Časť 1: Fenyletanoidové glykozidy Cistanche Tubulosa indukujú apoptózu buniek hepatocelulárneho karcinómu a zvyšujú protinádorový účinok
Mar 25, 2022
Kontakt: ali.ma@wecistanche.com
Pengfei Yuan, BSc1, Changshuang Fu, MSc1, Yi Yang, PhD1, Aipire Adila, PhD1, Fangfang Zhou, MSc1, Xianxian Wei, MSc1, Weilan Wang, PhD1, Jie Lv, PhD1, Yijie Li, PhD1, Lijie Xia, PhD1, PhD1 a Jinyao Li, PhD1
Abstraktné
Cistanche tubulosa je typ čínskej bylinnej medicíny a vykonáva rôzne biologické funkcie. Predchádzajúce štúdie to dokázaliCystanche tubulosa fenyletanoidové glykozidy(CTPG) vykazujú protinádorové účinky na rôzne nádorové bunky. Protinádorové účinky CTPG na bunky HepG2 a BEL-7404 hepatocelulárneho karcinómu (HCC) sú však stále nepolapiteľné. Naša štúdia ukázala, že CTPG významne inhiboval rast buniek HepG2 a BEL-7404 prostredníctvom indukcie zastavenia bunkového cyklu a apoptózy, ktorá bola spojená s aktiváciou dráh MAPK charakterizovaných up-regulovanou fosforyláciou p38, JNK, a ERK1/2 a mitochondriálne závislá dráha charakterizovaná znížením mitochondriálneho membránového potenciálu. Uvoľňovanie cytochrómu c a štiepenie kaspázy-3, -7, -9 a PARP sa následne zvýšilo liečbou CTPG. Okrem toho CTPG významne potlačil migráciu HepG2 znížením hladín matricovej metaloproteinázy-2 a vaskulárnych endotelových rastových faktorov. Je zaujímavé, že CTPG nielen zvýšilo proliferáciu splenocytov, ale tiež znížilo apoptózu splenocytov indukovanú cisplatinou. V myšom modeli nádoru H22 CTPG v kombinácii s cisplatinou ďalej inhiboval rast buniek H22 a znížil vedľajšie účinky cisplatiny. Celkovo možno povedať, že CTPG inhiboval rast HCC prostredníctvom priameho protinádorového účinku a nepriameho imunoposilňujúceho účinku a zlepšil protinádorovú účinnosť cisplatiny.
Kľúčové slováCistanche tubulosa fenyletanoidové glykozidy, apoptóza, dráha MAPK, dráha závislá od mitochondrií, cisplatina, posilnenie imunity
Cistanche má protinádorový účinok.
Kliknite na produkty Cistanche a Cistanches
Úvod
Predpokladalo sa, že rakovina pečene bude šiestou najčastejšie diagnostikovanou rakovinou a štvrtou najčastejšou príčinou úmrtí na rakovinu na celom svete v roku 2018, s približne 841 000 novými prípadmi a 782 000 úmrtiami ročne v juhovýchodnej Ázii (Mongolsko, Kambodža a Vietnam) .1 V Číne bola rakovina pečene v roku 2015 treťou najčastejšou príčinou úmrtí súvisiacich s rakovinou.2 Viac ako 90 percent primárnych rakovín pečene predstavuje hepatocelulárny karcinóm (HCC) na celom svete. V súčasnosti sú hlavnými metódami liečby HCC hepatektómia, transplantácia pečene a perkutánna ablácia. Bohužiaľ, tieto liečby sú účinné u 30 percent pacientov s diagnostikovanou včasnou rakovinou pečene, zatiaľ čo pacienti s diagnostikovanou pokročilou rakovinou pečene (čo predstavuje 40 percent) sa musia spoliehať na paliatívnu liečbu, aby predĺžili dobu ich prežitia.3,4 Sorafenib v kombinácii s pečeňou arteriálny chemoembolizmus je dôležitou a bežnou paliatívnou terapiou pre väčšinu pacientov s pokročilým HCC v ázijsko-pacifickej oblasti.5 Sorafenib, schválený FDA v roku 2006 na liečbu pokročilého karcinómu pečene, je inhibítor mnohopočetnej kinázy, ktorý inhibuje proliferáciu nádorových buniek a vaskulárne produkciu a podporuje apoptózu nádorových buniek. Sorafenib významne predlžuje dobu prežívania pacienta o 3 až 5 mesiacov, ale má závažné vedľajšie účinky a úzko súvisí s výskytom rezistencie na lieky.6 Preto je naliehavé vyvinúť nové lieky alebo stratégie pre HCC.
Tradičná čínska medicína (TCM) samotná alebo v kombinácii s inými stratégiami sa používa na liečbu HCC a preukázala klinické výhody vrátane predĺženia doby prežitia, zlepšenia kvality života, zníženia nežiaducich reakcií atď.7,8Cistancheje TČM obsahujúci fenyletanoidové glykozidy (PhG), iridoidy, lignín a polysacharidy, ktorý má rôzne biologické funkcie, ako sú antioxidačné, protizápalové, proti starnutiu, funkcie na zlepšenie pamäte a posilnenie imunity.9 PhGs boli považované za hlavné aktívne zložky Cistanche a majú viacero funkcií vrátane antioxidácie, protizápalu, antiapoptózy, hepatoprotekcie a neuroprotekcie.10-12 Naša skupina uviedla, žeCistanchetubulosa fenyletanoidové glykozidy(CTPG) by mohol inhibovať rast buniek melanómu B16-F10, buniek Eca{2}} karcinómu pažeráka a buniek HCC H22 prostredníctvom vonkajších alebo vnútorných signálnych dráh in vitro alebo in vivo; CTPG mal navyše imunostimulačný účinok.13-15
V tejto štúdii sme skúmali protinádorový účinok a mechanizmus CTPG na HepG2 a BEL{1}} bunky in vitro, analyzovali imunomodulačnú funkciu CTPG in vitro a in vivo a ďalej hodnotili terapeutický účinok CTPG v kombinácii s chemoterapiou liečivo cisplatina na myšiach s nádorom HCC H22 in vivo. Zistili sme, že CTPG môže inhibovať rast buniek HepG2 a BEL-7404 prostredníctvom apoptózy závislej od mitochondrií a signálnej dráhy MAPK. CTPG významne inhiboval migráciu buniek HepG2 znížením hladín matricovej metaloproteinázy-2 (MMP-2) a vaskulárneho endotelového rastového faktora (VEGF). Okrem toho CTPG podporovalo proliferáciu a aktiváciu imunitných buniek a posilňovalo imunitu myší. Dôležité je, že CTPG v kombinácii s cisplatinou môže ďalej inhibovať rast buniek H22 in vivo a znížiť vedľajšie účinky cisplatiny.
Cistanche zvyšuje imunitu.
Materiály a metódy
Zvieratá
Asi 6 až 8 týždňov staré samce myší BALB/c, Kunming a samice myší C57BL/6 boli zakúpené od Animal Laboratory Center, Xinjiang Medical University (Urumqi, Xinjiang, Čína) a umiestnené v zariadení pre zvieratá na univerzite Xinjiang s izbovou teplotou. (RT) 25±3 stupňov a 12/12 hodín svetlo-tma.
Bunkové línie a bunková kultúra
Myšie bunky H22 boli zakúpené od Procell Life Science & Technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, Čína) a ľudské bunky HCC HepG2 a BEL-7404 boli získané z Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering, Univerzita Xinjiang (Urumqi, Xinjiang, Čína) a kultivovaná v médiu RPMI 1640 (Gibco, USA) alebo Dulbeccovom modifikovanom Eagleovom médiu (DMEM) (Gibco) obsahujúcom 10 percent tepelne inaktivovaného fetálneho hovädzieho séra (MRC, Čína), 1 percento L- glutamín (100 mM), 100 U/ml penicilínu a 100 ug/ml streptomycínu pri 37 stupňoch vo vlhkej atmosfére s 5 percentami CO2.
Vysokovýkonná kvapalinová chromatografia (HPLC)
Hlavné zlúčeniny CTPG (Upbio Tech Co., Ltd., Shanghai, Čína) boli kvalifikované a kvantifikované pomocou HPLC, ako už bolo uvedené.13 Použila sa kolóna ZORBAX SB-C18 (250×4,6 mm; 5μm). a mobilná fáza pozostávala z 0,2 % roztoku kyseliny mravčej a metanolu s gradientom od 23 % do 31 % . Celkovo sa vstreklo 10 μl vzorky a detegovalo sa pri 330 nm. Na analýzu zložiek CTPG sa použili echinakozidové a akteozidové štandardy (Yuanye, Shanghai, Čína).
echinakozid
Analýza životaschopnosti buniek
Protinádorové účinky CTPG na bunky HepG2 a BEL-7404 boli hodnotené pomocou MTT (3-(4, 5-dimetyl-2-tiazolyl)-2, {{7 }}difenyl-2-H-tetrazólium bromid). Bunky HepG2 a BEL-7404 boli nanesené na 96-jamkové platne (5 × 104 bunky/jamku) a ošetrené 0, 200, 400 a 600 ug/ml CTPG počas 24 a 48 hodín, v danom poradí, po 24 hodinách inkubácie pri 37 stupňoch. Asi 35 ug/ml cisplatiny (Yuanye) sa použilo ako pozitívna kontrola. Potom sa do každej jamky pridalo 100 ul MTT (0,5 mg/ml, zriedené médiom bez média FBS) a kultivovalo sa 3 hodiny pri 37 stupňoch a 5 percentách CO2. Po inkubácii sa platne centrifugovali pri 1200 otáčkach za minútu počas 7 minút, médium sa odstránilo a do každej jamky sa pridalo 200 ug/ml DMSO, aby sa rozpustili vytvorené kryštály formazanu. Hodnoty OD490 sa merali pomocou 96-jamkovej čítačky mikrodoštičiek (Bio-Rad Laboratories, CA, USA). Na vyhodnotenie účinkov CTPG na splenocyty sa bunky izolovali z myší C57BL/6 a naniesli sa na 96-jamkové platne v hustote 1 x 105 buniek/jamku. Splenocyty boli ošetrené 0, 200, 400 a 600 ug/ml počas 24, 48 a 72 hodín, v danom poradí. Životaschopnosť buniek sa vypočítala podľa nasledujúceho vzorca: Životaschopnosť buniek (percentá)=(OD ošetrené/ODneošetrené) × 100 percent.
Detekcia Ki-67
Detekcia Ki{{0}} sa uskutočnila podľa našej predchádzajúcej štúdie.16 Stručne povedané, bunky BEL{2}} boli ošetrené rôznymi koncentráciami (0, 200, 400 a 600 ug/ml) CTPG alebo cisplatina (35 ug/ml). Po 24 hodinách boli bunky zozbierané a premyté PBS, potom fixované a permeabilizované pomocou Foxp3 Stained Buffer Set (eBioscience, USA) podľa pokynov výrobcu. Intracelulárne farbenie sa uskutočnilo s použitím FITC konjugovanej Ki{10}} protilátky (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) počas 15 minút pri teplote miestnosti. Vzorky sa analyzovali prietokovou cytometriou (BD FACSCalibur, CA, USA).
Analýza bunkovej apoptózy a bunkového cyklu
Bunky HepG2 a BEL{1}} boli nasadené v hustote 2,5 x 105 buniek/misku a inkubované pri 37 stupňoch cez noc. Bunky boli trypsinizované a zozbierané centrifugáciou po ošetrení rôznymi koncentráciami CTPG alebo vopred ošetrené inhibítorom kaspázy (Z-VAD-FMK) alebo inhibítorom kaspázy -3 (Ac-DEVD-CHO) (Beyotime, Čína) 2 hodiny pred CTPG ošetrenie. Po 24 hodinách bola prietokovou cytometriou detegovaná apoptóza. Stručne povedané, zozbierané bunky sa premyli studeným PBS (Gibco) a resuspendovali sa v pufri viažucom anexín s 2,5 μl Annexin V-FITC a 5 μl PI-PE farbiaceho roztoku (Solarbio, Peking, Čína) a potom sa bunky inkubovali pri teplote miestnosti. v tme 15 minút. Na analýzu distribúcie bunkového cyklu sa bunky zozbierali po ošetrení CTPG a fixovali sa v studenom 70 percentnom etanole pri 4 stupňoch počas 30 minút. Bunky sa farbili s PI (BD Biosciences) v tme počas 30 minút. Vzorky sa analyzovali prietokovým cytometrom (BD FACSCalibur). Hladiny expresie bunkovej apoptózy a proteínov súvisiacich s cyklom sa detegovali pomocou Western blotu.
Western Blot
Western blot sa uskutočnil podľa našej predchádzajúcej štúdie. 17HCC boli ošetrené CTPG počas 24 hodín. Po dvojnásobnom premytí ľadovo studeným PBS boli všetky adherentné a plávajúce bunky zhromaždené a lyzované v RIPA Lysis Buffer (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd) počas 20 minút na ľade. Po centrifugácii pri 12 000 ot./min. 4 stupne počas 10 minút sa stanovila koncentrácia proteínu pomocou súpravy Bicinchoninic Acid Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, USA) podľa pokynov výrobcu. Rovnaká koncentrácia proteínov bola oddelená pomocou 12 percent SDS-PAGE a prenesená na PVDF membrány. Po premytí pufrom PBST (PBS s 0,05 percentami Tween-20) sa membrány blokovali 5 percentným odtučneným mliekom pri 37 stupňoch počas 1 hodiny a potom sa inkubovali s primárnymi protilátkami (Cell Signaling Technology, MA, USA) pri správnom riedení cez noc pri 4 stupňoch. Po trojnásobnom premytí PBST sa membrána inkubovala so zodpovedajúcimi sekundárnymi protilátkami konjugovanými s HRP (eBioscience) počas 2 hodín pri 37 °C. Cieľové proteíny sa detegovali pomocou testovacej súpravy ECL (Beyotime). Údaje zo skenovania v odtieňoch sivej boli získané pomocou Image J.
Analýza potenciálu mitochondriálnej membrány (Δψm)
Δψm bol stanovený membránovo permeabilným JC-1 farbivom (Beyotime). Stručne povedané, bunky HepG2 a BEL-7404 boli ošetrené rôznymi koncentráciami CTPG (0, 200, 400 a 600 ug/ml) počas 24 hodín. Všetky bunky sa zhromaždili a premyli premývacím pufrom JC-1. Bunky sa farbili fluorescenčnou sondou JC{10}} podľa pokynov výrobcu počas 20 minút pri teplote miestnosti. Po dvojnásobnom premytí PBS sa všetky vzorky analyzovali prietokovou cytometriou (BD FACSCalibur).
Farbenie Hoechst 33342
Farbenie Hoechst 33342 sa uskutočnilo podľa našej predchádzajúcej štúdie.16 Morfologické zmeny jadier sa skúmali pomocou membránovo priepustného farbiva viažuceho DNA Hoechst 33342 (Beyotime). V stručnosti, bunky sa naočkovali na 6-jamkovú doštičku v koncentrácii 1 x 105 buniek/jamku v 2 ml média. Keď sa dosiahla 70 až 80-percentná konfluencia, bunky sa ošetrili s 200, 400 a 600 ug/ml CTPG alebo cisplatiny počas 24 hodín. Bunky boli premyté PBS a fixované 4 percentami ľadovo chladného paraformaldehydu pri 4 stupňoch počas 10 minút. Po premytí PBS sa bunky farbili s Hoechst 33342 pri 4 stupňoch počas 10 minút. Vzorky boli pozorované fluorescenčným inverzným mikroskopom (Nikon Eclipse Ti-E, Japonsko).
extrakt z cistanche
Migračný test
Migrácia buniek HCC bola detegovaná prostredníctvom testu hojenia rán. Stručne povedané, bunky HepG2 (2x104/jamka) sa naočkovali na 24-jamkovú doštičku. Po dosiahnutí 80 percent konfluencie sa stred každej jamky raz poškrabal špičkou 20 μl pipety. Po premytí PBS boli bunky ošetrené cisplatinou (35 ug/ml) alebo rôznymi koncentráciami (0, 200, 400 a 600 ug/ml) CTPG pri 37 °C. Po 24 hodinách sa snímky každej vzorky urobili pod mikroskopom (Nikon Eclipse Ti-E). Priemerné vzdialenosti bunkovej migrácie sa analyzovali pomocou obrázku J. Percento hojenia rán sa vypočítalo podľa rovnice: hojenie rán ( percentá )=(1 – oblasť poškriabania v uvedenom časovom bode/plocha poškriabania po 0 hodinách) × 100 percent . Úrovne expresie proteínov MMP-2 a VEGF súvisiacich s bunkovou migráciou sa detegovali pomocou Western blotu.
Proliferácia a apoptóza splenocytov
Na analýzu proliferácie boli splenocyty izolované z 3 myší C57BL/6 a zafarbené pomocou CFSE (eBioscience). Bunky označené CFSE boli naočkované do 24-jamkových platní v hustote 2 x 106 buniek v 1 ml média na jamku a ošetrené rôznymi koncentráciami CTPG (200, 400 a 600 ug/ml) alebo kombinované s 35 ug /ml cisplatiny počas 72 hodín. Analýza prietokovou cytometriou sa uskutočnila po farbení pomocou CD3-APC a CD19-PE (BD Biosciences). Na analýzu apoptózy sa splenocyty naočkovali do 24-jamkových doštičiek v hustote 2 x 106 buniek v 1 ml média na jamku a ošetrili sa rôznymi koncentráciami CTPG (200, 400 a 600 ug/ml) alebo sa kombinovali s cisplatiny počas 24 hodín. Analýza prietokovou cytometriou sa uskutočnila po zafarbení 2,5 ul Annexin V-FITC a 5 ul PI-PE roztoku.
Hodnotenie bezpečnosti a imunostimulačné aktivity CTPG in vivo
Na vyhodnotenie in vivo imunostimulačných aktivít CTPG sa samce myší Kunming vo veku 6 až 8 týždňov náhodne rozdelili do 7 skupín (5 myší/skupina). Subkutánna injekcia (sc, 200, 400 mg/kg), intraperitoneálna injekcia (ip, 200, 400 mg/kg) a intragastrické podanie (ig, 200, 400 mg/kg) sa aplikovali každé 2 dni, celkovo 7-krát , zatiaľ čo kontrolná skupina nedostala žiadnu liečbu. Myši sa vážili každý druhý deň a stav myší sa pozoroval každý deň. Po ošetrení CTPG boli orgány myší oddelené a zvážené. Orgánové indexy sa vypočítali podľa vzorca: orgánový index=hmotnosť orgánu (mg)/telesná hmotnosť (g). Splenocyty boli odobraté, spočítané a zafarbené anti-CD3-APC, anti-CD19-PE, anti-CD49b FITC alebo anti-CD4-APC, anti-CD{{ 22}}PE, anti-CD8-FITC (BD Biosciences). Vzorky sa detegovali prietokovou cytometriou (BD FACSCalibur).
Protinádorová účinnosť CTPG v kombinácii s cisplatinou u myší nesúcich nádor H22 Asi 6 až 8 týždňov starým samcom BALB/c myší boli subkutánne injikované bunky H22 (1.0 x 106 na myš v 100 ul PBS). Keď objemy nádoru dosiahli približne 60 mm3, myši s nádorom boli náhodne rozdelené do 4 skupín (6 myší/skupina) a liečené cisplatinou (4 mg/kg), CTPG (400 mg/kg), cisplatinou (4 mg/kg) plus CTPG ( 400 mg/kg), alebo bez liečby (kontrolná skupina). Nádorové myši dostali intraperitoneálnu injekciu CTPG na 5., 7., 9., 11. a 13. deň, v danom poradí. Cisplatina bola intravenózne injikovaná na 7. a 11. deň. Objem nádoru a telesná hmotnosť sa merali každý druhý deň. Objem nádoru sa vypočítal nasledovne: Objem nádoru (V)=a × b2/2, v ktorom a a b predstavujú najdlhší a najkratší priemer nádoru meraný posuvným meradlom. Na 20. deň boli orgány a nádory izolované a zvážené. Splenocyty boli odobraté, spočítané a zafarbené anti-CD3-APC a anti-CD19-PE alebo anti-CD4-FITC a anti-CD8-APC alebo anti-CD11b-PE a anti-Gr-1-APC alebo anti-CD4-FITC, anti-CD25-APC a anti-Foxp3-}PE (BD Biosciences) . Následne boli frekvencie a počty buniek analyzované prietokovou cytometriou (BD FACSCalibur).
Cistanche zvyšuje protinádorový účinok a zlepšuje imunitu.
Pre viac informácií kliknite prosím na obrázok.
Štatistická analýza
Všetky údaje boli vyjadrené ako priemer ± štandardná chyba priemeru (SEM). Štatistická analýza sa uskutočnila pomocou jedno/obojsmernej analýzy rozptylu (ANOVA) pomocou softvéru Prism5.0. P<.05 was="" considered="" statistically="">
