Xican Li 1,2,*,† ID , Yulu Xie 1,2,†, Ke Li 3,4, Aizhi Wu 1,2,*, Hong Xie 1,2, Qian Guo 1,5,

Penghui Xue 1, Yerkingul Maleshibek 1, Wei Zhao 6, Jiasong Guo 7 a Dongfeng Chen 3,4

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com

1 School of Chinese Herbal Medicine, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, Čína; xieyulu1900@163.com (YX); xiehongxh1@163.com (HX); 15622178307@163.com (QG); 15228738137@163.com (PX); pandiphd@163.com (YM)

2 Inovatívne výskumné a vývojové laboratórium TCM, Guangzhou University of Chinese Medicine,

Guangzhou 510006, Čína

3 Škola základnej lekárskej vedy, Univerzita čínskej medicíny v Guangzhou, Guangzhou 510006, Čína; ys1090992678@163.com (KL); chen888@gzucm.edu.cn (DC)

4 Výskumné centrum základnej integratívnej medicíny, Guangzhou University of Chinese Medicine,

Guangzhou 510006, Čína

5 School of Basic Medical Science, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510007, Čína

6 Zhongshan School of Medicine, Sun Yat-sen University, č. 74 Zhongshan Road. 2, Guangzhou 510080, Čína; zhaowei23@mail.sysu.edu.cn

7 Katedra histológie a embryológie, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Čína;

† Títo autori prispeli k tejto práci rovnakým dielom.

Prijaté: 24. januára 2018; Prijaté: 20. februára 2018; Zverejnené: 23.2.2018

Abstrakt: Štúdia sa snažila preskúmať úlohu cukrových zvyškov a mechanizmy fenolufenylpropanoidantioxidanty. akteozidspolu s jeho apiozidom forsytozidom B a ramnozidom

poliumozidu, boli porovnávané s použitím rôznych antioxidačných testov. V troch testoch založených na prenose elektrónov (ET) (FRAP, CUPRAC, PTIO·-scavenging pri pH 4,5) boli relatívne hladiny antioxidantov približneakteozid >forsytozid B > poliumozid. Takýto poriadok bol dodržaný aj v

Test na zachytávanie PTIO· s prenosom H plus pri pH 7,4 a v troch testoch na zachytávanie radikálov s viacerými dráhami, tj ABTS plus ·-vychytávanie, DPPH·-vychytávanie a ·O2.-vychytávanie. V UV-vis spektrách každý z nich vykazoval červený posun pri 335 364 nm a dva slabé píky (480 a 719 nm), keď sa zmiešal s Fe2 plus; však,akteozidposkytuje najslabšiu absorpciu.

V ultravýkonnej kvapalinovej chromatografii spojenej s elektrosprejovou ionizačnou kvadrupólovou tandemovou hmotnostnou spektrometriou (UPLC.ESI.Q.TOF.MS/MS) sa nezistil žiadny vrchol tvorby radikálov a aduktov (RAF). MTT test odhalil, že poliumozid vykazoval najvyššiu životaschopnosť mezenchymálnych kmeňových buniek pochádzajúcich z kostnej drene s oxidačným stresom. Na záver,akteozidforsytozid B a poliumozid môžu byť zapojené do viacerých dráh na uplatnenie antioxidačného účinku, vrátane ET, H plus-prenosu alebo Fe2 plus-chelatácie, ale nie RAF. Prenos ET a H plus môže byť brzdený ramnosylovými a apiosylovými skupinami; avšak Fe2 plus -chelatačný potenciál môže byť zvýšený dvoma cukrovými zvyškami (najmä ramnosylovou skupinou). Všeobecným účinkom ramnosylových a apiosylových skupín je zlepšenie antioxidačných alebo cytoprotektívnych účinkov.

Kľúčové slová:akteozid; apiosyl; forsytozid B;fenylpropanoidglykozidy; poliumozid; ramnosyl

cistanche má antioxidačný účinok

1. Úvod

Nedávno akteozid (verbaskozid, obrázok 1), fenolfenylpropanoidglykozidZistilo sa, že vyskytujúce sa vo vretenici a iných rastlinách [1] zlepšuje účinnosť prenosu jadra somatických buniek psov (SCNT) počas procesu klonovania psov [2]. Okrem toho by akteozid mohol chrániť bunky ľudského neuroblastómu SH-SY5Y pred poškodením vyvolaným amyloidom [3] a fibroblasty ľudskej kože pred poškodením vyvolaným röntgenovým žiarením [4]. Jeho apiozid forsytozid B (obrázok 1) je tiež distribuovaný v rastlinách [5] a bolo pozorované, že má silné neuroprotektívne účinky s priaznivým terapeutickým časovým oknom [6]. Predpokladá sa, že tieto priaznivé účinky na bunky a tkanivá sú spojené s ochranou niektorých biomolekúl, ako sú lipidy a DNA. V skutočnosti sa preukázalo, že akteozid a jeho analóg cistanozid F inhibujú mitochondriálnu peroxidáciu lipidov u potkanov [7]. Je známe, že peroxidácia lipidov je výsledkom bunkového oxidačného stresu a v konečnom dôsledku z reaktívnych foriem kyslíka (ROS).

Obrázok 1. Štruktúry (vľavo) a modely guľôčok a palice založené na preferenčnej konformácii (vpravo) troch prirodzenýchfenylpropanoidglykozidy(akteozid, forsytozid B a poliumozid).

Z hľadiska ochrany DNA môžu akteozid a jeho deriváty rýchlo opraviť radikály DNA, ako je 2'-deoxyadenozín-5'-monofosfát (dAMP) a 2'-deoxyguanozín-5'-monofosfát (dGMP) [ 8]. Tieto sekundárne deoxynukleotidové radikály môžu ďalej oxidačne poškodzovať bunky, čo vedie k mutagenéze a karcinogenéze [9]. Biofyzikálna štúdia ukázala, že akteozid a jeho deriváty by sa mohli ukotviť do malých žliabkov DNA a rýchlo opraviť takéto oxidačné poškodenie DNA [10]. Model guľôčkovej tyčinky založený na preferenčnej konformácii navrhuje (obrázok 1, vpravo), že tieto molekuly sú prolatované a môžu ľahko dosiahnuť slučku DNA, a teda sú schopné rýchlo opraviť poškodenie radikálov DNA [8].

Avšak z hľadiska biochémie sa oprava v podstate uskutočňuje cestou zachytávania ROS (tj antioxidantu). Ako už bolo spomenuté, tvorba katiónov deoxynukleotidových radikálov je v konečnom dôsledku z útoku ROS, vrátane voľných radikálov (napr. ·OH radikál [11]) a molekúl oxidantov (napr. H202 [12]). Predpokladá sa, že zachytávanie ROS účinne znižuje bunkový oxidačný stav [13,14] a zlepšuje kvalitu kmeňových buniek [12,15]. Preto je potrebné študovať ich antioxidačnú schopnosť a ďalej diskutovať o možných mechanizmoch.

V tejto štúdii tri fenolickéfenylpropanoidglykozidy(akteozid, forsytozid B a poliumozid) boli porovnávané pomocou rôznych antioxidačných testov, vrátane 2-fenyl-4,4,5,5-tetrametylimidazolínu-1-oxyl{{6 }}test vychytávania oxidových radikálov (PTIO·), test antioxidačnej sily redukujúceho železité ióny (FRAP), test antioxidačnej kapacity znižujúci meď (CUPRAC), 2,2→-azino-bis(3-etylbenzén-tiazolín{{13 test zachytávania radikálov kyseliny sulfónovej (ABTS plus ·),

1, 1-difenyl-2-pikrylhydrazínový (DPPH·) test a · O2.-scavenging, ako aj Fe2 plus-chelatačné UV-spektrá analýzy. Následne sa ich reakčné produkty s DPPH* určili použitím ultravýkonnej kvapalinovej chromatografie spojenej s elektrosprejovou ionizačnou štvorpólovou tandemovou hmotnostnou spektrometriou (UPLC.ESI.Q.TOF.MS/MS). Nakoniec sa ich cytoprotektívny účinok na mezenchymálne kmeňové bunky odvodené z kostnej drene (bmMSC) odhadol pomocou

Test 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenylu (MTT). Ako je vidieť na obrázku 1, rozdiel medzi tromi fenolovýmifenylpropanoidglykozidy(tj akteozid, forsytozid B a poliumozid) je typ glykozidu: forsytozid B je apiozid akteozidu, zatiaľ čo poliumozid je ramnozid akteozidu. Táto porovnávacia štúdia teda tiež pomáha pochopiť úlohu apiosylu a ramnosyluantioxidantúčinky.

cistanche bieliaci účinok na pokožku proti oxidácii

2. Výsledky

2.1. Testy na redukciu kovov (FRAP a CUPRAC)

V štúdii sme uskutočnili dva testy na redukciu kovov, tj test FRAP a test CUPRAC. Ako je znázornené v Suppl. 1, akteozid a jeho deriváty zvýšili relatívne percentá FRAP (alebo Cu2 plus redukčná sila) pri 0 – 10 g/l spôsobom závislým od dávky. Ich poradie relatívnych hladín redukujúcich kovy sa zhruba znížilo v poradí akteozid > forsytozid B > poliumozid (tabuľka 1).

Tabuľka 1. Hodnoty IC50 akteozidu, forsytozidu B a poliumozidu v rôznychantioxidantytesty.

2.2. PTIO·-Scavenging Assay

Naše laboratórium nedávno vyvinulo test PTIO·-scavenging [16]. Môže sa použiť na vyhodnotenie hladín antioxidantov a na preskúmanie ciest antioxidantov. Ako je uvedené v Suppl. 1, akteozid a jeho deriváty by mohli úspešne vychytávať PTIO· pri pH 4,5 a pH 7,4. Avšak podľa hodnôt IC50 v tabuľke 1 boli ich relatívne hladiny vychytávania PTIO pri rovnakej hodnote pH navzájom odlišné. Každý akteozid a jeho deriváty tiež vykazovali rôzne úrovne vychytávania PTIO medzi pH 4,5 a pH 7,4. Vo všeobecnosti boli hladiny PTIO-scavenging pri 7,4 vyššie ako pri pH 4,5.

2.3. ABTS plus ·-Scavenging a DPPH·-Scavenging Assays

ABTS plus ·-scavenging a DPPH·-scavenging sú teraz široko používané na antioxidačné štúdie čistých zlúčenín alebo extraktov. Ako je vidieť v Suppl. 1, akteozid a jeho deriváty v závislosti od koncentrácie zvýšili percentá ABTS plus ·-scavenging alebo DPPH·-scavenging.

Avšak, pokiaľ ide o hodnoty IC50 v tabuľke 1, ich relatívne hladiny ABTS plus ·-scavenging boli nájdené v poradí akteozid > forsytozid B > poliumozid > Trolox. Podobné poradie bolo možné pozorovať aj v teste vychytávania DPPH.

2.4. UPLC.ESI.Q.TOF.MS/MS Analýza produktov reakcie DPPH

Reakčný produkt DPPH· s každým z trochfenylpropanoidglykozidysa skúmala pomocou analýzy UPLC.ESI.Q.TOF.MS/MS. V analýze (Suppl. 2) žiadny z troch fenylpropanoidových glykozidov nevytvoril vrchol produktu RAF. Na porovnanie sa zistilo, že kyselina kávová poskytuje dimérny produkt (m/z 359–360, dodatok 2).

2.5. UV-Vis-spektrálna analýza Fe2 plus -chelatačných produktov

Keďže UV-vis-spektrá môžu charakterizovať kovové komplexy, štúdia teda použila UV-vis-spektrá na analýzu možnej Fe2 plus-chelatačnej reakcie s tromifenylpropanoid glykozidy. Ako je znázornené na obrázku 2, každý z nich by mohol produkovať batochromický posun (335 nm•364 nm) v UV spektre. Medzitým by každý z nich mohol poskytnúť dva slabé vis-spektrálne píky vo viditeľnom spektre (480 nm a 719 nm) a viesť k svetlozelenému vzhľadu. Avšak maximálna intenzita bola v zostupnom poradí poliumozid > forsytozid B > akteozid.

2.6. Autooxidačný test pyrogalolu na zachytávanie aniónu superoxidu (·O2.).

Autooxidačný test pyrogallolu naše laboratórium vylepšilo v roku 2012 [17]. V tejto štúdii sa použil na odhad potenciálu zachytávania ·O2. Ako je vidieť v Suppl. 1, všetok akteozid a jeho deriváty by mohli v závislosti od dávky zvýšiť percentá zachytávania ·O2. Relatívna biologická aktivita sa však znížila v poradí poliumozid > forsytozid B > akteozid, podľa hodnôt IC50 v tabuľke 1.

2.7. Cytoprotektívny účinok voči oxidačne stresovaným bmMSC (MTT test)

Na posúdenie cytoprotektívnych účinkov akteozidu a jeho derivátov sme vykonali test MTT. V teste boli bmMSC poškodené oxidačným činidlom H2O2, poškodené bmMSC boli potom ošetrené akteozidom a jeho derivátmi. Hodnoty A490nm sa použili na vyhodnotenie relatívnych cytoprotektívnych účinkov. Ako je vidieť v tabuľke 2, každý akteozid a jeho deriváty v závislosti od dávky zvýšili hodnoty A490nm. Pri rovnakej koncentrácii však poliumozid poskytoval najvyššie hodnoty A490nm.

3. Diskusia

Je známe, že antioxidačné pôsobenie prírodných fenolových zlúčenín sa podieľa na prenose elektrónov (ET) [18,19]. Niektoré testy na redukciu kovov na báze ET sa teda široko používajú na hodnotenie antioxidačných hladín fenolov, ako sú testy FRAP a CUPRAC. Pokyny pre test FRAP musia byť splnené s pH nižším ako 3,6. Takéto kyslé prostredie úspešne potlačilo H plus ionizáciu z fenolov; preto sa test FRAP považuje za obyčajný ET proces [20,21]. Účinnosť akteozidu a jeho derivátov v teste FRAP znamená, že ak akteozid a jeho deriváty pôsobia akoantioxidantymôžu použiť ET dráhu na uplatnenie svojho antioxidačného účinku.

Okrem toho sme tiež vykonali test CUPRAC v pufri s pH 7,4. Ako je vidieť v Suppl. 1, akteozid a jeho deriváty v závislosti od dávky zvýšili svoje percentá redukčnej sily Cu2 plus, čo naznačuje, že by mohli zostať ET potenciálom pri fyziologickom pH. Ich ET potenciály však klesali v nasledujúcom poradí: akteozid > forsytozid B > poliumozid (tabuľka 1). Táto dynamika jasne naznačuje, že apiosylová skupina vo forsytozide B a ramnosylová skupina v poliumozide znížili ET potenciál.

cistancheje inhibítor tyrozinázy

Aby sa otestovala možnosť, že sa ET vyskytuje počas ich procesov zachytávania radikálov, do štúdie bol zavedený voľný radikál PTIO so sústredením na kyslík. Dôkazy cyklickej voltametrie odhalili, že PTIO·-vychytávanie pod pH 5.0 je jedinou elektrónovo-redoxnou reakciou [22]. Pozorovanie, že akteozid a jeho deriváty by mohli účinne vychytávať radikál PTIO pri pH 4,5, naznačuje možnosť ET počas ich procesov zachytávania radikálov. Je zrejmé, že toto zistenie ďalej podporuje vyššie uvedené výsledky testov FRAP a CUPRAC a predchádzajúce výsledky, že darcovský elektrón (e) je znakom fenolovýchantioxidanty[23]. Pri fyziologickom pH 7,4 však PTIO-scavenging esej nie je len ET dráhou, ale zahŕňa aj dráhu prenosu protónov (H plus). Počas procesu bolo navrhnuté, aby PTIO akceptoval H plus z fenolových látok, aby sa vytvoril vrchol produktu ([PTIO-H] plus ) [16]. Pretože prenos H plus je vždy sprevádzaný ET v postupných alebo synchrónnych mechanizmoch [24], realistickým (alebo konečným) produktom je molekula [PTIO-H] [22]. Vychytávanie PTIO· pri pH 7,4 (Suppl. 1) znamená, že akteozid a jeho deriváty majú tiež potenciál prenosu H plus. Hodnoty IC50 (tabuľka 1) ukázali, že

relatívne potenciály prenosu H plus boli v zostupnom poradí akteozid > forsytozid B > poliumozid. Je zrejmé, že apiosylové a ramnosylové skupiny tiež oslabili potenciál prenosu H plus počas antioxidačného procesu.

Ako už bolo uvedené, počas antioxidačného procesu fenolových látok je ET zvyčajne sprevádzaný prenosom protónov (H plus ) za vzniku niekoľkých antioxidačných mechanizmov [24], ako je prenos atómu vodíka (HAT) [23,25–27], sekvenčné elektrónové -transfer protónov (SEPT) [26,27], sekvenčný prenos jednoelektrónov so stratou protónov (SPLET) [26] a prenos elektrónov spojených s protónom (PCET) [24–26,28].

Napríklad ABTS plus ·-scavenging, reakcia, ktorej dominuje prenos jedného elektrónu (SET) [29], bola nedávno tiež dokázaná ako ovplyvnená hladinami H plus [30]. ABTS plus ·-scavenging je teda antioxidačný test založený na viacerých dráhach [21,31]. Skutočnosť, že akteozid a jeho deriváty môžu zachytávať radikály ABTS plus · naznačuje, že ich antioxidačný účinok môže byť sprostredkovaný aj viacerými cestami. Táto hypotéza je ďalej potvrdená dôkazmi z testu DPPH·-scavenging, reakcie zahŕňajúcej HAT, ET, SEPT a PCET viaceré dráhy [26,32]. Kvantitatívna analýza založená na hodnotách IC50 (tabuľka 1) však odhalila, že v aspektoch ABTS plus ·-scavenging a DPPH·-scavenging je akteozid lepší ako jeho apiozid forsytozid B a ramnozid poliumozid. Dá sa teda vyvodiť, že apiosylové a ramnosylové skupiny nakoniec bránia viaccestným potenciálom (najmä ET a H plus-prenosu) počas procesu zachytávania voľných radikálov. Ako uviedli autori a iní [14,26], počas antioxidačného procesu môže dôjsť aj k RAF reakcii. Na overenie možnosti RAF však trifenylpropanoidglykozidyspolu s kyselinou kávovou boli študované pomocou analýzy UPLC.ESI.Q.TOF.MS/MS. Zistilo sa, že kyselina kávová poskytuje dimérny produkt, zatiaľ čo trifenylpropanoidglykozidyneprodukoval žiadny vrchol produktu RAF.

Toto zistenie jasne naznačuje, že trifenylpropanoidglykozidynemôžu podstúpiť dráhu RAF, aby uplatnili svoj antioxidačný účinok. Pretože tri fenylpropanoidové glykozidy možno považovať za estery kyseliny kávovej (obrázok 1), takýto rozdiel medzi kyselinou kávovou a estermi kyseliny kávovej tiež naznačuje, že obrovská časť môže brániť tvorbe RAF.

Z hľadiska vychytávania voľných radikálov môžu akteozid a jeho deriváty podstúpiť viacero ciest, aby uplatnili svoj antioxidačný účinok. Tieto antioxidačné dráhy sa aspoň podieľajú na prenose ET a H plus (ale nie RAF). Naše zistenia sú čiastočne podporené teoretickou štúdiou, že akteozid by mohol pôsobiť antioxidačne prostredníctvom SPLET dráhy. V tomto procese môže akteozid najprv deprotonovať (H plus -prenos) za vzniku aniónu. Predpokladá sa, že k deprotonácii dochádza v katecholových skupinách so slabou kyslosťou. Následne anión odovzdal elektróny za vzniku fenoxyradikálovej formy [33]. Fenoxy radikály s pu konjugáciou sú však do určitej miery stabilné. Samozrejme, v tomto smere sú v budúcnosti potrebné ďalšie experimentálne práce.

Stojí za zmienku, že bunkový oxidačný stres môže pochádzať aj z prechodných kovov (najmä Fe2 plus ). Ión Fe2 plus však môže premeniť molekulu H2O2 na najškodlivejšie radikály · OH prostredníctvom Fentonovej reakcie (Fe2 plus plus H2O2 ● Fe3 plus plus ·OH plus OH.). Preto môže zoslabenie hladín Fe2 plus účinne inhibovať radikály ·OH, aby sa uvoľnil bunkový oxidačný stres. V skutočnosti chelatácia železa prírodnými fenolmiantioxidantyteraz sa vyvinula ako účinná terapia pre niektoré ochorenia súvisiace s oxidačným stresom [34,35].

V tejto štúdii boli akteozid a jeho deriváty navrhnuté ako účinné chelátory Fe2 plus zmenami v spektroskopii a farbách roztoku (obrázok 2). Napriek tomu je akteozid horší ako dva glukozidy pri chelátovaní Fe2 plus a forsytozid B s apiosylovou skupinou je horší ako poliumozid s ramnosylovou skupinou. Na základe porovnania ich preferenčných konformácií (obrázok 1 vpravo) sa navrhuje, že apiosylová (alebo ramnosylová) časť môže pomôcť hlavnému ligandu (fenylpropanoidskupina) pri chelatácii Fe2 plus . Takýto synergický efekt nepochybne posilňuje Fe2 plus -chelatačné schopnosti a zväčšuje UV-VIS vrcholy. Avšak ramnosyl je účinnejší ako apiosyl vo svojej Fe2 plus -chelatačnej schopnosti. Rozdiel možno pripísať skutočnosti, že ramnosyl sa vyskytuje v hexocyklickej forme (tj /-L-ramnopyranozyl), zatiaľ čo apiosyl je v pentacyklickej forme (tj -D-apiofuransyl). Je známe, že hexocyklická forma je väčšia a stabilnejšia. Hexocyklický ramnosyl je teda účinnejší v porovnaní s pentacyklickým apiosylom vo svojej Fe2 plus -chelatačnej schopnosti.

Aby sme otestovali, či akteozid a jeho deriváty môžu zachytávať ROS, uskutočnili sme test autooxidácie pyrogallolu. Ako je vidieť v Suppl. 1, všetky by mohli účinne zachytávať ·O2. radikál, typický ROS vyskytujúci sa v bunkách. Relatívna bioaktivita však klesla v poradí poliumozid > forsytozid B > akteozid. Toto poradie je tiež paralelné s poradím cytoprotektívnych účinkov (tabuľka 2). Toto zistenie naznačuje, že všeobecným účinkom ramnosylovej skupiny alebo apiosylovej skupiny je zvýšenie účinku zachytávania ROS alebo cytoprotektívnych účinkov.

cistanchemajúfunkciuzbieleniekoža

4. Materiály a metódy

4.1. Chemikálie a zvieratá

Akteozid (číslo CAS: 61276-17-3, 97 percent), forsytozid B (číslo CAS: 81525-13-5, 97 percent) boli získané od spoločnosti BioBioPha (Kunming, Čína, doplnok 3). Poliumoside (číslo CAS: 94079-81-9, 97 percent) izoloval náš tím z tradičnej čínskej byliny Callicarpa pei HT Chang (Suppl. 3). DPPH·, (o)-6-hydroxyl-2,5,7,8-tetrametylchromán-2-karboxylová kyselina (Trolox), 2,9-dimetyl{{ 16}},10-fenantrolín (neocuproín), 2,4,6-tripyridyltriazín (TPTZ) a pyrogalol boli zakúpené od spoločnosti Sigma-Aldrich Shanghai Trading Co. (Shanghai, Čína). (NH4)2ABTS [2,2-→-azinobis (3-etylbenzén-tiazolín-6-diamónna soľ kyseliny sulfónovej)] sa získal od Amresco Chemical Co. (Solon, OH, USA). Radikál PTIO bol zakúpený od spoločnosti TCI Development Co., Ltd. (Shanghai, Čína). Kyselina kávová bola zakúpená od Národného inštitútu pre kontrolu farmaceutických a biologických produktov (Peking, Čína). Dulbeccovo modifikované Eaglovo médium (DMEM), fetálne bovinné sérum (FBS) a trypsín boli zakúpené od Gibco (Grand Island, NY, USA). Testovacia súprava Annexin V/propidium jodid (PI) bola zakúpená od Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Všetky ostatné činidlá boli analytickej čistoty.

Krysy Sprague-Dawley (SD) vo veku 4 týždňov boli získané z Animal Center of Guangzhou University of Chinese Medicine. Protokol tohto experimentu sa uskutočnil pod dohľadom Inštitucionálneho výboru pre etiku zvierat na čínskej univerzite v Guangzhou (číslo schválenia 20170306A).

4.2. Testy na redukciu kovov (FRAP a CUPRAC)

Testy na redukciu kovov zahŕňajú test Fe3 plus-redukujúci výkon a Cu2 plus-redukčný výkon. Test na redukciu Fe3 plus zaviedli Benzie and Strain a formálne sa nazýva FRAP [20]. Experimentálny protokol tohto testu bol opísaný v predchádzajúcej správe [9]. V stručnosti, činidlo FRAP bolo pripravené čerstvo zmiešaním 10 mM TPTZ, 20 mM FeCl3 a 0,25 M acetátového pufra v pomere 1:1:10 pri pH 3,6. Testovaná vzorka (x=4-20 1, 0,05 mg/ml) sa pridala k (20,x) 1 95 percentného etanolu a následne 80 1 FRAP činidla. Po 30-minútovej inkubácii pri teplote okolia sa merala absorbancia pri 595 nm pomocou čítačky mikrodoštičiek (Multikan FC, Thermo Scientific, Shanghai, Čína). Relatívna redukčná sila vzorky sa vypočítala pomocou nasledujúceho vzorca:

kde Amax bola maximálna absorbancia reakčnej zmesi so vzorkou a Amin je minimálna absorbancia v teste. A je absorbancia vzorky.

Cu2 plus -redukčná sila môže tiež charakterizovať hladinu antioxidantov, a preto sa nazýva CUPRAC. Tento test sa uskutočnil podľa predtým publikovanej metódy [36]. Stručne, 12 1 vodného roztoku CuSO4 (10 mmol/l), 12 1 etanolového roztoku neocuproínu (7,5 mmol/l) a (75 x) 1 tlmivého roztoku CH3COONH4 (0). 1 mol/l, pH 7,5) sa pridali do jamiek s rôznymi objemami vzorky (0,05 mg/ml, 4–20 l). Absorbancia pri 450 nm po 30 minútach sa merala pomocou vyššie uvedenej čítačky mikrodoštičiek. Relatívny výkon CUPRAC bol vypočítaný pomocou vzorca pre FRAP. Amax bola maximálna absorbancia reakčnej zmesi so sample a Amin je minimálna absorbancia v teste. A je absorbancia vzorky.

cistanchemajú účinky bielenia pokožky

Pls kliknite sem pre časť 2