné preskúmať obe ramená, ale iba opačné (nepreskúmané) rameno bolo nastražené, takže myši museli striedať miesta medzi vzorkou a testovacou fázou. Myši sa podrobili 10 pokusom (vzorka + test) denne počas 10 po sebe nasledujúcich dní a denná úspešnosť sa vypočítala ako počet správnych pokusov vydelený celkovým počtom pokusov.

Post-mortem histologické analýzy

Po dokončení behaviorálneho testovania boli myši hlboko anestetizované zmesou ketamín/xylazín/acepromazín (100, 16, 3 mg/kg, v danom poradí, intraperitoneálna injekcia) a transkardiálne perfundované 4 % paraformaldehydom (PFA) v PBS. Mozgy boli extrahované a postfixované cez noc v PFA pri 4 stupňoch a následne premyté v PBS ďalších 24 hodín pri 4 stupňoch. Mozgy a rezy boli až do použitia chránené kryoprotekciou v roztoku 30 % etylénglykolu, 30 % glycerolu a 40 % PBS. Každý mozog bol potom narezaný na 50 µm pomocou vibratómu: každá sekcia bola postupne odoberaná do 4 rôznych 1,5 ml skúmaviek, aby sa umožnili rôzne analýzy. (umiestnenie elektródy, imunohistochémia).

Imunohistológia. S použitím jednej skúmavky zozbieraných rezov mozgu (25% odber vzoriek) pre každú analýzu sa rezy premývali 3 x 5 minút v PBS, aby sa odstránil kryoprotektívny roztok. Rezy sa inkubovali cez noc s PGT (0,45 % želatína a 0,25 % Triton v PBS) pri 4 stupňoch. Potom sa rezy inkubovali s primárnymi protilátkami: buď 1:200 kozí anti-cholín-acetyl -transferáza z Millipore alebo 1:500 myšací anti-PVmonoklonálny IgG1 od Sigma-Aldrich v PGT pri izbovej teplote počas 48 hodín, respektíve 2 hodín. Po premytí 10, 20 a 30 minút boli rezy potom inkubované so sekundárnymi protilátkami [1:2000 oslí anti-koza spojený s Alexa 488 alebo 1:500 kozí anti-myší IgG1 spojený s Alexa 488 (Life Technologies)] v PGT pre 45 min. Po 10, 20 a 30 minútach premytia v PBS sa rezy potom namontovali na podložné sklíčka a trvalo prekryli montážnym médiom Fluoromount, ktoré obsahovalo DAPI. Do tejto štúdie boli zahrnuté iba myši s histologicky potvrdeným umiestnením implantátov. Pri GRINlenses musel byť povrch šošovky<100 µm above stratum pyramidale, and GCaMP6f expression was validated using fluorescence microscopy. Electrophysiological implants had to include at least one microelectrode in CA1 stratum radiatum or stratum pyramidale. Finally, the tips of fiber optics had to be within 100 µm of the MS region, and proper construct expression was assessed using fluorescence microscopy.

Analýza dát

Except for analyses of SWRs and the explicit impact of locomotion on physiological recordings, electrophysiological and calcium imaging analyses were performed only on periods of locomotion (>2 cm s−1 in the open field; >5 cm s−1 na lineárnej dráhe).

Automatizované sledovanie správania. Na získanie informácií o polohe, rýchlosti a smere hlavy myší sme použili DeepLabCut70,71. Stručne sme vycvičili model na detekciu uší, nosa, tela a chvosta myší. Smer hlavy bol odhadnutý pomocou uhla medzi každým uchom alebo nosom a telom v závislosti od dostupnosti merania. Údaje o polohe boli interpolované do frekvencie odberu vzoriek vápnika pomocou lineárnej interpolácie. Rýchlosť sa extrahovala výpočtom Δd/Δt, kde d je vzdialenosť a čas t, a následne sa vyhladil výsledok použitím Gaussovho filtra s sigma=33 ms na odstránenie artefaktov detekcie. Rýchlostné signály sa použili na identifikáciu období lokomotorickej aktivity a na výpočet modulácie aktivity miesta, času a vzdialenosti špecificky pre tieto obdobia.

Zobrazovacia analýza vápnika. Analýza údajov zobrazovania vápnika sa uskutočnila pomocou programov MATLAB 2020a a Python 3.8.4. Videozáznamy boli analyzované pomocou potrubia Miniscope Analysis (https://github.com/etterguillaume/MiniscopeAnalysis). Stručne povedané, korekcia pohybu (rotácia a translácia) sa použila pomocou NoRMCorre72 a videá sa pred zreťazením priestorovo prevzorkovali (3x). Stopy vápnika boli extrahované pomocou CNMFe51 s použitím nasledujúcich parametrov: gSig=3 pixelov (šírka Gaussovho jadra), gSiz=20 pixelov (približný priemer neurónu), pozadie_model='ring', priestorový_algoritmus='hals', min_corr=0.8 (minimálny prah korelácie pixelov), min_PNR {{17 }} (minimálny prah pomeru špičky k šumu).

Stopy surového vápnika boli filtrované, aby sa odstránili vysokofrekvenčné fluktuácie a binarizované: Stručne povedané, neuróny sa považovali za aktívne, keď amplitúda signálu normalizovaného vápnika prekročila dve štandardné odchýlky a derivát prvého rádu bol nad 0 (ďalšie podrobnosti nájdete v odkaze 52 o metodike52). Aby sa extrahovali neuróny ladiace na špecifické premenné, boli zoskupené umiestnenie, čas a vzdialenosť (umiestnenie: 3 cm zásobníky; čas: 1 s zásobníky; vzdialenosť: 3 cm zásobníky). Z binarizovaných signálov sme vypočítali marginálnu pravdepodobnosť, že bunky budú aktívne P Að Þ, ktoré používame ako proxy pre neuronálnu aktivitu. Ešte dôležitejšie je, že potom odvodíme pravdepodobnosť aktivity alebo „pravdepodobnosť, že budeme aktívni vzhľadom na stav premennej“ PA j Si pomocou združených premenných:

kde M je celkový počet možných stavov správania a P(Si∩Aj) je spoločná pravdepodobnosť, že zviera bude v zásobníku I súčasne s úrovňou aktivity j (0 alebo 1). Na posúdenie významnosti získanej hodnoty MI sme potom vygenerovali 1 000 zamiešaných náhrad pomocou náhodných kruhových permutácií. Kruhové permutácie sme zvolili, pretože odstraňujú časový vzťah medzi neuronálnou aktivitou a správaním, pričom stále zachovávajú časovú štruktúru kalciových prechodov, a teda vedú ku konzervatívnejším výsledkom (na rozdiel od úplnej randomizácie každého dátového bodu, ktorá zvyšuje hodnotu významnosti výsledkov). Pretože premiešané náhrady neboli systematicky normálne rozdelené, použili sme neparametrický prístup, kde p-hodnota (pN) zodpovedá počtu údajových bodov z premiešaného rozdelenia, ktorý je väčší ako skutočné údaje pre každú skupinu, vydelený počtom permutácií52, 73.

Na určenie modulácie buniek optogenetickými stimuláciami sme použili podobný prístup, ale vypočítali sme MI medzi neuronálnou aktivitou a binarizovanými stimulačnými signálmi (teda zaobchádzané ako so stavom správania). Rovnaký postup kruhového miešania sa potom použil na extrakciu štatistickej významnosti.

where P(S|A) is the posterior probability distribution of states given neuronal activity. Using only epochs with velocity >5 cm s-1, súbor tréningových údajov sa vygeneroval s použitím 90 % údajov. Zvyšných 10 % údajov sa použilo na testovanie. Chyba dekódovania sa vypočítala s použitím 50 spustených náhrad a skupiny 160 buniek s použitím náhodne vybraných údajových bodov s náhradou. Predpokladá sa, že každý neurón je od seba nezávislý, čo v praxi nie je tento prípad a vedie to k väčším chybám pri rekonštrukcii, ale skracuje sa výpočtový čas. Populačná posteriorná pravdepodobnosť bola odvodená z nasledujúcej rovnice:

Sledovanie buniek počas niekoľkých dní. Neuróny boli sledované počas niekoľkých dní pomocou CellReg74: https://github.com/zivlab/CellReg (v1.5.3). Stručne povedané, priestorové stopy boli zarovnané pomocou pevného zarovnania, aby sa opravili rotácie a posuny. Po zarovnaní sme považovali kandidátne sady buniek za rovnaký neurón, ak bola ich maximálna vzdialenosť<12 µm, and used the modeled spatial correlation threshold (usually in the range 0.6–0.8) to determine the identity of cell pairs across days. Finally, we assessed the stability of the spatial representation using pairwise field correlation (Pearson correlation of tuning curves).

Elektrofyziologická analýza. Elektrofyziologická analýza údajov bola vykonaná pomocou MATLAB 2020a s použitím spracovania signálu ako aj waveletového toolboxu. Waveletová konvolúcia bola aplikovaná na LFPsignals pomocou komplexných Morletových vĺn ('cmor1–1.5' v MATLAB), keď bola potrebná presnosť v časovej aj frekvenčnej oblasti. Pohyblivé okno Fourierova konvolúcia (okno 2 s v pásme theta, okno 5 s v pásme gama, 10 ms pohyblivé kroky) sa použila, keď bola presnosť frekvenčnej domény uprednostnená pred presnosťou v časovej oblasti (napr. top vynesenie dominantnej frekvencie pri stimulácii pomocou optogenetiky). Analýza výkonových spektrálnych hustôt sa uskutočnila, keď myši bežali rýchlosťou 5 cm s-1 alebo vyššou, pokiaľ nie je uvedené inak.

Oscilačná sila. OS bol vypočítaný ako pomer kumulatívnej výkonovej spektrálnej hustoty okolo maximálnej oscilačnej frekvencie ±1 Hz ku kumulatívnemu výkonu pásma v pásme theta (4–12 Hz). Táto metrika sa stane 1, keď všetka výkonová spektrálna hustota spadá do špičkovej oscilačnej frekvencie (napr. 8 Hz pri stimulácii na tejto frekvencii).

Detekcia a analýza SWR. Na monitorovanie SWR bolo myšiam počas nahrávania umožnené voľne skúmať otvorené pole po dobu 10 minúty. Stimulácie (zakódované alebo 8 Hz) sa uskutočňovali s paradigmou 5 s ON, 5 s OFF. Na analýzu sa brali do úvahy iba obdobia pokojného pokoja. Na tento účel sme vypočítali z-skóre pomer výkonu theta/delta po filtrovaní pre každé frekvenčné pásmo, vykonaní Hilbertovej transformácie a zvažovali sme len obdobia, kedy bola výsledná hodnota pod 0. Na detekciu SWR sme filtrovali signály LFP v 150–250 Hz frekvenčné pásmo a následne z-skóre. Zvlnenie bolo detekované pomocou funkcie findpeaks v MATLAB, s nasledujúcimi parametrami: prahová hodnota=4 sd, minpeakwidth=0 s, minpeakdistance=0,03 s.

Referencie

1. Colgin, LL Rytmy siete hipokampu. Nat. Neurosci. 17, 239 – 249 (2016).

2. Tóth, K., Freund, TF & Miles, R. Disinhibition of rat hippocampalpyramidal cells by GABAergic afferents from septum. J. Physiol. 500, 463-474 (1997).

3. Unal, G., Joshi, A., Viney, TJ, Kis, V. & Somogyi, P. Synaptické ciele mediálnych septálnych projekcií v hipokampe a extrahippokampálnych kôrach myši. J. Neurosci. 35,15812–15826 (2015).

4. Simon, AP, Poindessous-Jazat, F., Dutar, P., Epelbaum, J. & Bassant, M.-H. Spúšťacie vlastnosti anatomicky identifikovaných neurónov v mediálnom septu znecitlivených a neanestetizovaných potkanov. J. Neurosci. 26, 9038-9046 (2006).

5. Scotty, F. a kol. Výrazné elektrofyziologické vlastnosti glutamátergických, cholinergných a GABAergických neurónov septohippokampálnych potkanov: nové dôsledky pre rytmus hipokampu. J. Physiol. 551,927-943 (2003).

6. Manseau, F., Danik, M. & Williams, S. Funkčná sieť glutamátergických neurónov v oblasti mediálneho septa a diagonálneho pásu. J. Physiol. 566, 865-884 (2005).

7. Amilhon, B. a kol. Parvalbumínové interneuróny hippocampu ladia populačnú aktivitu pri frekvencii theta. Neurón 86, 1277 – 1289 (2015).

8. Etter, G. a kol. Optogenetická gama stimulácia zachraňuje poruchy pamäti v myšom modeli Alzheimerovej choroby. Nat. komun. 10, 1 – 11 (2019).

9. Zutshi, I. a kol. Hippokampálne nervové obvody reagujú na optogenetickú stimuláciu theta frekvencií generovaním zrýchlených oscilačných frekvencií. Curr. Biol. 28, 1179–1188.e3 (2018).

10. Bender, F. a kol. Oscilácie théta regulujú rýchlosť lokomócie cez dráhu hippocampu do laterálnej priehradky. Nat. komun. 6,8521 (2015).

For more information:1950477648nn@gmail.com