Parazity, infekcie a očkovanie v syntetických minimálnych bunkách

ABSTRAKT: Syntetické minimálne bunky poskytujú kontrolovateľný a inžiniersky upraviteľný model biologických procesov. Aj keď sú syntetické bunky oveľa jednoduchšie ako akákoľvek živá prirodzená bunka, ponúkajú podvozok na skúmanie chemických základov kľúčových biologických procesov. Tu ukazujeme syntetický bunkový systém s hostiteľskými bunkami, ktorý interaguje s parazitmi a prechádza infekciami rôznej závažnosti. Ukazujeme, ako môže byť hostiteľ upravený tak, aby odolal infekcii, skúmame metabolické náklady na prenášanie rezistencie a ukazujeme očkovanie, ktoré imunizuje hostiteľa proti patogénom. Naša práca rozširuje súbor nástrojov syntetického bunkového inžinierstva demonštrovaním interakcií hostiteľ-patogén a mechanizmov na získanie imunity. To prináša syntetické bunkové systémy o krok bližšie k poskytovaniu komplexného modelu komplexného prirodzeného života.

cistanche výhody pre mužov - posilnenie imunitného systému

ÚVOD

Za posledných niekoľko desaťročí oblasť syntetickej biológie explodovala, čo umožnilo konštrukciu syntetických buniek, ktoré sa podobajú a modelujú aspekty prirodzeného biologického života. Modelovanie bunkových dráh a správania v syntetických bunkách ponúka mnoho výhod oproti živým bunkám, ako je zjednodušené a definované reakčné prostredie, úplná kontrola nad proteomickým a chemickým zložením bunky, schopnosť kompartmentalizovať interferujúce biologické dráhy a procesy, ako aj zachovanie dôležité biologické systémy, ktoré chýbajú v reakčných systémoch in vitro.1,2 Tieto jedinečné výhody technológií syntetických buniek už umožnili simuláciu biologických podmienok a dráh v bioreaktore in vitro (syntetická bunka) podobného živému a priniesli lepšie pochopenie mnohé oblasti štúdia, vrátane molekulárneho zhlukovania,3 dynamiky lipidov a proteínov,4 minimálneho metabolizmu5 a mnohých ďalších kritických aspektov biologického života.2 Tieto životu podobné syntetické bunky so svojimi jedinečnými vlastnosťami sa rýchlo stávajú lepšími modelmi a vrhajú viac svetla do tajomné vnútorné fungovanie bunkového života.6,7 Tieto objavy sa neobmedzujú len na jednobunkové procesy; inžinierske interakcie medzi populáciami lipozómov sa tiež ukázali ako výkonná technológia. Napríklad návrh syntetického bunkového systému, ktorý napodobňuje vzťah predátor – korisť, bol vyvinutý s využitím svetla ako signálu medzi týmito syntetickými bunkovými populáciami.8 Bola vyvinutá ďalšia komplexná práca, ktorá umožňuje šírenie signálu v matrici kvapôčok syntetickej bunky. umožňujúce šírenie fluorescencie priestorovým spôsobom medzi populáciou.9 Okrem syntetických interakcií bunka-syntetická bunka došlo v poslednom čase k pokroku aj v oblasti syntetických rozhraní bunka-živá bunka. Napríklad sa ukázalo, že syntetická bunka navrhnutá na prepojenie s neurálnou kmeňovou bunkou je schopná vyvolať neurálnu diferenciáciu, ako aj pôsobiť ako zovšeobecnená kostra schopná prepojiť sa s inými typmi buniek.10 Vo vývoji došlo k nespočetným pokrokom. šírenia signálu a syntetických buniek pôsobiacich ako rozhrania, z ktorých mnohé sú preskúmané v nasledujúcich prehľadoch.11−13 Stručne povedané, existujú celé oblasti výskumu, ktoré sa zaoberajú napodobňovaním interakcií bunkových populácií v modelovom systéme syntetických buniek. Napriek tomu neexistuje štúdia, ktorá by využívala syntetické bunky na modelovanie infekcie, parazitizmu alebo očkovania. Tak ako sa syntetické bunky bežne používajú na modelovanie zložitých biologických procesov zjednodušeným a kontrolovaným spôsobom, existuje potenciál na modelovanie týchto zložitých medziorganizmových interakcií. Dôležitosť tohto možno vidieť v prelomovej štúdii, ktorá úspešne produkovala aktívne fágové častice v rámci bezbunkovej proteínovej expresnej platformy.14 Naším cieľom je priniesť tento koncept na makroúroveň navrhnutím syntetických bunkových populácií, ktoré sa môžu navzájom aktívne infikovať a uniesť. genóm hostiteľskej bunky, rovnako ako živé vírusy a parazity. Schopnosť aplikovať a skonštruovať syntetické bunky na modelovanie tohto správania chorôb poskytne vedeckej komunite cenný nástroj.

V tejto práci prezentujeme náš systém na modelovanie syntetických bunkových chorôb. Skonštruovali sme hostiteľskú bunku, ktorá by mohla podstúpiť infekciu z druhej populácie parazitických syntetických buniek, a skúmali sme konkurenciu zdrojov, únos genómu a metabolickú zmenu účelu, ku ktorej dochádza počas takejto infekcie. Modelujeme tiež metódu, ktorá umožňuje záchranu hostiteľa po infekcii, ako aj prostriedky očkovania, ktoré umožnia hostiteľovi odolávať infekcii syntetických buniek spôsobujúcich ochorenie. Stručne povedané, predstavujeme nový model ochorenia a infekcie pre syntetické bunky. Pomocou tejto technológie sa môžu syntetické bunky začať používať ako základné modely choroby, infekcie a očkovania (obrázok 1).

Obrázok 1. Parazit, infekcia a inokulačný systém v syntetických minimálnych bunkách. (a) "Hostiteľ" je syntetická bunka exprimujúca zelený fluorescenčný proteín (GFP). Na povrchu vonkajšej membrány nesie hostiteľ ssDNA značky. Jedinými proteínmi preloženými do zdravého hostiteľa sú hostiteľove vlastné proteíny z plazmidov, s ktorými bol hostiteľ vytvorený. (b) "Parazit" je lipozóm naplnený plazmidovou DNA kódujúcou gén pre fluorescenčný proteín mCherry a povrch parazitného lipozómu je ozdobený ssDNA tagom (komplementárnym k tagu na povrchu hostiteľa). "Infekcia" začína fúziou hostiteľských a parazitných lipozómov, sprostredkovaných komplementárnymi DNA tagmi na ich povrchu. Po infekcii hostiteľ exprimuje pôvodný gén hostiteľa (GFP) aj gén parazita (mCherry). (c) „Infekcia“ začína „patogénnymi“ lipozómami nesúcimi gén pre reštrikčný enzým Munl fúzovaný s hostiteľskými lipozómami. Gén patogénu Munl je exprimovaný hostiteľom a reštrikčný enzým MunI štiepi hostiteľskú DNA. To má za následok štiepenie natívneho hostiteľského genómu, čím sa väčšina expresie hostiteľského proteínu zmení z GFP na proteín kódovaný patogénom, MunI. (d) "Smrteľná infekcia" je fúzia hostiteľského lipozómu (s GFP genómom) s patogénnym lipozómom obsahujúcim gén kódujúci aHL, membránový proteín. Po infekcii hostiteľ exprimuje aHL, ktorá vytvára membránové póry, čo spôsobuje únik živín hostiteľa a efektívne zastavuje metabolizmus hostiteľa. (e) "Imunizácia" je inkubácia hostiteľa s ssDNA obsahujúcou sekvenciu kompatibilnú s fúznymi značkami na povrchu hostiteľských lipozómov. Imunizujúca DNA vytvára duplex s hostiteľskými DNA tagmi, čím bráni hybridizácii iných DNA oligo na tieto tagy. To zabraňuje fúzii akýchkoľvek patogénnych lipozómov s hostiteľom. Toto je obrázok dôkazu koncepcie a grafy slúžia na ilustračné účely a predstavujú relatívne množstvá proteínu exprimovaného hostiteľom a rôznymi patogénmi. Reálne údaje pre každý systém sú uvedené na nasledujúcich obrázkoch.

VÝSLEDKY A DISKUSIA

V tejto práci používame slová: hostiteľ, parazit, infekcia, smrtiaci, vakcína a očkovanie, to všetko v kontexte neživých, syntetických bunkových systémov. „Smrteľnou“ infekciou rozumieme výrazné zníženie translácie v populácii syntetických buniek. Všetky experimenty v tejto práci boli vykonané na syntetických bunkách, ktoré nie sú živé, nereplikujú sa a nevyvíjajú sa. Toto je modelový systém pre prirodzené biologické vlastnosti a procesy.

výhody doplnku cistanche-zvýšenie imunity

Kliknite sem pre zobrazenie produktov Cistanche Enhance Immunity

【Požiadať o viac】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Infekcia syntetickej bunky parazitickou syntetickou bunkou unesie hostiteľské zdroje.

Aby sme otestovali koncept syntetického bunkového systému napodobňujúceho infekciu, začali sme skonštruovaním modelového systému pre parazita. Použili sme najjednoduchší koncept parazita, ktorý je možné rekonštituovať v tomto neživom biochemickom systéme: parazit, ktorý unesie niektoré zdroje hostiteľa. V tomto prípade je metabolizmus hostiteľa reprezentovaný expresiou GFP proteínu a parazit je reprezentovaný expresiou proteínu mCherry. Pre tento systém sme využili predtým demonštrovaný fenomén lineárneho výťažku proteínovej expresie v závislosti od koncentrácie templátu DNA v TxTl.15,16 Najprv sme sa rozhodli nájsť optimálnu celkovú koncentráciu plazmidu, pri ktorej pomer GFP a mCherry DNA zodpovedá pomer pozorovanej fluorescencie z týchto proteínov. Ako „hostiteľ“ sme svojvoľne priradili gén GFP a ako „parazit“ gén mCherry. Tieto názvy neznamenajú nič zvláštne v tomto konkrétnom experimente, ale budú označovať hostiteľa a parazita v nasledujúcich experimentoch so syntetickými bunkami. Tu používame tieto názvy, aby sme uľahčili spojenie týchto experimentov s dôkazom konceptu s následnými experimentmi s infekciou syntetických buniek s použitím rovnakých plazmidov. Zmiešali sme plazmidy GFP a mCherry s oboma génmi pod kontrolou promótora T7 pri rôznych pomeroch plazmidov a celkovej koncentrácii plazmidov vo vzorkách 1, 5, 10 alebo 15 nM (obrázok 2b). Výsledky sledovali očakávaný takmer lineárny vzťah medzi koncentráciou plazmidu a zaznamenanou intenzitou fluorescencie, pričom najlepšia zhoda medzi pomermi fluorescencie a koncentrácie plazmidu bola pozorovaná pri celkovom koncentrácii plazmidu 10 nM. Pozorovaný vzťah naznačuje, že plazmidy, pričom proteíny majú podobnú veľkosť a zloženie aminokyselín (obrázok S1), súťažia o rovnaký súbor zdrojov TxTl o svoju expresiu. Zmena relatívnej koncentrácie dvoch plazmidov má za následok zmeny v účinnosti expresie zhruba úmerné pomeru plazmidov. To naznačuje, že by to bol dobrý model na napodobenie infekcie parazitmi: genóm parazita (plazmid mCherry) bude súťažiť s genómom hostiteľa (plazmid GFP). Ďalej sme sa rozhodli otestovať prípad, keď bol ktorýkoľvek z plazmidov pod kontrolou silnejšieho promótora, čím sme napodobňovali scenár skreslenej alokácie zdrojov. Aby sme zachovali aspekt konkurencie zdrojov v budúcich experimentoch s infekciou „parazitmi“, ponechali sme oba gény pod rovnakým promótorom RNA polymerázy (polymeráza T7 RNA, T7 RNAP), ale zmenili sme jeho silu. Použili sme silný T7 RNAP promótor T7Max, ktorý demonštruje výrazne vyšší výťažok transkripcie, čo vedie k zodpovedajúcim vyšším výťažkom translácie, v TxTl.17 Testovali sme reakčné nastavenie identické s tým, ktoré bolo opísané vyššie: dva plazmidy v rôznych pomeroch, testované s rôznym konečným celkovým koncentrácie plazmidov. Jeden z plazmidov bol pod kontrolou silného promótora T7Max, zatiaľ čo druhý bol pod kanonickým promótorom T7. V oboch testovacích prípadoch bola expresia plazmidu T7Max dostatočne silná na to, aby sa fluorescencia proteínu z génu pod T7Max významne nezvýšila so zvýšenou celkovou koncentráciou plazmidu (obrázok 2c, 2d). Nezdalo sa, že by záležalo na tom, či T7Max poháňal GFP alebo mCherry, oba proteíny reagovali na silnejší promótor s podobným relatívnym zvýšením. To poskytlo sľubný model infekcie „silnejším“ parazitom (parazit nesúci gén pod T7Max do hostiteľa pod T7) a reverzný, silnejší hostiteľ odolávajúci slabším parazitom (hostiteľ s genómom pod T7Max a parazit nesúci gén T7). Povzbudení týmito experimentmi na preukázanie princípu sme prešli k experimentom so syntetickými bunkami.

"Infekcia" je vo všetkých prípadoch fúzia hostiteľa a syntetickej bunky parazita. Fúzia je uľahčená DNA tagmi na povrchu lipozómov s použitím DNA-indukovateľného fúzneho systému opísaného vyššie.18 Stručne povedané, syntetické bunky boli vytvorené s Escherichia coli TxTl vo vnútri membrány POPC a cholesterolu a vonkajší leták bol ozdobený s jednovláknovou DNA ukotvenou k membráne modifikáciou cholesterolu. Ak sa pár lipozómov s komplementárnymi značkami stretne, značky DNA hybridizujú, čím sa membrány spoja a iniciuje sa fúzia membrán, po ktorej nasleduje zmiešanie lúmenu. V našich experimentoch je hostiteľskou syntetickou bunkou okrem genómu GFP kódovaného plazmidom lipozóm obsahujúci TxTl s T7 RNAP. Monitorovanie fluorescencie GFP slúži ako proxy pre „zdravie“ metabolizmu hostiteľa. Prichádzajúci parazit obsahuje genóm vo forme plazmidu kódujúceho mCherry, kompletný translačný systém, ale žiadnu T7 RNA polymerázu. To zaisťuje, že akékoľvek pozorované zmeny v metabolizme hostiteľa vyplývajú z génov vnesených parazitom a nie z fúzie parazita a hostiteľských lipozómov, ktorá zriedi hostiteľskú cytoplazmu. Experimenty s infekciou parazitmi sa uskutočňovali s hostiteľskou membránou označenou Marina Blue DHPE, modrým membránovým lipidovým farbivom. To nám umožnilo normalizovať fluorescenciu génu hostiteľa a parazita na modrú fluorescenciu, normalizovať výsledky na celkové množstvo fluorescencie hostiteľskej membrány prítomnej vo vzorke. To zodpovedá zriedeniu celkového objemu vzorky po pridaní parazitických lipozómov. Membrány parazitov neboli fluorescenčne označené. Všetky experimenty boli sprevádzané kontrolnou vzorkou, kde bola prítomná iba jedna populácia ako hostiteľ, ale s plazmidom mCherry, aby sa ukázali teoretické maximálne možné hladiny expresie mCherry, ak by to bol jediný gén v populácii. V prvej sade experimentov sme zmiešali hostiteľa a parazita s génmi pod kontrolou bežného promótora T7takže gény hostiteľa aj parazita boli rovnako „silné“. Zmiešali sme hostiteľa s parazitom tak, že parazit bol na 25, 50 alebo 75 % celkovej populácie lipozómov. Vo všetkých prípadoch sa fluorescencia GFP hostiteľa znížila v prítomnosti parazita so zodpovedajúcim zvýšením fluorescencie parazita mCherry (obrázok 2e). Vzorky iba s parazitom a bez hostiteľa nevyvolali žiadnu fluorescenciu žiadnej farby, ako sa očakávalo. Vo všetkých prípadoch nie je fúzia lipozómov sprostredkovaná DNA 100% účinná;18,19 Preto relatívny pokles fluorescencie hostiteľa a zvýšenie fluorescencie parazita neboli také veľké ako očakávaná teoretická hodnota založená na pomere hostiteľa k parazitovi. Inými slovami, infekcia nebola 100% účinná. Táto náhodná kvalita DNA-indukovaného fúzneho systému bola v tomto prípade prospešnou vlastnosťou systému. Rovnako ako v prípade prirodzenej infekcie, infekcia sprostredkovaná syntetickou bunkovou fúziou neovplyvnila všetkých hostiteľov a nie všetky parazity našli hostiteľa. Ďalej sme skúmali dva prípady, keď hostiteľ a parazit neboli rovnomerne zhodní v sile ich genómov. V jednom prípade bol hostiteľský genóm pod kontrolou promótora T7, zatiaľ čo genóm parazita bol pod promótorom T7Max (obrázok 2f), a v opačnom prípade bol genóm hostiteľa pod T7Max a genóm parazita bol pod promótorom T7. (Obrázok 2g). V prípade slabšieho hostiteľa napadnutého silnejším parazitom bol relatívny nárast parazitickej fluorescencie mCherry a zodpovedajúci pokles fluorescencie GFP hostiteľa oveľa silnejší ako v predchádzajúcom prípade rovnomerne spárovaného hostiteľa a parazita. Ako sa očakávalo, keď bol hostiteľ silnejší ako parazit, opak bol pravdou: hladiny fluorescencie mCherry boli nižšie a relatívny pokles fluorescencie GFP bol nižší ako v rovnomerne zhodnom prípade. Najlepšie to ilustruje porovnanie jedného údajového bodu za rovnakých podmienok infekcie: pri 75% pomere parazitov. Rovnomerne zhodné populácie hostiteľa a parazita vedú k fluorescencii parazita o niečo väčšej ako hostiteľ. Keď je parazit silnejší, fluorescencia parazita je výrazne vyššia ako u hostiteľa. A keď je hostiteľ silnejší, fluorescencia parazita je o niečo nižšia ako u hostiteľa. Tieto zvýraznené dátové body sú označené žltou hviezdou na obrázku 2e−g. Uskutočnili sme kontrolný experiment hostiteľa infikovaného "asymptomatickým" parazitom, parazitom nesúcim plazmid s promótorom T7, ale bez sekvencie kódujúcej proteín (z plazmidu sme odstránili kazetu mCherry) (obrázok 2h). Fluorescencia GFP hostiteľa sa pri vyšších hladinách parazitov znižuje minimálne, čo naznačuje, že určité malé množstvo zdrojov hostiteľa sa venuje prepisu krátkej nekódujúcej RNA z plazmidu parazita. Tieto údaje tiež potvrdzujú, že hlavná metabolická záťaž parazitickej infekcie na hostiteľovi spočíva vo využívaní translačných, nie transkripčných zdrojov. Toto pozorovanie je v súlade s predchádzajúcimi pozorovaniami, že translácia je variabilnejším a obmedzujúcim zdrojom v bezbunkových systémoch.20 Celkovo tieto experimenty poskytujú model infekcie parazitom, ktorý unáša metabolické zdroje hostiteľa, pričom správanie syntetických buniek napodobňuje aspekty prirodzeného vzťahu hostiteľ-parazit.

Obrázok 2. Infekcia parazitmi unesie zdroje hostiteľa. (a) Hostiteľský syntetický bunkový lipozóm obsahuje bezbunkový translačný systém a plazmid kódujúci GFP. Povrch hostiteľa je ozdobený ssDNA tagmi. Parazitický lipozóm obsahuje plazmid kódujúci mCherry s translačným systémom, ale bez RNA polymerázy (takže parazit nemôže exprimovať mCherry). Povrch parazita je ozdobený značkami ssDNA komplementárnymi k značkám na povrchu hostiteľa. Značky DNA uľahčujú fúziu hostiteľských a parazitných lipozómov a hostiteľ exprimuje svoj vlastný genómový GFP aj parazitický genóm obsahujúci mCherry. (b-d) Dôkaz princípu pre genómy hostiteľa (GFP) a parazita (mCherry), ktoré súťažia o rovnaké zdroje syntetických buniek. Tieto experimenty sa robia v roztoku TxTl, nie v lipozómoch. Dva plazmidy, kódujúce GFP a mCherry, sa zmiešali v pomere označenom ikonami plazmidov na ľavej strane tepelnej mapy, pričom celková koncentrácia DNA vo vzorke je uvedená v riadku nad tepelnou mapou. Fluorescencia sa merala v zelených (GFP) a červených (mCherry) kanáloch. Každý plazmid bol testovaný v dvoch variantoch s promótormi rôznej sily: s T7 a so silnejším T7Max promótorom. Jednotlivé údaje pre všetky tepelné mapy sú uvedené na obrázkoch S2−S4. Reprezentatívne jednotlivé časové priebehy pre proteínovú expresiu hostiteľa a parazita T7 sú uvedené na obrázkoch S5-S7 a pre parazita T7Max na obrázkoch S8-S10. (e−g) Infekcia hostiteľa parazitom. V každom experimente sa hostiteľské lipozómy zmiešajú s lipozómami parazita. Fúzia parazita k hostiteľovi prináša parazitickú mCherry DNA, ktorá je exprimovaná popri hostiteľskej GFP DNA. Testovali sa rôzne pomery hostiteľa k parazitovi, ako ukazujú ikony pod stĺpcovými grafmi. Hostiteľský genóm pod promótorom T7 bol infikovaný parazitom s jeho genómom pod panelom promótora T7 (e) a parazitom s jeho genómom pod panelom promótora T7Max (f), hostiteľ bol tiež vyrobený s genómom T7Max a infikovaný s parazitom s panelom genómu T7 (g). Reprezentatívne jednotlivé časové priebehy expresie proteínu sú uvedené na obrázku S11. Podobné experimenty pri vyšších a nižších koncentráciách celkových lipidov sú uvedené na obrázku S12. Stopy purifikácie s vylúčením veľkosti ukazujúce stabilitu vezikúl po fúzii sú uvedené na obrázku S13. (h) Infekcia nekompatibilným parazitom: parazit nesie promótor T7, ale nekódujúcu DNA. Chybové úsečky označujú SEM, n=3. Hodnoty fluorescencie v paneloch (e-h) sú normalizované na modrú fluorescenciu membránového farbiva, aby sa normalizovali výsledky na koncentráciu hostiteľských buniek. Všetky série vzoriek označené ako "hostiteľ GFP infikovaný" sú experimenty, kde hostiteľ a parazit mali na povrchu komplementárne značky DNA, čo umožňuje fúziu lipozómov, nazývanú infekcia. Sériovo označené "host GFP zdravé" ukazujú vzorky, kde boli hostiteľ a parazit zmiešané v uvedených pomeroch, ale neobsahovali komplementárne fúzne značky, čo znemožňovalo infekciu. Kosoštvorec v paneloch (e-h) označuje jeden konkrétny infekčný stav, ktorý najlepšie ilustruje rozdiely v silách expresie hostiteľa a parazita v paneloch (e-g) a výhody imunity hostiteľa v paneli (h). Priame porovnanie hodnôt hostiteľa a parazita označených hviezdou je uvedené na obrázku S14. Údaje o infekcii parazitom bez akéhokoľvek plazmidu sú uvedené na obrázku S15.

Infekcia syntetickej bunky môže zničiť hostiteľský genóm.

Parazit opísaný vyššie exprimoval genóm kódujúci mCherry pomocou zdrojov hostiteľa, ale hostiteľ si zachoval časť svojho metabolizmu a pokračoval v expresii GFP napriek infekcii. Ďalej sme sa rozhodli preskúmať systém, v ktorom infekcia vedie k úplnému prevzatiu metabolizmu hostiteľa parazitom prostredníctvom deštrukcie hostiteľského genómu (obrázok 3a). Aby sme vytvorili takýto scenár, skúmali sme štiepenie plazmidu reštrikčnými enzýmami v TxTl. V experimentoch na overenie princípu bol MunI reštrikčný enzým exprimovaný v TxTl bez lipozómov. MunI plazmid bol zmiešaný s GFP plazmidom v rôznych pomeroch. Ak plazmid GFP neobsahuje žiadne reštrikčné miesta MunI, relatívne malý pokles pozorovanej fluorescencie GFP možno vysvetliť skôr opísanou konkurenciou medzi dvoma plazmidmi o zdroje TxTl. Ak má plazmid GFP reštrikčné miesto MunI, fluorescencia GFP sa výrazne zníži a zníženie sa zväčší úmerne so zvyšujúcim sa množstvom plazmidu kódujúceho MunI (obrázok 3b). Expresia MunI sa monitorovala pomocou Western Blot a škálovala sa proporcionálne s koncentráciou plazmidu (obrázok 3c).

cistanche tubulosa - zlepšenie imunitného systému

Povzbudení týmito výsledkami sme zaviedli infekčný experiment so syntetickými bunkami. Hostiteľ niesol plazmid GFP a patogén niesol plazmid MunI. Koncentrácia plazmidov GFP a MunI bola nastavená na 2 mM, čo je výrazne pod koncentráciou saturácie plazmidov pre TxTl.21 Mali sme v úmysle zostať pod celkovou koncentráciou plazmidov, pri ktorej by expresia hostiteľa a parazita bola dostatočne vysoká na to, aby priamo súťažila o obmedzené zdroje ( ako vo vyššie opísanom prípade jednoduchého parazita), namiesto toho je zámerom väčšinou merať účinok enzýmu parazita, ktorý aktívne ničí genóm hostiteľa. Podobne ako v skôr opísaných experimentoch s parazitmi hostiteľ obsahoval bakteriálnu TxTl a T7 RNA polymerázu, patogén niesol iba bunkový extrakt bez T7 RNA polymerázy a hostiteľ aj patogén boli označené komplementárnymi DNA fúznymi značkami. Hostiteľská membrána bola označená Marina Blue DHPE, aby sa normalizovali výsledky fluorescencie na koncentráciu hostiteľských lipozómov. Hostiteľ a patogén boli zmiešaní v rôznych pomeroch, pričom patogén bol 25, 50 alebo 75 % z celkovej populácie. Fluorescencia "infikovaného" hostiteľa, kde hostiteľ a patogén obsahovali komplementárne fúzne značky, klesala so zvyšujúcim sa množstvom patogénu. Fluorescencia GFP zo "zdravého" hostiteľa, kde patogén neobsahoval komplementárne fúzne značky, sa neznížila v prítomnosti akéhokoľvek množstva patogénu. Vzorky obsahujúce iba patogén neviedli k žiadnej merateľnej fluorescencii (obrázok 3d). Expresia patogénneho proteínu MunI sa kvantifikovala pomocou analýzy Western Blot s údajmi uvedenými pre sériu vzoriek infikovaného hostiteľa (obrázok 3e). Ďalej sme skúmali infekciu v prípade hostiteľa imunitného voči patogénu: hostiteľský plazmid GFP nemal reštrikčné miesto MunI (obrázok 3f). Fluorescencia hostiteľa po infekcii klesla, ale nebola ani zďaleka taká významná ako v predchádzajúcom prípade hostiteľa s miestom MunI v genóme. Proteín patogénu MunI bol exprimovaný na úrovniach porovnateľných s predchádzajúcimi infekčnými experimentmi (obrázok 3g), takže metabolické zaťaženie hostiteľa bolo podobné. Pokles fluorescencie infikovaného hostiteľa v týchto experimentoch je spôsobený tým, že niektoré zdroje hostiteľa sú unesené patogénom exprimujúcim MunI, ale pretože celková koncentrácia plazmidov je oveľa nižšia ako v predchádzajúcich jednoduchých experimentoch s patogénmi, zníženie fluorescencie hostiteľa je menej významné. Tento experiment tiež potvrdzuje, že zníženie fluorescencie hostiteľa s miestom MunI (obrázok 3d) bolo spôsobené časovými priebehmi expresie proteínov uvedenými na obrázku S22. (g) Expresia MunI sa sledovala pomocou analýzy Western blot prostredníctvom experimentu pre vzorky uvedené v sérii "Infikované GFP" na paneli (f). Chybové pruhy na všetkých paneloch označujú SEM, n=3. Hodnoty fluorescencie v paneloch (d, f) sú normalizované na modrú fluorescenciu membránového farbiva použitého na normalizáciu výsledkov na koncentráciu hostiteľských buniek. Fluorescencia v paneli (b) je normalizovaná na 0 mM MunI plazmid pre každú sériu vzoriek. Kosoštvorcové symboly v paneloch (d, f) zvýrazňujú jeden konkrétny stav najlepšie ilustrujúci rozdiely v odpovediach na infekciu od hostiteľa vnímavého na panel patogénov (d) a imúnneho voči panelu patogénov (f). Všetky série vzoriek označené ako "infikované GFP" sú experimenty, kde hostiteľ a patogén mali na povrchu komplementárne značky DNA, čo umožnilo fúziu lipozómov, nazývanú infekcia. Séria označená ako "GFP zdravá" ukazuje vzorky, kde boli hostiteľ a patogén zmiešané v uvedených pomeroch, ale neobsahovali komplementárne fúzne značky, čo znemožňovalo infekciu.

Obrázok 3. Infekcia zničí hostiteľský genóm a unesie hostiteľské zdroje. (a) Hostiteľské bunky obsahujú plazmid kódujúci GFP s dvoma reštrikčnými miestami MunI; patogén obsahuje plazmid kódujúci reštrikčný enzým MunI. Po fúzii hostiteľa a patogénu hostiteľ TxTl exprimuje reštrikčný enzým MunI, ktorý potom štiepi hostiteľský genóm. (b) Dôkaz princípu experimentov pre infekciu: GFP plazmid bol pripravený s a bez MunI reštrikčných miest. Plazmid GFP sa zmiešal s plazmidom MunI a zaznamenala sa expresia GFP. Tieto experimenty sa uskutočnili v roztoku TxTl bez lipozómov. Dôkaz princípu infekčného experimentu s enzýmom MunI pridaným externe namiesto toho, aby bol exprimovaný v TxTl, je znázornený na obrázkoch S16 a S17. Reprezentatívne časové priebehy proteínovej expresie sú uvedené na obrázku S18. (c) expresia MunI bola monitorovaná analýzou Western blot; intenzita MunI pásu bola kvantifikovaná v rovnakých vzorkách ako výsledky fluorescencie uvedené na paneli (b) pre sériu "MunI miesto chýba". Reprezentatívny western blot reštrikčného enzýmu MunI je uvedený na obrázku S19. (d) GFP fluorescencia hostiteľa zmiešaná s lipozómami patogénu v pomere uvedenom pod grafom údajov. Hostiteľský GFP plazmid má dve Munl reštrikčné miesta. Reprezentatívne časové priebehy proteínovej expresie sú uvedené na obrázku S20. Údaje pre infekčné experimenty s nekompatibilnými fúznymi značkami sú uvedené na obrázku S21. (e) Expresia MunI sa sledovala prostredníctvom analýzy Western blot prostredníctvom experimentu pre vzorky uvedené v sérii "Infikované GFP" na paneli (d). (f) GFP fluorescencia hostiteľa zmiešaná s lipozómami patogénu v pomere uvedenom pod grafom údajov. Hostiteľský GFP nemá žiadne reštrikčné miesta MunI, čo mu dáva imunitu voči proteínu patogénu. Reprezentatívne časové priebehy proteínovej expresie sú uvedené na obrázku S22. (g) Expresia MunI sa sledovala pomocou analýzy Western blot prostredníctvom experimentu pre vzorky uvedené v sérii "Infikované GFP" na paneli (f). Chybové pruhy na všetkých paneloch označujú SEM, n=3. Hodnoty fluorescencie v paneloch (d, f) sú normalizované na modrú fluorescenciu membránového farbiva použitého na normalizáciu výsledkov na koncentráciu hostiteľských buniek. Fluorescencia v paneli (b) je normalizovaná na 0 mM MunI plazmid pre každú sériu vzoriek. Kosoštvorcové symboly v paneloch (d, f) zvýrazňujú jeden konkrétny stav najlepšie ilustrujúci rozdiely v odpovediach na infekciu od hostiteľa vnímavého na panel patogénov (d) a imúnneho voči panelu patogénov (f). Všetky série vzoriek označené ako "infikované GFP" sú experimenty, kde hostiteľ a patogén mali na povrchu komplementárne značky DNA, čo umožnilo fúziu lipozómov, nazývanú infekcia. Séria označená ako "GFP zdravá" ukazuje vzorky, kde boli hostiteľ a patogén zmiešané v uvedených pomeroch, ale neobsahovali komplementárne fúzne značky, čo znemožňovalo infekciu.

Infekcia syntetickej bunky môže byť "smrteľná", vyčerpanie zdrojov hostiteľskej bunky a takéto infekcie môžu byť "liečené" na záchrannú funkciu.

Vyššie uvedené experimenty s parazitmi a patogénmi ukázali, že syntetické bunky možno použiť ako model infekcie, kde patogén unáša zdroje hostiteľa. Ďalej sme sa rozhodli preskúmať scenár, v ktorom infekcia spôsobí, že metabolizmus hostiteľa prestane fungovať po expresii patogénneho proteínu. V tomto prípade je patogén porovnateľný s infekciou baktériou exprimujúcou smrtiaci toxín bez replikačného aspektu hostiteľa alebo parazita, pretože tieto syntetické bunky sa nereplikujú (obrázok 4a). Na vytvorenie tohto systému sme zvolili hemolyzín (aHL), prírodný toxín a membránový proteín široko používaný v syntetickom bunkovom inžinierstve na vytvorenie nešpecifických membránových pórov.22,23 Oceňujeme iróniu tohto výberu, pretože aHL je prirodzene exprimovaný Staphylococcus aureus ako toxínu a proteín bol neskôr privlastnený na inžinierstvo membránového transportu a predĺženie syntetického bunkového metabolizmu.24 Tu sa vraciame k používaniu aHL pre jeho prirodzenú úlohu škodlivého toxínu produkovaného infekciou. Ďalší pozoruhodný príklad použitia toxicity aHL na spôsobenie prirodzenej bunkovej smrti súvisiaci so syntetickým bunkovým inžinierstvom pochádza z aplikácie syntetických buniek ako technológie terapie rakoviny.25 Ako dôkaz princípu sme stanovili, že expresia vysokej koncentrácie aHL v syntetických bunkových vezikulách vedie k úniku obsahu bunky a výraznému zníženiu expresie GFP vo vnútri bunky. Tento účinok možno zvrátiť, ak vonkajšia strana lipozómov obsahuje všetky malé molekuly potrebné pre TxTl (obrázok 4b). V našom systéme modelu hostiteľ-patogén obsahuje hostiteľ plazmid kódujúci GFP a patogén obsahuje plazmid kódujúci aHL. Dizajn všetkých infekčných experimentov je podobný scenárom parazitov a patogénov opísaných vyššie, pričom patogén nenesie žiadnu T7 RNAP a hostiteľ aj patogén sú ozdobené DNA fúznymi značkami. Je zaujímavé, že sme pozorovali, že pri nižších koncentráciách patogénu (patogén tvorí 25 alebo 50 % celkovej populácie) sa fluorescencia hostiteľa znižuje len mierne. Zvýšenie koncentrácie patogénu na 75 % však vedie k významnému zníženiu fluorescencie GFP hostiteľa (obrázok 4c). Predpokladáme, že tento výsledok môže byť spôsobený relatívne pomalým únikom živín zo syntetických buniek pri nižšej koncentrácii aHL. Fluorescencia GFP sa merala až po 12 hodinách inkubácie a GFP je veľmi stabilný proteín. Preto je možné, že v prípade nižších koncentrácií aHL (nižšie množstvo patogénu) bol únik živín spôsobený aHL dostatočne pomalý na to, aby hostiteľské bunky nahromadili významné množstvá GFP predtým, ako sa účinky úniku vyvolaného aHL stali ochromujúcim. metabolizmus. Aby sme oddelili výsledky jednoduchej súťaže o zdroje medzi genómami hostiteľa a parazita, vykonali sme experimenty „infekcie so záchranou“, v ktorých vonkajší pufor obsahoval všetky malé molekuly, ktoré tvoria TxTl energiu, aminokyseliny a zmesi solí. Toto bolo nastavené podobne ako podmienky „živiny vonku“ testované na obrázku 4b. Zníženie fluorescencie hostiteľa v týchto experimentoch bolo podobné predchádzajúcim vzorkám "infekcia bez záchrany" s 25 a 50 % hladinami patogénu. Pokles fluorescencie hostiteľa pri 75 % patogénu bol významne menší ako pokles pozorovaný vo vzorkách bez záchrany (obrázok 4d). Zdá sa, že veľký rozdiel vo výsledkoch experimentu so 75 % parazita s údajovými bodmi na paneloch na obrázku 4 (c, d) zvýraznenými hviezdičkou podporuje našu hypotézu, že vyššie koncentrácie aHL spôsobujú poškodenie na začiatku reakcie. Pri nižšej koncentrácii patogénu je únik dostatočne pomalý na to, aby sa hostiteľský GFP akumuloval (ako je vidieť so záchrannými živinami aj bez nich), takže pozorovaná fluorescencia GFP sa po infekcii znižuje väčšinou kvôli konkurencii o zdroje. Pri vyšších koncentráciách patogénov sa fluorescencia GFP vo vzorkách s externými živinami znižuje najmä v dôsledku konkurencie zdrojov. Tieto experimenty demonštrujú, že môžeme vytvoriť syntetické bunky na modelovanie infekcie, čo vedie k dvom rôznym výsledkom: metabolická penalizácia samotnej infekcie (zníženie GFP v dôsledku konkurencie zdrojov) a „smrteľnejšia“ infekcia vyplývajúca zo zrušenia expresie proteínov hostiteľa. Povzbudení týmto pozorovaním sme sa rozhodli preskúmať systém, v ktorom by syntetické bunky mohli aktívne odolávať patogénnej infekcii a preskúmať metabolický trest takejto reakcie.

cistanche výhody pre mužov - posilnenie imunitného systému

Syntetické bunky sa môžu brániť pred infekciou pomocou stratégie inšpirovanej baktériami.

Inšpirovaní dobre známou funkciou restrikčných endonukleáz na ochranu baktérií pred cudzou DNA sme sa snažili použiť túto stratégiu v syntetických bunkách. Rozšírili sme systém parazitov uvedený na obrázku 2: okrem GFP sme do hostiteľa pridali plazmid obsahujúci MunI. Parazit obsahoval mCherry, ako v predchádzajúcich experimentoch. Plazmid mCherry obsahuje reštrikčné miesto Munl (obrázok 5a). Najprv sme vykonali experimenty s dôkazom princípu, aby sme vyhodnotili metabolické zaťaženie expresiou MunI na hostiteľovi. V týchto experimentoch s nezapuzdreným TxTl sme monitorovali expresiu GFP a expresiu mCherry, pričom každá bola zmiešaná so zvyšujúcim sa množstvom buď Munl alebo Ecorl plazmidu. Všetky gény boli pod kontrolou rovnakého promótora T7. GFP gén mal EcorI, ale nie Munl reštrikčné miesto a mCherry gén mal Munl, ale nie EcorI reštrikčné miesto. Keď sa plazmid reštrikčného enzýmu zmiešal s fluorescenčným proteínovým plazmidom bez rozpoznávacieho miesta pre tento reštrikčný enzým, expresia fluorescenčného proteínu sa znížila úmerne k zvýšeniu plazmidu reštrikčného enzýmu, čo naznačuje konkurenciu medzi týmito dvoma plazmidmi o zdroje TxTl, ako sa ukázalo skôr pre GFP a mCherry na obrázku 2. Tieto nerozrezané páry boli GFP s MunI (obrázok 5b) a mCherry s EcoI (obrázok 5e). Keď bol fluorescenčný proteín spárovaný s reštrikčným enzýmom schopným štiepiť gén pre tento fluorescenčný proteín, fluorescencia významne klesla takmer na úroveň pozadia pri vyšších koncentráciách plazmidov reštrikčného enzýmu. Tieto rezné páry boli GFP s EcoI (obrázok 5c) a mCherry s MunI (obrázok 5d). To naznačovalo pokles fluorescencie výrazne nad rámec jednoduchej konkurencie o zdroje a podobný scenáru infekcie znázornenému na obrázku 3. Expresia MunI v prítomnosti GFP znižuje expresiu GFP. Ak použijeme GFP ako proxy pre hostiteľský "základný" metabolizmus, potom MunI možno považovať za metabolickú záťaž hostiteľa.

Obrázok 4. Hostiteľ je náchylný na „smrteľnú“ infekciu, ale hostiteľa možno zachrániť. (a) Hostiteľ obsahuje plazmid GFP a patogén obsahuje plazmid kódujúci membránový kanál hemolyzínu (aHL). Po infekcii hostiteľ exprimuje aHL, ktorá vytvára póry v membráne, čo spôsobuje únik živín a vedie k zníženiu metabolickej aktivity hostiteľa. (b) Dôkaz princípu pre hostiteľa exprimujúceho aHL (žiadna infekcia, hostiteľ bol vytvorený s 5nM GFP aj s uvedeným množstvom aHL plazmidu). Hostiteľ bol inkubovaný v pufri s alebo bez živín (všetky zložky energie, soli a zmesi aminokyselín použité na prípravu translačného systému bez hostiteľských buniek). Optimálna koncentrácia záchranných živín bola stanovená experimentálne, údaje sú znázornené na obrázku S23. (c) Infekcia hostiteľa patogénom s rôznym množstvom patogénu na hostiteľskú bunku. Únik malých molekúl zo „zdravých“ a „infikovaných“ buniek sa priamo meral pomocou farbiva s malou molekulou, údaje sú znázornené na obrázkoch S24 a S25. (d) Experimenty podobné týmto sú uvedené na paneli (c), ale vonkajší pufor obsahuje živiny s malou molekulou podobné experimentálnym podmienkam „živiny mimo“ znázornené na paneli (b). Chybové pruhy na všetkých paneloch označujú SEM, n=3. Hodnoty fluorescencie v paneloch (b-d) sú normalizované na modrú fluorescenciu membránového farbiva použitého na normalizáciu signálu na koncentráciu hostiteľských buniek. Kosoštvorcové symboly na paneloch (c, d) zvýrazňujú jeden konkrétny stav najlepšie ilustrujúci rozdiely v reakcii na infekciu od hostiteľa bez vonkajšieho panelu živín (c) a imunitného voči patogénu v dôsledku prítomnosti vonkajšieho panelu živín (d). Pre panely (c, d) je séria „GFP infikovaný“ hostiteľ fúzovaný s patogénom nesúcim aHL proteín a „GFP zdravý“ je hostiteľ fúzovaný s patogénom, ktorý nenesie žiadny plazmid.

Pokračujeme k infekčným experimentom zmiešaním hostiteľa (s plazmidmi GFP a MunI) s parazitom (s plazmidom mCherry). Ako predtým, skúmali sme scenáre so zvyšujúcim sa množstvom parazitov v populácii (obrázok 5f). Pozitívna kontrola iba hostiteľa exprimujúceho mCherry (s EcorI namiesto MunI na vyváženie metabolickej záťaže) vytvorila referenčnú hodnotu pre teoretické maximálne množstvo proteínu patogénu, ktorý môže byť exprimovaný v hostiteľovi (obrázok 5f). Keď sa množstvo parazita zvýšilo, fluorescencia GFP hostiteľa sa znížila, ale zníženie fluorescencie infikovaného hostiteľa bolo výrazne menšie ako zníženie expresie GFP pozorované v skorších experimentoch s rovnakým parazitom. Fluorescencia GFP a parazitnej mCherry tohto infikovaného MunI exprimujúceho hostiteľa (údajový bod označený hviezdičkou na obrázku 5f) možno priamo porovnať s podobnými infekčnými hostiteľmi bez MunI (údajový bod označený hviezdičkou na obrázku 2e). U hostiteľa exprimujúceho MunI začal hostiteľský GFP s absolútne nižšou hladinou, kým bol zdravý (pretože niektoré zdroje sú presmerované na expresiu MunI), ale po infekcii je pokles fluorescencie hostiteľa oveľa menej významný a hostiteľ vytvára oveľa menej parazitného proteínu mCherry. než v prípade hostiteľa nevyjadrujúceho MunI. Tento experiment demonštruje výhodu hostiteľa, ktorý vynakladá určité prostriedky na obranu proti parazitom. Tento systém možno považovať za veľmi jednoduchý biochemický model pre organizmy exprimujúce proteíny na obranu proti budúcim infekciám alebo dokonca škodlivým environmentálnym faktorom. Hostiteľ je pôvodne menej robustný (ak berieme expresiu GFP ako štandard pre zdravie hostiteľa), ale v prípade infekcie sa dodatočné zdroje, ktoré hostiteľ vynaložil na expresiu obranných proteínov, vyplatia a poskytujú ochranu pred infikujúcim parazitom. Preto sme v tejto jednoduchej neživej syntetickej bunke rekonštituovali príklad základných biologických pretekov v zbrojení.

Obrázok 5. Hostiteľské bunky sa bránia pred infekciou. (a) Hostiteľské bunky obsahujú dva plazmidy: jeden kódujúci GFP (bez reštrikčného miesta MunI) a druhý kódujúci reštrikčný enzým MunI (gén "rezistencie voči parazitom"). Parazit obsahuje plazmid mCherry v systéme podobnom experimentom znázorneným na obrázku 2. Infekcia je sprostredkovaná fúziou cez DNA tagy na povrchu hostiteľa a parazita. Po infekcii je mCherry plazmid zavedený parazitom štiepený hostiteľským Munl reštrikčným enzýmom. (b-e) Meranie metabolických nákladov na vyjadrenie rezistencie parazitov. Experimenty sú v objemovom systéme TxTl, ktorý nie je zapuzdrený vo vezikulách. V každom experimente sa fluorescenčný proteínový plazmid (GFP alebo mCherry) zmiešal s plazmidom reštrikčného enzýmu (MunI alebo EcorI) v pomere uvedenom na osi x pre celkovú koncentráciu plazmidu 10 mM. GFP má reštrikčné miesto EcoI, ale nie miesto MunI, a mCherry má reštrikčné miesto MunI, ale nie EcoI. Trendová čiara je vizuálnym sprievodcom, ale nie prispôsobením údajov. Chybové úsečky označujú SEM, n=3. Kontrolné experimenty s purifikovanými reštrikčnými enzýmami namiesto ich expresie z plazmidu sú uvedené na obrázku S26. Bola tiež meraná stabilita lipozómov so zvýšeným množstvom parazitného plazmidu, údaje sú uvedené na obrázku S27. (f) Infekcia hostiteľa rastúcim množstvom parazita. "GFP zdravého hostiteľa" je expresia GFP z hostiteľských buniek fúzovaných s parazitom bez akéhokoľvek plazmidu. "Hostiteľ infikovaný GFP" je hostiteľ fúzovaný s parazitom nesúcim mCherry. Červená fluorescencia je fluorescencia mCherry z parazita fúzovaného s hostiteľom (k dispozícii sú iba údaje od infikovaného hostiteľa. Vzorky zdravého hostiteľa neniesli plazmid mCherry). Chybové pruhy na všetkých paneloch označujú SEM, n=3. Hodnoty fluorescencie sú normalizované na modrú fluorescenciu membránového farbiva použitého na normalizáciu výsledkov na koncentráciu hostiteľských buniek. Symbol kosoštvorca označuje expresiu proteínu parazita za konkrétnych podmienok infekcie, priamo porovnateľnú s údajovým bodom zvýrazneným hviezdičkou na obrázku 2e, experiment za rovnakých podmienok, ale s hostiteľom bez génu rezistencie MunI.

Obrázok 6. Inokulácia poskytuje obranu proti infekciám. (a) Hostiteľ obsahuje plazmid GFP. Patogén v týchto experimentoch je jednou z troch infekčných schém demonštrovaných v tomto dokumente: parazit (ako je znázornené na obrázku 2), patogén s reštrikčným enzýmom MunI tráviacim genóm GFP hostiteľa (ako je znázornené na obrázku 3) alebo patogén nesúci membránový kanál aHL spôsobujúci únik živín z hostiteľa (ako je znázornené na obrázku 4). V každom prípade hostiteľ a patogén obsahujú komplementárne DNA fúzne značky. Pred zavedením patogénu sa hostiteľ „naočkuje“: inkubuje sa s prebytkom ssDNA oligo komplementárnych k fúznym DNA tagom na povrchu hostiteľa (tagy identické s týmito na patogéne mínus cholesterolová skupina použitá na ukotvenie tagu k membráne patogén). Inokulácia spôsobí, že sa fúzne značky na povrchu hostiteľa stanú dvojvláknovými, čo znemožňuje fúziu s patogénom. (b) Dôkaz o princípe schémy očkovania. Populácia lipozómov nesúcich GFP pod kontrolou T7 RNA promótora, ale bez T7 RNA polymerázy, je fúzovaná s lipozómami obsahujúcimi T7 RNA polymerázu. Proteín GFP môže byť exprimovaný iba vtedy, ak tieto dve populácie fúzujú. Jeden alebo obaja z miešacích partnerov boli "naočkovaní" inkubáciou s DNA tagom kompatibilným s fúznymi tagmi na povrchu lipozómu, čím sa fúzne tagy stali dvojvláknovými a teda nekompatibilnými s fúziou. Reprezentatívny časový priebeh expresie proteínu je znázornený na obrázku S28. Kontrolné experimenty bez akýchkoľvek fúznych značiek sú na obrázku S29 a kontroly s nekompatibilnými fúznymi značkami sú uvedené na obrázku S30. Koncentrácia inokulačného oligo sa stanovila experimentálne, údaje sú uvedené na obrázku S31. (c) Experimenty s infekciou parazitmi. Hostiteľ nesúci GFP bol fúzovaný s parazitom nesúcim mCherry, ako je opísané na obrázku 2. Hostiteľ a parazit boli zmiešaní s rôznym pomerom hostiteľa k parazitovi; hostiteľské bunky boli buď naočkované (s dvojvláknovými DNA fúznymi značkami, ktoré nie sú kompatibilné s fúziou) alebo neboli naočkované (teda náchylné na fúziu s parazitom). Fluorescencia mCherry sa uvádza len pre vzorky s nenaočkovaným hostiteľom, pretože v naočkovaných vzorkách hostiteľa nebola žiadna merateľná fluorescencia mCherry. Obrátená inokulácia sa testovala očkovaním parazita namiesto hostiteľa, údaje sú znázornené na obrázku S32. (d) Infekčné experimenty s hostiteľským genómom citlivým na patogén nesúci reštrikčný enzým MunI, ako je opísané na obrázku 3. Infikovaná séria údajov predstavuje hostiteľa bez očkovania a inokulovaná séria údajov predstavuje vzorky s hostiteľom inkubovaným s inokulačnými oligonukleotidmi. teda nie sú náchylné na fúziu s patogénom. (e) Infekčné experimenty s patogénom nesúcim gén aHL vedú k tomu, že kanály aHL po infekcii presakujú živiny z hostiteľských buniek, ako je opísané na obrázku 4. Séria infikovaných údajov predstavuje hostiteľa bez očkovania a séria naočkovaných údajov predstavuje vzorky s hostiteľ inkubovaný s inokulačnými oligo, teda nie je náchylný na fúziu s patogénom. Chybové pruhy na všetkých paneloch označujú SEM, n=3. Hodnoty fluorescencie v paneloch (c-e) sú normalizované na modrú fluorescenciu membránového farbiva použitého na normalizáciu výsledkov na koncentráciu hostiteľských buniek. Niektoré údaje zobrazené na tomto obrázku sú experimenty s nastavením identickým s experimentmi znázornenými na predchádzajúcich obrázkoch (ako je uvedené v každom titulku). Tieto experimenty sa opakovali pre tento obrázok, aby sa získali údaje s použitím rovnakej šarže TxTl na priame porovnanie výsledkov, čím sa eliminovala variabilita medzi šaržami prípravkov TxTl.

Inokulácia syntetických buniek zabraňuje infekcii.

Vo vyššie opísanom príklade sme demonštrovali obranu hostiteľa pred vplyvom genómu patogénu expresiou extra proteínu. Ďalej sme sa opýtali, či je možné modelovať scenár, v ktorom nejaký zásah v prvom rade robí hostiteľa, ktorý bol predtým náchylný, imúnny voči infekcii. Nazvali sme to model očkovania. Aj keď je to ďaleko od dokonalej analógie, aspekt, na ktorý sme sa zamerali, je, že hostiteľská syntetická bunka nevynakladá žiadne zdroje na vytváranie imunity. V našom imunizačnom modeli sme navrhli liečbu, ktorá premení hostiteľskú syntetickú bunku, ktorá je citlivá na infekciu, na bunky, ktoré sa nedokážu spojiť s patogénom. Syntetický bunkový fúzny systém používaný v tomto dokumente sa spolieha na jednovláknové DNA tagy na vyvolanie fúzie lipozómovej membrány. Na inokuláciu proti fúzii s patogénom sme inkubovali bunky s DNA oligonukleotidom komplementárnym k fúznemu oligo na povrchu buniek (obrázok 6a). Najprv sme potrebovali potvrdiť, že inokulácia inkubáciou s komplementárnymi oligo funguje na zrušenie fúzie. V experimentoch na overenie princípu boli pripravené dve populácie lipozómov: jedna populácia mala TxTl s plazmidom kódujúcim GFP pod kontrolou T7 promótora a druhá populácia mala TxTl a T7 RNA polymerázu, ale žiadny plazmid. Po fúzii týchto dvoch populácií sa plazmid GFP zmiešal s T7 RNA polymerázou a vyvolal expresiu GFP. Ak tieto dve populácie mali jednovláknové a komplementárne fúzne značky, došlo k fúzii a bola detegovaná fluorescencia GFP. Ak sa jedna alebo obe populácie inkubovali s oligonukleotidom komplementárnym k fúznej značke, fúzia lipozómov nenastala a GFP sa neexprimoval (obrázok 6b). Po vytvorení inokulačného systému sme pristúpili k zavedeniu očkovania na ochranu hostiteľských syntetických buniek v troch scenároch infekcie opísaných vyššie v tejto práci. Najprv sme použili scenár parazita opísaný na obrázku 2. Hostiteľské bunky obsahujúce genóm GFP sa naočkovali oligo komplementárnym k fúznej značke na povrchu hostiteľa a hostiteľ bol zmiešaný s parazitom mCherry. Zmiešali sme hostiteľa s parazitom v rôznych pomeroch. Za všetkých podmienok infekcie bola fluorescencia parazita mCherry nedetegovateľná, ak bol hostiteľ naočkovaný a fluorescencia GFP naočkovaného hostiteľa sa neznížila. Kontrolné experimenty s nenaočkovaným hostiteľom ukázali zníženie expresie GFP hostiteľa a zvýšenie signálu parazita mCherry, ako sa očakávalo (obrázok 6c). Ďalej sme inokulačný systém aplikovali na prípad hostiteľa infikovaného patogénom nesúcim genóm kódujúci MunI reštrikčný enzým schopný tráviť GFP genóm hostiteľa, ako v experimentoch znázornených na obrázku 3. Naočkovaný hostiteľ nevykazoval pokles vo fluorescencii GFP po zmiešaní so zvyšujúcim sa množstvom patogénu, zatiaľ čo nenaočkovaný hostiteľ bol infikovaný a fluorescencia GFP hostiteľa sa znížila úmerne so zvyšujúcim sa množstvom patogénu (obrázok 6d). Inokulácia bola tiež účinná proti patogénu aHL. Inokulovaní hostitelia nevykazovali žiadne zníženie fluorescencie po zmiešaní s patogénom, zatiaľ čo fluorescencia GFP neočkovaného hostiteľa sa významne znížila s infekciou (obrázok 6e). Vo všetkých prípadoch tento jednoduchý inokulačný postup, inkubácia hostiteľa s DNA oligo komplementárnym k fúznemu oligo na povrchu hostiteľa, postačoval na zrušenie schopnosti patogénnych syntetických buniek infikovať hostiteľské bunky. Preto sme demonštrovali jednoduchý fyzikálno-chemický model zásahu, ktorý chráni hostiteľské bunky pred infekciou.

cistanche výhody pre mužov - posilnenie imunitného systému

ZÁVERY

V tomto článku demonštrujeme metódy na použitie syntetických minimálnych buniek na modelovanie parazitických a patogénnych infekcií. Motivácia našej práce bola dvojaká. Chceli sme vytvoriť komplexné správanie podobné životu v syntetických bunkách, čím sme uľahčili cieľ vytvoriť syntetické bunky, ktoré sa viac podobajú prírodným živým bunkám. Chceli sme tiež využiť výhody jednoduchého a kontrolovateľného syntetického bunkového systému na modelovanie základných vlastností procesov infekcie, očkovania a rezistencie. Zatiaľ čo syntetické bunky sa nevyvíjajú ani sa nereplikujú, tento systém umožňuje študovať dynamiku infekcie v jednoduchom a ľahko analyzovateľnom modeli. Dúfame, že tu opísané princípy infekcie pomôžu vytvoriť praktické a použiteľné modely pre rôzne patogény a zmiernenie infekcie. Štúdium tohto zjednodušeného syntetického bunkového systému poukázalo na základné interakcie medzi parazitom a patogénom. Zatiaľ čo syntetické bunky (zatiaľ) nežijú a nemajú schopnosť podstúpiť darwinovskú evolúciu, tento systém nám umožňuje pozorovať interakcie patogénu a hostiteľa bez schopnosti vyvinúť si prirodzenú imunitu alebo zmeniť virulenciu patogénu. Zatiaľ čo dynamika infekcie hostiteľa tu prezentovaná využíva syntetické bunky na báze baktérií, tento systém nie je vo svojej podstate obmedzený na bakteriálny TxTl. Bolo by dokonca možné predstaviť si použitie tu prezentovaného systému na modelovanie dynamiky infekcie v populáciách pripomínajúcich prirodzené ekosystémy, pričom by sa využila jednoduchosť vlastná syntetickým bunkám na úplnú kontrolu a štúdium interakcií medzi rôznymi členmi veľkých populácií.

LITERATÚRA

(1) Aplikácie. Mater. Dnes 2016, 19, 516−532.

(2) Gaut, NJ; Adamala, KP Rekonštituovanie prírodných bunkových prvkov v syntetických bunkách. Adv. Biol. 2021, 5, č. 2000188.

(3) Tan, C.; Saurabh, S.; Bruchez, poslanec; Schwartz, R.; Leduc, P. Molecular Crowding Shapes Gene Expression in Synthetic Cellular Nanosystems. Nat. Nanotechnol. 2013, 8, 602-608.

(4) Glantz, ST; Berlew, EE; Chow, BY Synthetic Cell-like Membrane Interfaces for Probing Dynamic Protein-Lipid Interactions, 1. vydanie; Elsevier Inc, 2019; Vol. 622.

(5) Zhao, J.; Zhang, Y.; Zhang, X.; Li, C.; Du, H.; Sønderskov, SM; Mu, W.; Dong, M.; Han, X. Napodobňovanie bunkového metabolizmu v umelých bunkách: transport univerzálnej molekuly cez membránu prostredníctvom vezikulovej fúzie. Anal. Chem. 2022, 94, 3811-3818.

(6) Damiano, L.; Stano, P. O „životnosti“ syntetických buniek. Predné. Bioeng. Biotechnol. 2020, 8, č. 953.

(7) Salehi-Reyhani, A.; Ces, O.; Elani, Y. Napodobeniny umelých buniek ako zjednodušené modely pre štúdium bunkovej biológie. Exp. Biol. Med. 2017, 242, 1309−1317.

(8) Chakraborty, T.; Wegner, SV Signalizácia z bunky do bunky prostredníctvom svetla v komunitách umelých buniek: Žiariaci dravec láka korisť. ACS Nano 2021, 15, 9434-9444.

(9) Dupin, A.; Simmel, FC Signalizácia a diferenciácia v multikompartmentalizovaných in vitro génových obvodoch na báze emulzie. Nat. Chem. 2019, 11, 32-39.

(10) Toparlak, OD; Zasso, J.; Bridi, S.; Serra, MD; Macchi, P.; Conti, L.; Baudet, M.-L.; Mansy, SS Umelé bunky poháňajú neurálnu diferenciáciu. Sci. Adv. 2020, 6, č. eabb4920.

(11) Robinson, AO; Venero, OM; Adamala, KP Toward Synthetic Life: Biomimetic Synthetic Cell Communication. Curr. Opin. Chem. Biol. 2021, 64, 165-173.

(12) Smith, JM; Chowdhry, R.; Booth, MJ Riadenie komunikácie medzi bunkami a syntetickými bunkami. Predné. Mol. Biosci. 2022, 8, č. 1321.

(13) Elani, Y. Interfacing Living and Synthetic Cells as a Emerging Frontier in Synthetic Biology. Angew. Chem., Int. Ed. 2021, 60, 5602− 5611.

(14) Rustad, M.; Eastlund, A.; Jardine, P.; Noireaux, V. Bezbunková syntéza TXTL infekčného bakteriofága T4 v reakcii v jednej skúmavke. Synth. Biol. 2018, 3, č. ysy002.

(15) Marshall, R.; Noireaux, V. Kvantitatívne modelovanie transkripcie a prekladu All-E. coli Cell-Free System. Sci. Rep. 2019, 9, č. 11980.

(16) Garamella, J.; Marshall, R.; Rustad, M.; Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: Platforma pre bezbunkovú syntetickú biológiu. ACS Synth. Biol. 2016, 5, 344−355.

(17) Deich, C.; Cash, B.; Sato, W.; Sharon, J.; Aufdembrink, L.; Gaut, NJ; Heili, J.; Stokes, K.; Engelhart, AE; Adamala, prepisovací systém KP T7Max. 2021, 1-28.

(18) Gaut, NJ; Gomez-Garcia, J.; Heili, JM; Cash, B.; Han, Q.; Engelhart, AE; Adamala, KP Programovateľná fúzia a diferenciácia syntetických minimálnych buniek. ACS Synth. Biol. 2022, 11, 855- 866.

(19) Stengel, G.; Zahn, R.; Höök, F. DNA-indukovaná programovateľná fúzia fosfolipidových vezikúl. J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 9584− 9585.

(20) Chizzolini, F.; Forlin, M.; Yeh Martín, N.; Berloffa, G.; Cecchi, D.; Mansy, SS Cell-Free Translation je variabilnejší ako transkripcia. ACS Synth. Biol. 2017, 6, 638−647.

(21) Shin, J.; Noireaux, V. Nástroj na expresiu bez buniek E. coli: Aplikácia na obvody syntetických génov a umelé bunky. ACS Synth. Biol. 2012, 1, 29-41.

(22) Noireaux, V.; Libchaber, A. Vezikulový bioreaktor ako krok k zostaveniu umelej bunky. Proc. Natl. Akad. Sci. USA 2004, 101, 17669-17674.

(23) Adamala, KP; Martin-Alarcon, DA; Guthrie-Honea, KR; Boyden, ES Engineering Genetic Circuit Interactions v rámci a medzi syntetickými minimálnymi bunkami. Nat. Chem. 2017, 9, 431−439.

(24) Noireaux, V.; Bar-Ziv, R.; Godefroy, J.; Salman, H.; Libchaber, A. Smerom k umelej bunke založenej na génovej expresii vo vezikulách. Phys. Biol. 2005, 2, P1-P8.

(25) Krinsky, N.; Kaduri, M.; Zinger, A.; Shainsky-Roitman, J.; Goldfeder, M.; Benhar, I.; Hershkovitz, D.; Schroeder, A. Syntetické bunky syntetizujú terapeutické proteíny vo vnútri nádorov. Adv. Healthcare Mater. 2018, 7, č. 1701163.

(26) Kwon, YC; Jewett, MC Vysokovýkonné spôsoby prípravy surového extraktu pre robustnú syntézu bezbunkových proteínov. Sci. Rep. 2015, 5, č. 8663.

(27) Slnko, ZZ; Hayes, CA; Shin, J.; Caschera, F.; Murray, RM; Noireaux, V. Protokoly pre implementáciu TXTL bezbunkového expresného systému založeného na Escherichia Coli pre syntetickú biológiu. J. Vis. Exp. 2013, 79, 1-15.

(28) Fujii, S.; Matsuura, T.; Sunami, T.; Nishikawa, T.; Kazuta, Y.; Yomo, T. Lipozómový displej pre in vitro selekciu a vývoj membránových proteínov. Nat. Protoc. 2014, 9, 1578-1591.

(29) Lôffler, PMG; Ries, O.; Rabe, A.; Okholm, AH; Thomsen, RP; Kjems, J.; Vogel, S. DNA-Programmed Liposom Fusion Cascade. Angew. Chem., Int. Ed. 2017, 56, 13228−13231.