Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Katharina Artinger', Alexander H. Kirsch', Agnes A. Mooslechner', Daniel J. Cooper23, Ida Aringer', Max Schuller', Corinna SchabhüttI', Konstantin A. Klötzer', Kerstin Schweighofer', Philipp Eller, Hideo Yagita', Anna L. Illert', Alexander R. Rosenkranz', Peter J. Lane2 a Kathrin Eller

Cistanche môže veľmi dobre pomôcť s funkciou obličiek

„Klinická divízia nefrológie, oddelenie vnútorného lekárstva, Lekárska univerzita v Grazi, Graz, Rakúsko; Centrum rady pre lekársky výskum pre imunitnú reguláciu, Inštitút pre biomedicínsky výskum, Univerzita v Birminghame, Birmingham, Spojené kráľovstvo; Divízia globálneho a tropického zdravia, Menzies School of Health Research a Charles Darwin University, Darwin, Northern Territory, Austrália; Jednotka intenzívnej starostlivosti, Katedra internej medicíny, Lekárska univerzita v Grazi, Graz Rakúsko: „Katedra imunológie, School of Medicine Juntendo University, Tokio, Japonsko; a titul Katedra medicíny l, Medical Center-University of Freiburg, Lekárska fakulta, Univerzita vo Freiburgu, Freiburg, Nemecko

Kostimulácia je predpokladom patogénnej aktivity pri ochoreniach sprostredkovaných T bunkami a bolo preukázané, že ako terapeutický cieľ dosahuje toleranciu pri orgánovo špecifickej autoimunite. Tu sme hodnotili zapojenie členov rodiny nádorových nekrotizujúcich faktorov CD30 a OX40 do sprostredkovaných imunitným komplexomobličky choroba. In vitro stimulácia a proliferácia sa uskutočnili s bunkami CD4 plus z myší divokého typu a myší CD30/OX40 s dvojitým knock-out (CD30OX40). Štúdie in vivo sa uskutočnili indukciou nefrotoxickej sérovej nefritídy u myší divokého typu, CD30OX40, CD30', stupeň OX40, rekonštituovaných myší Ragl~ a C57Bl/6J liečených protilátkami CD30L aOX40L. CD30, OX40 a ich ligandy boli upregulované na rôznych leukocytoch pri nefrotoxickej sérovej nefritíde. Myši CD30OX40, ale nie myši CD30/alebo OX40 boli chránené pred nefrotoxickou sérovou nefritídou. Podobná ochrana bola zistená u myší Rag1, ktorým boli injikované CD4 plus T-bunky z myší CD30OX40', v porovnaní s myšami Rag1", ktorým boli injikované bunky CD4T z myší divokého typu. Okrem toho CD4 plus T bunky s deficitom CD30OX40/vykazovali zníženú expresiu CCR6 in vivo. CD30OX40* bunky boli plne schopní

diferencovali sa na podskupiny pomocných T buniek sprostredkujúcich ochorenie, ale vykazovali významne znížené hladiny proliferácie in vivo a in vitro v porovnaní s bunkami divokého typu. Blokovanie protilátok proti CD30L a OX40L zlepšilo nefrotoxickú sérovú nefritídu bez ovplyvnenia pan-efektorových alebo pamäťových T bunkových populácií. Naše výsledky teda naznačujú podporu ochorenia prostredníctvom signalizácie CD30 a OX40 v dôsledku uľahčenia prehnanej proliferácie T buniek a migrácie T pomocných buniek 17 pri nefrotoxickej sérovej nefritíde. Kostimulačná blokáda zameraná na signálne dráhy CD30 a X40 teda môže poskytnúť novú terapeutickú stratégiu pri autoimunitných ochoreniach.ochorenie obličiek.

Prekladové vyhlásenie

Tento článok popisuje použiteľnosť signálnych dráh CD30 a OX40 ako budúcich terapeutických cieľov pri glomerulárnom ochorení sprostredkovanom imunitným komplexom pomocou myšacieho modelu nefrotoxickej sérovej nefritídy. Kombinovaná blokáda kostimulačných dráh CD30 a OX40 je spôsob, ako dosiahnuť periférnu toleranciu pri autoimunite znížením patogénnej hyperproliferácie v sekundárnych lymfoidných orgánoch a migráciou patogénnych T pomocných buniek 17 doobličky. Keďže tradičné možnosti liečby boli sprevádzané závažnými nežiaducimi účinkami, kombinovaná blokáda CD30 a OX40 by pravdepodobne viedla k menšiemu počtu život ohrozujúcich infekcií v porovnaní s tradičnými imunosupresívnymi terapiami.

Kostimulačná signalizácia je predpokladom aktivácie, diferenciácie, efektorovej funkcie a prežitia T-buniek. Blokovanie kostimulácie bolo identifikované ako stratégia na dosiahnutie imunitnej tolerancie. Popri superrodine Ig, vrátane CD28 a B7, sú väčšina kostimulačných molekúl členmi evolučne starej a vysoko konzervovanej superrodiny tumor nekrotizujúceho faktora (TNF). CD30 a OX40 sú prozápalovými členmi superrodiny TNF, ktoré nielenže zdieľajú spoločné signálne dráhy, ale tiež funkčne pôsobia synergicky. Faktory spojené s receptorom TNF interagujú s oblasťami intracelulárneho receptora a podporujú prežitie buniek prostredníctvom signalizácie nu-dear faktor-KB v oboch prípadoch. CD30 a OX40, ako aj ich ligandy CD30L a OX40L, sa môžu exprimovať na T a B bunkách a na rôznych bunkách prezentujúcich antigén.

CD30 hrá rozhodujúcu prozápalovú úlohu pri myšom autoimunitnom diabete, kolitíde a encefalomyelitíde.{1}} Výskum experimentálnych modelov zistil patogénne úlohy OX40 pri autoimunitnej uveitíde, artritíde a alergickom zápale,12-1 zatiaľ čo nedávna správa navrhol cestu OX40/OX40L na ochranu pred crescentickou glomerulonefritídou stimuláciou proliferácie regulačných T-buniek. Obe molekuly však boli nezávisle spojené s patogenézou systémového lupus erythematosus (SLE). Rozpustný CD30 je marker aktivity ochorenia pri SLE16,17a a haplotyp OX40L je spojený so zvýšeným rizikom rozvoja ochorenia.8 Okrem toho bunky 17 (Th17) pomocných T buniek exprimujú zvýšené hladiny OX40 u pacientov so SLE a Expresia OX40 je detegovateľná na perivaskulárnych leukocytoch pri lupusovej nefritíde.

Účinné terapeutické možnosti liečby glomerulonefritídy sú spojené so zvýšenou morbiditou a vysokým rizikom nežiaducich účinkov1; preto je potrebná špecifickejšie cielená terapia. Rastúci prístup v zacielení imunitných odpovedí je indukcia tolerancie.] Terapeutické možnosti na dosiahnutie periférnej tolerancie zahŕňajú klonálnu deléciu, ignoranciu, imunitnú reguláciu a nakoniec energiu, ktorá sa už ukázala ako cenná imunosupresívna stratégia, keď cytotoxické T-lymfocyty- zaviedli sa asociované proteíny 4-lg fúzne proteíny.

Blokáda OX40L je v súčasnosti v štádiu klinického hodnotenia; avšak kombinované cielenie CD30 a OX40 nebolo doteraz komplexne skúmané. CD4-závislá autoimunita kriticky závisí od interakcie oboch párov receptor-ligand, čo dokazuje nevyhnutnosť kombinovaného zrušenia signalizácie CD30 a OX40 na ochranu myší s deficitom P3(FoxP3) s predčasným úmrtím. autoimunitné ochorenie. Nefrotoxická sérová nefritída (NTS) je myšací model imunokomplexnej glomerulonefritídy, o ktorej sa ukázalo, že je striktne závislá od T buniek, vrátane T pomocných buniek 1 (Th1) a Th17 buniek. Prezentácia antigénu v tomto modeli primárne prebieha v sekundárnych lymfoidných orgánoch, ale aj lokálne v rámciobličky. Predpokladali sme teda, že aktivácia kostimulačných dráh CD30 a OX40 pravdepodobne podporuje NTS.

METÓDY Zvieratá

Myši CD30OX407 s dvojitým knockoutom s deficitom CD30 a OX40 boli vytvorené tak, ako bolo opísané vyššie.' CD30OX40-a CD30OX40 plus /kontroly zo vrhu, ako aj CD30~a OX40~- boli vyšľachtené vo vlastnej réžii. CD30√-myši tiež poskytol Dr. alert, Freiburg, Nemecko. Myši C57BL/6J boli získané od Charles River Laboratories (Sulzfeld, Nemecko). Ragland B6.Thyl.1 myši boli získané od Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Všetky myši boli na pozadí C57BL/6J.

model NTS

NTS bol indukovaný tak, ako bolo opísané vyššie. Stručne povedané, myši boli sc preimunizované 2 mg/ml králičieho lgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) rozpusteným v neúplnom Freundovom adjuvans (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) s vysušeným, neživým Mycobacterium tuberculosis H37a (Difco Laboratories, Difco Laboratories Detroit, MI) 3 dni pred podaním nefrotoxického králičieho anti-myšieho séra. Vyhodnotenie sa uskutočnilo po 4 alebo 14 dňoch po injekcii NTS séra, ako je uvedené.

Prenos buniek v Rag{0}}/myši

Rag1-myšiam boli injikované 1,5x10° CD4 plus T bunky zo slezín myší divokého typu (WT) alebo CD30OX{7}} alebo CD90.1 WT buniek a CD90.2 knockoutované bunky boli adoptívne prenesené v pomere 1:1. Jeden deň po adoptívnom prenose bol NTS indukovaný a vyhodnotený po 4 alebo 14 dňoch. CD4 plus T bunky boli izolované zo sleziny s použitím súpravy na izoláciu myších CD4 plus buniek (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Nemecko).

Experimenty s blokovaním protilátok

Nefritické myši C57BL/6 boli liečené blokovacími protilátkami proti myšiemu OX40L(klon RM134L) a CD30L(klon RM153) buď v kombinácii, alebo samostatne počnúc dňom imunizácie alebo 3 dni po NTSindukcia. Myšiam sa ip injikovalo buď 0,5 mg x-OX40L a/alebo 0,5 mg a-CD30L monoklonálnych protilátok alebo 1 mg kontrolného IgG (Sigma-Aldrich) 3-krát týždenne.

Meranie albumínu, kreatinínu a supernatantu v moči

Na stanovenie vylučovania albumínu močom sa použil dvojitý sendvičový enzýmový imunosorbentový test (Abcam, Cambridge, MA), ako už bolo uvedené (rozsah detekcie, 0.781-200 ng/ml). Kreatinín v moči sa hodnotil fotometricky s použitím komerčne dostupnej súpravy na báze kyseliny pikrovej (Sigma-Aldrich). Detekcia cytokínov v supernatantoch sa uskutočnila tak, ako je uvedené v doplnkových metódach.

Hodnotenie autológnej protilátkovej odpovede

Doštičky sa inkubovali cez noc so 100 ug/ml králičieho IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Potom sa sérum inkubovalo v sériovo dvojnásobných riedeniach na detekciu cirkulujúcich myších anti-králičích Ig. Pomocou kozieho anti-myšieho IgG konjugovaného s chrenovou peroxidázou (Jackson ImmunoResearch Laboratories) sa detegoval myší anti-králičí IgG.

Dusík močoviny v krvi

Dusík močoviny v krvi

Hladiny (BUN) v sére sa získali pomocou komerčne dostupnej kolorimetrickej detekčnej súpravy BUN (Invitrogen).

Hodnotenie histopatológie a imunopatológie

Vyhodnotenie zafarbenia kyselinou jodistou - Schiff (PAS).obličkysekcie sa uskutočnili tak, ako je opísané vyššie1, 2 a v doplnkových metódach.

Na hodnotenie buniek infiltrujúcich tkanivo (doplnkové metódy) sa použila technika 3-vrstveného imunoperoxidázového farbenia.

Imunofluorescencia a konfokálna mikroskopia

Vzorky zmrazeného tkaniva boli zafarbené fluorescenčne značenými protilátkami (doplnkové metódy) a vyhodnotené na LSM510 meta (Zeiss, Oberkochen, Nemecko).

Obrázok 1| CD30, OX40, CD30 ligand (CD30L) a OX40 ligand (OX40L) sú rozdielne exprimované na leukocytoch sleziny pri nefrotoxickej sérovej nefritíde (NTS). Expresia CD30, OX40, CD30L a OX40L na CD4 plus T bunkách u zdravých a nefritických myší C57Bl/6J po 12 hodinách. 24 hodinách, 72 hodinách, 7 dňoch a 14 dňoch NTS (n =5 myší/ Expresia príslušných receptorov a ligandov sa hodnotila na (a) CD4 plus T bunkách, (b) CD8T bunkách, (c) B bunkách, (d) CD11cdendritických bunkách, (e) CD11bLv6G plus SSChi neutrofiloch, (f）CD11btLy6GCD115 plus Ly6C plus klasické monocyty a (g) CD11btLy6G-CD115 plus Ly6C neklasické monocyty. Všetky údaje ukazujú medián a interkvartilové rozsahy. Štatistické významy sú uvedené v porovnaní so zdravými myšami.*P<><><0.001,><>

Prietoková cytometria

Lýza červených krviniek s použitím 1 x RBC Lysis Buffer Solution (eBioscience) sa uskutočnila so vzorkami krvi predtým, ako sa z krvi, sleziny a lymfatických uzlín získala suspenzia jednotlivých buniek pomocou 70- um bunkových sitiek. Bunková izolácia zobličkysa uskutočňovalo použitím centrifugácie v hustotnom gradiente Percoll po štiepení jemne mletého mäsaobličkyv médiu Roswell Park Memorial Institute 1640 (Thermo Fisher Scientific) doplnenom kolagenázou D a DNAázou I pri 37 stupňoch, ako bolo opísané vyššie.

Farbenia a hodnotenia prietokovou cytometriou sa uskutočňovali tak, ako je opísané v doplnkových metódach.

Test proliferácie CD4 plus T-buniek

CD4 plus T bunky sa inkubovali s Celltrace Violet (CellTrace Violet Cell Proliferation Kit; Invitrogen) podľa protokolu výrobcu a naočkovali v 2,5 x 10/ml na inkubáciu buď s 5 ug/ml konkanavalínu-A (Sigma-Aldrich) alebo 5 ug/ml fytohemaglutinínu (Sigma-Aldrich). Po 7 dňoch sa použila prietoková cytometria na vyhodnotenie intenzity Celltrace Violet v týchto bunkách.

Stimulácia splenocytov

Splenocyty z nefritických myší liečených izotypovou protilátkou alebo protilátkami xCD30LxOX40L sa zozbierali po 14 dňoch NTS. Splenocyty sa naočkovali v koncentrácii 2 x 10 percent/ml do jamiek vopred potiahnutých králičím IgG a restimulovali sa 24 hodín pred prietokovou cytometriou. Splenocyty z nefritických myší WT a CD30OX40~ (14. deň) sa vysiali v množstve 2 x 1097 ml a stimulovali sa xCD3 (5 ug/ml) a xCD28 (1 ug/ml) (obe od eBioscience) počas 3 dní pred hodnotením supernatantu bunkovej kultúry .

Experimenty s polarizáciou CD4 plus T-buniek

CD4 plus CD62L plus T bunky boli izolované zo sleziny pomocou CD4 plus CD62L plus izolačnej súpravy II (Miltenyi Biotec) a stimulované, ako je uvedené v doplnkových metódach.

Reverzná transkripcia polymerázová reťazová reakcia v reálnom čase Celková RNA bola extrahovaná z lymfatických uzlín aobličkys použitím TRI Reagent (Sigma-Aldrich) a následne sa cDNA syntetizovala pomocou Superscript II Transscription Kit (Invitrogen) a náhodných primerov (Invitrogen) na reverznú transkripciu 2 ug celkovej RNA. Polymerázová reťazová reakcia v reálnom čase sa uskutočnila duplicitne na systéme CFX96 Real-Time System (BioRad, Hercules, CA). gén TaqMan

Obrázok 2| Myši CD30OX40- sú chránené pred nefrotoxickou sérovou nefritídou (NTS). CD30OX40-/-myši, CD30 single knockout myši a OX40 single knockout myši, ako aj divoké (WT), kontroly (n =5-6 myší na skupinu) boli vystavené 14-dňovým NTS (a) Hodnotili sa albuminúria a (b) hladiny močovinového dusíka v sére (BUN). (ce) Reprezentatívne zafarbenie kyselinou jodistou - Schiff (PAS).obličky, ako aj skóre PAS, (f) skóre polmesiaca, (g) skóre intralaminárneho trombu, (h) tvorba tubulárneho odliatku a (i) skóre akútneho tubulárneho poškodenia. () Poskytujú sa obličkové infiltrujúce CD68 plus T bunky, (k) neutrofily, () CD4T bunky a (m) CD8 plus T bunky. Celkové počty buniek a počty CD45 plus CD4 T buniek v (n) lymfatických uzlinách a (o) slezine myší WT a CD30OX40-/- boli hodnotené prietokovou cytometriou. (p) Celkový počet renálnych leukocytov hodnotených prietokovou cytometriou a (g) percentá CD4 plus T buniek, CD8 plus T buniek, Ly6G plus SSChi neutrofilov, Ly6C plus monocytov a Ly6C monocytov vobličkyCD30OX40 a W myší. (r) Bol hodnotený myší anti-králičí IgG (n=10 myší/skupina). (s) Sú uvedené celkové počty CD4 plus CD28 plus buniek/lymfatických uzlín nefritických myší WT (n=7 myší) a CD30OX40-/ (n =5 myší) myší. Pôvodné zväčšenie × 40. Údaje ukazujú (a,b,r,s) priemer ± SEM; (c,fg) mediány sú označené vodorovnou čiarou. Údaje sú reprezentatívne pre 4 nezávislé experimenty. Uvádzajú sa štatistické významnosti v porovnaní s myšami WT.*P<><0.01,><0.001,and>< 0.0001.hpf,="" high-power="" field;="" od,="" optical="" density.="" to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">

boli použité expresné testy (Applied Biosystems, Foster City, CA) a SYBR green (BioRad) (doplnkové metódy).

Štatistická analýza

Všetky štatistické vyhodnotenia (doplnkové metódy) boli vykonané pomocou GraphPad Prism 6.0 pre Macintosh (GraphPad Software, La Jolla, CA).

Etické vyhlásenie

Všetky pokusy na zvieratách boli schválené Výborom pre etiku pokusov na zvieratách rakúskeho ministerstva (BMWFW-66.010/0054-WF/V/3b/2015).

VÝSLEDKY

Expresia CD30 a OX40 a ich ligandov sa mení v priebehu času NTS na bunkách s vrodenou a adaptívnou imunitou Expresia CD30 a OX40 sa v priebehu času NTS zvýšila na slezinných CD4 plus T bunkách (obrázok la). Hladiny expresie CD30L aj OX40L boli významne zvýšené na slezinných CD4 plus T bunkách nefritických myší po 7 a 14 dňoch (obrázok la). Na CD4 * CD25Foxp3 plus regulačných T bunkách (Tregs) sa v priebehu času zistilo podobné zvýšenie expresie CD30, CD30L a OX40 (doplnkový obrázok S1A). CD30, OX40 a OX40L sa významne zvýšili na bunkách Th17 (doplnkový obrázok S1D) po 14 dňoch NTS v porovnaní so zdravými myšami. CD30 a OX40 boli tiež významne zvýšené na CD8 T bunkách počnúc 12 hodinami po indukcii NTS v porovnaní so zdravými myšami (obrázok 1b). B bunky vykazovali podobný profil expresie ako CD4 plus T bunky (obrázok 1c). OX40L bol downregulovaný už po 12 hodinách NTS a potom zostal znížený na dendritických bunkách (obrázok 1d). Podobne CD30L a OX40L boli down-CD11b plus Ly6G plus SSChineutrofily, regulované na Ly6G-CD115 plus Ly6Ct a Ly6G-CD115Ly6C monocyty v priebehu času NTS (obrázková časť). Na neutrofiloch, dendritických bunkách a monocytoch CD30 a OX40 mali tendenciu zvyšovať NTS (obrázok ld-g). CD30L sa vo zvýšenej miere exprimoval na vrodených lymfoidných bunkách typu 2 12 hodín po indukcii NTS a CD30L a OX40L sa tiež zvýšili po 14 dňoch NTS (doplnkový obrázok S1B). Počet leukocytov exprimujúcich CD30, CD30L, OX40 a OX40L sa zvýšil v NTS, čo bolo v súlade s nálezmi na bunkách sleziny (doplnkový obrázok SIE-G). Expresia mRNA Cd30 a Ox40l nebola detegovateľná vobličkypo 7 a 14 dňoch NTS (doplnkový obrázok S1H). Cd30l mRNA sa však zvýšila po 7 a 14 dňoch NTS, zatiaľ čo expresia Ox40 mRNA zostala nezmenená po 14 dňoch NTS vobličky(doplnkový obrázok S1H).

Na vývoj fenotypu NTS je potrebná vzájomná signalizácia CD30 a OX40

Zistili sme zníženú albuminúriu a BUN u nefritických myší CD30OX40-/v porovnaní s kontrolami WT (obrázok 2a a b), zatiaľ čo albuminúria u myší CD30- a OX40- bola porovnateľná s kontrolnými myšami WT (Obrázok 2a). Významný pokles bol tiež pozorovaný vobličkyPozitivita PAS, tvorba polmesiaca, skóre intraluminálnych trombov, tvorba tubulárneho odliatku a skóre akútneho tubulárneho poškodenia u myší CD30OX40-/ v porovnaní s myšami WT (obrázok 2c-i). Všetky tieto histologické znaky neboli významne zmenené u myší s jedným knockoutom v porovnaní s kontrolami WT (obrázok 2c a fi). Zistili sme výrazne nižšie počty makrofágov CD68 v obličkách myší CD30OX40-- v porovnaní s kontrolami WT (obrázok 2j). Bol tu trend k znižovaniu počtuobličky-infiltrácia CD68 plus makrofágov u CD30- a OX40-/- myší s jedným knockoutom (obrázok 2j). Neutrofily a CD8 T bunky sa našli vo výrazne zníženom počte vobličkyCD30OX40-myší v porovnaní s nefritickými WT kontrolami a CD30-- ako aj OX{3}} myši vykazovali nižší počet neutrofilov a C8 plus T buniek infiltrujúcich obličky (obrázok 2k a m). CD4 plus T bunky sa našli vo výrazne nižších počtoch u nefritických buniekobličkyCD30OX40--(obrázok 2l). Prietoková cytometria obličiek odhalila podobné výsledky zníženého počtu infiltrujúcich buniek (obrázok 2p a q). Je potrebné poznamenať, že naivné jednoduché a dvojité knockout myši nevykazovali žiadne rozdiely v zložení leukocytov v slezine v porovnaní so zdravými myšami WT, keď sa hodnotili CD4 plus a CD8 plus T bunky, neutrofily a monocyty (doplnkový obrázok S2). Výraz Icos a Gitr bol znížený vobličkynefritických CD30OX40- myší (doplnkový obrázok S3B). Reakcie B-buniek, merané pomocou myšieho anti-králičieho IgG, boli u CD30OX40- myší znížené v porovnaní s kontrolami WT (obrázok 2r).

Počet CD4 plus T-buniek nie je znížený v lymfatických uzlinách CD30OX40-/-myší

Prietoková cytometria neodhalila žiadny rozdiel v celkovej celularite lymfatických uzlín a sleziny (obrázok 2n a o) alebo v počtoch buniek CD4 plus. Je zaujímavé, že sme tiež nezistili žiadne rozdiely v Tregs medzi myšami WT a CD30OX40- (doplnkový obrázok S3). Za zmienku stoja cytokíny (TNF-d, interleukín-6, interferón-Y, interleukín-17, interleukín-4 a interleukín-10) merané v supernatantoch restimulovaných splenocytov izolovaných z Myši WT a CD30OX40-14 dní po NTS nevykazovali rozdiel (údaje nie sú uvedené).

CD4 plus T bunky s deficitom CD30 a OX40 nepodporujú NTS Na štúdium úlohy expresie CD30 a OX40 na CD4 plus bunkách v NTS boli Rag1- injikované CD4 plus bunkami (doplnkový obrázok S4) zo slezín oboch WT alebo CD30OX{10}}/myš. Celkové počty CD4 plus buniek v slezine a miery mŕtvych buniek boli porovnateľné v deň 4 po indukcii NTS (doplnkový obrázok S5). Hoci u myší Rag1~, ktoré dostávali bunky CD4 plus od myší WT, sa po 14 dňoch NTS vyvinula významná albuminúria a BUN, myši Rag{17}}/myši rekonštituované s bunkami CD4 plus z myší CD30OX40 (obrázok 3a) nie. Histologické poškodenie bolo významne znížené u myší Ragl{22}}, ktoré dostávali CD4 plus T bunky z myší CD30OX{25}} v porovnaní s bunkami WT, ako bolo určené skóre PAS, skóre polmesiaca, skóre intraluminálnych trombov, skóre akútneho tubulárneho poškodenia, a rúrkové odliatky (obrázok 3b-g). Bunky infiltrujúceobličkyPočet Ragl myší, vrátane CD4 plus buniek, CD68 makrofágov a Ly6G plus neutrofilov, sa tiež významne znížil, ak prenesené CD4 plus bunky neexprimovali CD30 a OX40 (obrázok 3h-k). CD4 plus T bunky izolované z WT myší exprimujúcich CD90 .1 a CD30OX{13}} myši exprimujúce CD90.2 boli ďalej adoptívne prenesené na Rag{16}}/myši v pomere 1:1. Absolútne počty CD90.2 exprimujúcich CD30OX40-- CD4 plus T buniek boli znížené v slezine v porovnaní s CD90.1 WT CD4 plus T bunkami (obrázok 4t a u), ale percentá Ifn-Y (obrázok 4a a b), 14 (obrázok 4d a e) a 1117 (obrázok 4g a h) produkujúce bunky boli významne vyššie v CD90.2 exprimujúcich knockout bunkách. Zároveň sa však zistilo, že znížené percentá knockoutovaných buniek CD90.2 majú fenotyp Th17 v obličkách v porovnaní s bunkami CD90.1 WT (obrázok 4i), zatiaľ čo opak sa zistil pre pomocné bunky T a T pomocné bunky 2 (Th2 ) bunky vobličky(Obrázok 4c a f). Napriek tomu absolútne počty prenesených CD90.2 knockout buniek vobličkyboli významne nižšie v porovnaní s CD90.1 WT bunkami (údaje nie sú uvedené).

Nedostatok CD30 a OX40 narúša migráciu Th17 zo sekundárnych lymfatických orgánov do obličiek

CXC chemokínový receptor (CXCR)3 (obrázok 4j ak) bol zvýšený na CD90.2 CD30OX40-/- bunkách v porovnaní s CD90.1 WT bunkami, zatiaľ čo pri expresii CXCR6 (obrázok 41 a m) sa nezistili žiadne rozdiely . Ešte dôležitejšie je, že sme zistili významný pokles CC chemokínového receptora (CCR)6 na CD90.2 knockout bunkách (obrázok 4n a o). V ďalšom kroku boli naivné CD4 plus T bunky stimulované in vitro za podmienok diferenciácie Th1 alebo Th17 ( Doplnkový obrázok S6). Pozorovali sme trend smerom k väčšiemu potenciálu diferenciácie Th17 (obrázok 5a) a Th1 (obrázok 5c a d) naivných CD4 plus T buniek izolovaných z CD30OX40-/- myší v porovnaní s myšami WT in vitro. Zistilo sa, že CD4 plus T bunky exprimujúce CD28 sa významne zvýšili

Obrázok 3| Rag1-/myši dostávajúce CD4 plus T bunky z CD30OX40-/sú chránené pred nefrotoxickou sérovou nefritídou (NTS). ) alebo CD30OX40-myši boli podrobené NTS a sledované počas 14 dní (n =6 až 7 myší na skupinu).(a) Hodnotili sa albuminúria a hladiny močovinového dusíka v sére (BUN).( e) Reprezentatívne zafarbenie kyselinou jodistou - Schiff (PAS).obličkyako aj (b) skóre PAS, (C) skóre polmesiaca, (d) skóre trombov, (t) tubulárne odliatky a (g) skóre akútneho tubulárneho poškodenia. (h) Počty CD4T buniek (i)CD68 plus makrofágy a (j)Ly6Gt neutrofily, ako aj (k) reprezentatívne obrázky. Pôvodné zväčšenie × 40 (PAS, CD4, [pokračovanie] čísla v lymfatických uzlinách nefritických myší CD30OX40-/ v porovnaní s myšami WT (obrázok 2s).

Pls kliknite sem pre časť 2