Časť 1: Akteozidom potlačená mikroglia M1 Polarizácia prostredníctvom inhibovanej signálnej dráhy NF-KB a obnovy funkcie mitochondrií sprostredkovanej AMPK
Mar 06, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Abstrakt:
Pozadie:Alzheimerova choroba (AD)je najčastejším typom demencie. Zatiaľ čoakteozid z byliny cistanche(ACT), zlúčenina izolovaná z Cistanchetubulosamá neuroprotektívne vlastnosti. Základný mechanizmus regulácie polarizácie mikroglií však zostáva nedostatočne definovaný.Metódy:V tomto dokumente bol aplikovaný AlCl3-indukovaný model AD u lariev zebry, aby sa odhalila terapeutická účinnosť ACT. Bunky BV-2 sa použili na demonštráciu úlohy ACT na polarizáciu mikroglií. Sekvencia RNA, HPLC-Q-TOF-MS, western blot a molekulové dokovanie sa spojili, aby sa potvrdil jej mechanizmus.Výsledky:ACT významne zlepšila experimentálnu dyskinézu a poruchy nervového systému u zebry. Následne potlačil polarizáciu M1 a povýšil na fenotyp M2 v LPS-indukovaných BV-2 bunkách. Najprv sme preukázali, že ACT má hlboký transkriptomický vplyv, ktorý zahŕňa reguláciu kľúčových signálnych dráh pri zápale, biosyntéze arginínu, ako aj biosyntéze pantotenátu a CoA, korelujúcu s funkciou mitochondrií. ACT(akteozid z byliny cistanche) liečba znížila polarizáciu mikroglie M1 inhibíciou signálnej dráhy NF-KB. A metabolické dráhy boli ďalej potvrdené pomocou HPLC-Q-TOF-MS. Okrem toho ACT napravil nadmerné ROS, aby obnovil funkciu mitochondrií prostredníctvom AMPK-sprostredkovanej PGC-1 a UCP-2 upregulácie, v súlade s metabolickými zmenami. Je zaujímavé, že ACT sa môže priamo viazať na NF-KB aj AMPK, ako dokazuje molekulárne dokovanie.Závery:Výskum poskytol infúzny mechanizmus ACT a ilustroval novú perspektívu založenú na mitochondriálnej dysfunkcii s cieľom odhaliť spojenie medzi metabolizmom a polarizáciou mikroglií.
Pozadie:
Alzheimerovej choroby' s chorobou(AD) je bežné neurodegeneratívne ochorenie sprevádzané kognitívnou poruchou a dyskinézou[1]. Je charakterizovaná závažnou stratou neurónov, senilnými plakmi a neurobrilárnymi spleťami[2]. Patogenéza AD je multidimenzionálna a spojená s neuroinflamáciou. Neuroinflumácia je riadená aktiváciou gliových buniek, ktorá úzko súvisí s rozvojom AD[3, 4]. Počas progresie a exacerbácie neuroinflamácie sa za kľúčový faktor považuje mikroglia. Mikroglie sú primárne imunitné bunky v centrálnom nervovom systéme. Je úzko spojená s kaskádou procesov, ktoré zahŕňajú vývoj mozgu, udržiavanie neutrálneho prostredia, ako aj reakciu na zranenia a opravy[1]. Okrem toho, mikroglie môžu byť stimulované na fenotyp M1 a expresia prozápalových cytokínov je zvýšená, keď sa vyskytnú ochorenia súvisiace s neurozápalom, ako je AD[5]. Štúdie tiež ukazujú, že polarizácia na fenotyp M1 je často sprevádzaná metabolickými poruchami[6], čo spôsobuje nerovnováhu energetického metabolizmu a mitochondriálnu dysfunkciu[7]. Tieto nepriaznivé zmeny sú odvodené od neurodegenerácie, dokonca aj z AD.
akteozid z byliny cistanche(ACT), fenyletanoidový glykozid, je primárne odvodený od Cistanchetubulosa. Čoraz viac dôkazov naznačuje, že ACT má množstvo farmakologických aktivít, vrátane neuroprotektívnych[8], protizápalových[9] a antioxidačných[10] účinkov. Najmä sa uvádza, že ACT zlepšuje poškodenie učenia a pamäti, ako aj upreguluje energetický metabolizmus u potkanov indukovaných streptozotocínom [11]. Tiež sa predpokladá, že inhibuje neurónovú apoptotickú bunkovú smrť a mitochondriálne poškodenie u experimentálnych myší s autoimunitnou encefalomyelitídou [12]. Menej štúdií sa však zameralo na vplyv ACT na polarizáciu mikroglií M1/M2. Najmä neboli vykonané rôzne mechanizmy, ako je oprava funkcie mitochondrií a regulácia bunkového metabolizmu. Okrem toho mechanizmus ACT, ktorý prispel k polarizácii mikroglií M1 / M2, zostal nepreskúmaný.
Cieľom tejto správy bolo preskúmať terapeutickú účinnosť ACT, ako aj základný molekulárny mechanizmus ACT pri AD. V tomto prípade ACT preukázala významný neuroprotektívny účinok u lariev AD zebry vyvolanej AlCl{0}}. Okrem toho ACT účinne inhiboval polarizáciu M1 a podporoval fenotyp M2 v bunkách BV-2 indukovaných LPS. RNA-sekvenovanie (RNA-Seq) integrované s metabolomickou metódou na lepšie pochopenie základného mechanizmu ACT pri regulácii polarizácie mikroglií. Skúmal sa presluch medzi metabolizmom a polarizáciou mikroglií z hľadiska mitochondriálnej funkcie. Táto štúdia poskytne nový rešpekt pre ďalšie skúmanie ACT ako potenciálneho terapeutického činidla na liečbu AD.
Metódy:
Zoskupenie zvierat a modelov:
V tejto štúdii bol vybraný divý typ zebry (kmeň AB, 4 mesiace starý) (Nanjing Qi Wu Biotechnology Co., Ltd.). Boli udržiavané v 14/10-hodinovom cykle svetlo/tma pri 28 stupňoch podľa predchádzajúcej metódy[13]. Prírodné hnojivo a normálne vyvinuté embryá boli vytvorené a kultivované do 3 dní po oplodnení (dpf) v osvetľovacom inkubátore. Všetky pokusy so zebrou sa uskutočňovali pod dohľadom Výboru pre etiku zvierat Čínskej farmaceutickej univerzity.
Larvy zebry boli rozdelené do šiestich skupín a liečené od 3 dpf do 7 dpf: kontrolná skupina, modelová skupina, model plus skupina s donepezil hydrochloridom (DPZ), model plus skupiny ACT. Kontrolná skupina bola udržiavaná v médiu s 0,2 % DMSO a modelová skupina bola ošetrená 150 uM AlCI3 (pH 5,8). Model plus skupina DPZ bola spoločne ošetrená AlCl3 a 8 uM DPZ. Model plus ACT skupiny boli spoločne ošetrené AlCl3 a rôznymi koncentráciami ACT (200, 100, 50 uM). ACT(akteozid z cistanche)(HPLC čistota väčšia alebo rovná 98 percent) bola získaná od Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd. (Baoji, Čína). AlCl3.6H20 a DPZ boli zakúpené od Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., LTD. (Šanghaj, Čína).
Behaviorálna analýza
Pohyby lariev zebry boli zaznamenané pomocou analyzátora správania ViewPoint (Zebralab 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.) pri 28 stupňoch. Stručne povedané, parametre správania a spracovanie výsledkov boli v súlade s metódou, ktorú sme zaviedli skôr[13]. Tu sa na vyhodnotenie zotavenia dyskinézy u zebry vybrali priemerná rýchlosť (AS), zmena rýchlosti (AS), miera zotavenia dyskinézy (DRR) a účinnosť odpovede (RE, percentá).
Po ošetrení od 3 dpf do 7 dpf sa zozbierali larvy zebry na meranie aktivity AChE a ChAT. Na základe protokolu výrobcu bola aktivita detekovaná súpravami ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) (MLBIO biotechnology Co. Ltd., Shanghai, China). A koncentrácie proteínov rôznych vzoriek boli stanovené metódou BCA.
Bunky BV-2 boli nasadené do 6-jamkovej misky oddelene (n=6/skupina). Po ošetrení sa médium odstránilo a bunky sa trikrát premyli studeným PBS. Potom sa ihneď vystaví tekutému dusíku na potlačenie metabolizmu buniek. Bunky sa zozbierali studeným 80 percentným metanolom (1 ml/jamka) a suspenzia sa preniesla do 2 ml Eppendorfovej skúmavky. Na uľahčenie precipitácie proteínu sa 1 minútu intenzívne vortexuje a centrifuguje sa pri 13, 000 otáčkach za minútu 15 minút pri 4 stupňoch. Bunková suspenzia sa preniesla do novej 2 ml skúmavky Eppendorf a vysušila sa pod prúdom dusíka a skladovala sa pri -80 stupňoch až do analýzy. Vysušený zvyšok sa rekonštituoval v 150 ul vopred vychladeného 25 % acetonitrilu. Aby sa zabezpečila stabilita a presnosť sekvenčnej analýzy, rovnaké objemy (10 μl) každej vzorky buniek sa spojili ako vzorky na kontrolu kvality (QC). Počas detekcie metabolitu boli tieto vzorky injikované po každých šiestich vzorkách buniek, aby sa potvrdila ich stabilita. Na HPLC-Q-TOF-MS sa vstrekol 1 ul alikvót.
Analýza HPLC-Q-TOF-MS sa uskutočnila na systéme Agilent 1290 HPLC spojenom s hmotnostným spektrometrom Agilent 6530 Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Separácia sa uskutočnila na kolóne ACQUITY UPLC BEH C18 (2,1 x 100 mm, 1,7 um). Mobilná fáza bola zložená z 0,1 percenta kyselina mravčia-voda (obj./obj.; A) a acetonitril (B).
Rýchlosť §ow bola nastavená na {{0}},4 ml/min s nasledujúcimi optimálnymi podmienkami gradientovej elúcie: 0 až 2 min, 5 percent B; 2 až 20 minút, 5 percent až 95 percent B (pozitívny iónový mód); 0 až 2 minúty, 5 percent B; 2 až 20 minút, 5 percent až 95 percent B (režim záporných iónov). Prevádzkové parametre hmotnostného spektrometra boli nastavené nasledovne: teplota plynu, 320 stupňov; sušiaci plyn, 10 l/min; nebulizér, 35 psi; VCap, 4000 V; fragment, 120 V.
Nespracované údaje boli prevádzkované v programe MassHunter Workstation Software verzie B.07.00 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Nespracované údaje boli vopred spracované platformou XCMS. Analýza hlavných komponentov (PCA) a čiastočná diskriminačná analýza najmenších štvorcov (PLS-DA) normalizovaných údajov sa uskutočnili pomocou MetaboAnalyst (https://www.metaboanalyst.ca). V kombinácii s literatúrou boli rozdielne metabolity (VIP > 1, T-test P< 0.05)="" were="" identi¦ed="" on="" hmdb="" (https://hmdb.ca).="" finally,="" pathway="" analysis="" was="" conducted="" with="">
