Časť 1 Doxorubicín paradoxne zmierňuje zápaly vyvolané nádorom u mladých myší

Kontakt: ali.ma@wecistanche.com

Ibrahim Y. Abdelgawad a kol

Cistanche tubulosa zabraňuje ochoreniu obličiek, kliknutím sem získateprodukty a Cistanche herba

Abstrakt:

doxorubicín(DOX) je jedným z najpoužívanejších chemoterapeutík v detskej onkológii. DOX vyvoláva zápalovú reakciu vo viacerých orgánoch, čo prispieva k nežiaducim účinkom vyvolaným DOX. Samotná rakovina spôsobuje zápal, ktorý vedie k viacerým patologickým stavom. Súčasná štúdia skúmala zápalovú odpoveď na DOX anádorovpomocou EL4-lymfómu, imunokompetentného modelu juvenilných myší. Štvortýždňovým samcom myší C57BL/6N boli subkutánne podané bunky lymfómu EL4 (5 x 104 buniek/myš) do oblasti boku, zatiaľ čonádormyšiam bez injekcie bolo podané vehikulum. Tri dni po implantácii nádoru sa myšiam bez nádoru aj myšiam nesúcim nádor intraperitoneálne injikoval buď DOX (4 mg/kg/týždeň) alebo fyziologický roztok počas 3 týždňov. Týždeň po poslednej injekcii DOX boli myši usmrtené a srdce, pečeň,obličkya odobrali sa sérum. Génová expresia a sérová koncentrácia zápalových markerov boli kvantifikované pomocou PCR v reálnom čase a ELISA. Liečba DOX výrazne potlačenánádorrast u myší s nádorom a spôsobil významnú srdcovú atrofiu u myší bez nádoru a myší s nádorom. Nádory EL4 vyvolali silnú zápalovú odpoveď v srdci, pečeni aobličky. Je prekvapujúce, že liečba DOX zlepšila zápal vyvolaný nádorom, ktorý je paradoxný pre účinok DOX u myší bez nádoru, čo demonštruje značne odlišný účinok liečby DOX u myší bez nádoru oproti myšiam s nádorom.

Kľúčové slová:doxorubicín; nádor; zápal

1. Úvod

Doxorubicín (DOX), tiež známy ako Adriamycín, je jedným z najpoužívanejších chemoterapeutických činidiel v pediatrickej klinickej onkológii. Napriek svojej účinnosti pri širokom spektre rakovín vrátane lymfómu, leukémie a iných detských rakovín je klinická využiteľnosť DOX obmedzená kvôli jeho toxicite na viaceré orgány. Okrem výraznej kardiotoxicity [1] sa preukázalo, že DOX spôsobuje nefrotoxicitu [2–5] a hepatotoxicitu [6]. Takmer 50 percent pediatrických pacientov s rakovinou dostáva DOX ako súčasť ich liečebného protokolu [7]. Vďaka účinnej liečbe rakoviny, vrátane DOX, sa 5-ročná miera prežitia detí s diagnostikovanou rakovinou zvýšila z menej ako 60 percent v 70. rokoch na viac ako 80 percent v súčasnosti [8,9]. To vedie k veľkej populácii pacientov, ktorí prežili rakovinu v detstve (CCS), odhaduje sa na približne 400,000. Bohužiaľ, CCS sú vystavené vysokému riziku vzniku dlhodobých nepriaznivých účinkov v dôsledku liečby rakoviny a/alebo rakoviny samotnej.

Ukázalo sa, že DOX spúšťa systémový zápal [10–12] a zápalovú odpoveď vo viacerých orgánoch vrátane srdca [13],obličky[14] a pečeň [15]. Ukázalo sa, že táto zápalová odpoveď podporuje nežiaduce účinky vyvolané DOX [16,17]. Väčšina týchto štúdií uvádzajúcich zápal vyvolaný DOX sa uskutočnila vnádor-bez zvieracích modelov, ktoré nenapodobňujú klinický scenár, v ktorom pediatrickí pacienti s rakovinou dostávajú liečbu DOX po diagnostikovaní rakoviny. Ukázalo sa tiež, že rakovina ako taká spôsobuje zápal, ktorý prispieva k viacerým patologickým stavom, ktoré môžu zhoršiť toxicitu vyvolanú DOX [18,19]. Preto existuje kritická potreba vytvoriť klinicky relevantné zvieracie modely na skúmanie mechanizmov toxicít viacerých orgánov vyvolaných DOX u mláďat,nádor-nosné myši, aby študovali súhru medzi liečbou DOX a samotnou rakovinou, aby spôsobili takúto toxicitu.

V súčasnej štúdii sme skúmali zápalovú odpoveď na DOX a nádor na klinicky relevantnom syngénnom EL4-lymfóme, imunokompetentnom modeli juvenilných myší. Tento model je dobre zavedený vo výskume rakoviny [20] a je klinicky relevantný pre pediatrických pacientov s rakovinou, pretože lymfóm je jedným z najbežnejších typov rakoviny u detí [21]. Použitie syngénnych myší je kritické pre štúdium zápalovej odpovede na DOX aj na nádor kvôli kritickej úlohe imunitného systému v patogenéze zápalu [22]. Vek myší po podaní DOX bol 5 týždňov, čo zodpovedá veku dospievania 10–12 rokov u ľudí [23]. Okrem toho sú podávané dávky DOX klinicky relevantné k dávkam, ktoré dostávajú pediatrickí pacienti s rakovinou [24]. Najprv sme určili účinky DOX na srdcovú funkciu u myší bez nádoru a myší s nádorom, pretože kardiotoxicita vyvolaná DOX sa považuje za klinicky najrelevantnejší nepriaznivý účinok DOX, okrem iných toxicít pre viaceré orgány. Potom sme stanovili účinok DOX, nádoru a ich kombinácie na niekoľko zápalových markerov v srdci, pečeni aobličkyokrem sérových markerov systémového zápalu. Zistili sme, že prítomnosť nádoru EL4 vyvolala silnú zápalovú reakciu vo viacerých orgánoch. Je prekvapujúce, že liečba DOX zlepšila zápal vyvolaný nádorom paradoxne k predtým uvádzanému účinku DOX u myší bez nádoru.

2. Výsledky

2.1. Účinky DOX na telesnú hmotnosť a rast nádoru

Súčasná štúdia bola založená na juvenilných myšiach, aby napodobnila klinický scenár u pediatrických pacientov s rakovinou, ako je opísané na obrázku 1A. Po expozícii DOX (4 mg/kg/týždeň počas 3 týždňov) nebola pozorovaná žiadna významná morbidita ani úmrtnosť ani u myší bez nádoru, ani u myší s nádorom, čo je v súlade s našou predchádzajúcou štúdiou s použitím rovnakej dávky [25]. Avšak expozícia mláďat DOX viedla k významne zníženému prírastku telesnej hmotnosti v porovnaní s myšami liečenými fyziologickým roztokom (obrázok 1B). Na posúdenie protirakovinového účinku DOX v tomto modeli lymfómu EL4 sme merali hmotnosti nádorov po pitve myší. Chronické podávanie DOX myšiam s nádorom významne inhibovalo rast nádoru EL4, čo dokazuje protirakovinový účinok tohto dávkovacieho režimu DOX (obrázok 1C).

2.2. Účinok podávania DOX na srdcovú funkciu a morfometriu u myší bez nádorov a myší nesúcich nádor

DOX spôsobil srdcovú atrofiu, čo dokazuje významný pokles hmotnosti srdca na dĺžku holennej kosti (HW/TL) (obrázok 1D). Je pozoruhodné, že srdcová atrofia spôsobená DOX bola rozšírená u myší s nádorom (obrázok 1D). Účinky DOX, nádoru a kombinácie oboch na srdcovú funkciu a morfológiu boli hodnotené pomocou transtorakálnej echokardiografie. Reprezentatívne snímky M-Mode z každej skupiny sú zobrazené na obrázku 2A. DOX ani nádor nespôsobili významné zmeny ejekčnej frakcie (obrázok 2B), srdcového výdaja (obrázok 2C), frakčného skrátenia (obrázok 2D), hmoty ľavej komory (LV) (obrázok 2E), hrúbky zadnej steny ľavej komory v diastole (LVPW' d) (obrázok 2F) alebo hrúbka zadnej steny ľavej komory v systole (LVPW's) (obrázok 2G).

2.3. Účinok podávania DOX na génovú expresiu zápalových markerov v srdci myší s nádorom a myší bez nádoru

Srdcia boli odobraté z juvenilných myší C57BL/6N bez nádoru a lymfómu EL4 s nádorom jeden týždeň po podaní 4 mg/kg/týždeň DOX alebo ekvivalentného objemu sterilného fyziologického roztoku počas 3 týždňov (n=8 na skupina). Po extrakcii celkovej RNA expresia srdcovej mRNA zápalových markerov interleukín-1 alfa (IL-1 ), interleukín-1 beta (IL-1 ), interleukín{{12} } (IL-6), tumor nekrotizujúci faktor alfa (TNF- ), zápalové chemokíny, monocytový chemoatraktant proteín-1 (Mcp-1) a chemokíny s motívom CX C (Cxcl1, Cxcl9 a Cxcl10) boli stanovené pomocou PCR v reálnom čase. Génová expresia viacerých zápalových markerov v srdci bola významne zvýšená u myší s nádorom v porovnaní s myšami bez nádoru, vrátane prozápalových cytokínov IL-1 (obrázok 3A), IL-1 ( Obrázok 3B), IL-6 (obrázok 3C) a TNF- (obrázok 3D) a zápalové chemokíny Mcp-1 (obrázok 3E), Cxcl1 (obrázok 3F) a Cxcl10 (obrázok 3H). Zatiaľ čo podávanie DOX myšiam bez tumoru neviedlo k významným zmenám v expresii zápalových markerov v srdci, podávanie DOX významne zrušilo tumorom indukovanú upreguláciu IL-1 (obrázok 3B), Mcp{{44} } (obrázok 3E), Cxcl9 (obrázok 3G) a Cxcl10 (obrázok 3H). Dôležité je, že dvojcestná ANOVA preukázala významný interakčný účinok vo všetkých markeroch okrem Cxcl1, Cxcl9 a Cxcl10, čo demonštruje odlišné účinky, ktoré má DOX na srdcové zápalové markery u myší s nádorom v porovnaní s myšami bez nádoru.

2.4. Účinok podávania DOX na génovú expresiu zápalových markerov v pečeni myší bez nádorov a myší nesúcich nádor

Pečene boli odobraté z juvenilných myší C57BL/6N s nádorom bez nádoru a lymfómom EL4 jeden týždeň po podaní 4 mg/kg/týždeň DOX alebo ekvivalentného objemu sterilného fyziologického roztoku počas 3 týždňov (n=8 na skupina). Po extrakcii celkovej RNA došlo k expresii hepatálnej mRNA zápalových markerov IL-1, IL-1, IL-6, TNF-, Mcp-1, Cxcl1, Cxcl9 a Cxcl10 boli stanovené pomocou PCR v reálnom čase. Myši s nádorom mali významne zvýšenú pečeňovú expresiu prozápalových cytokínov IL-1 (obrázok 4A), IL-1 (obrázok 4B), TNF- (obrázok 4D), Cxcl9 (obrázok 4G), a Cxcl10 (obrázok 4H) v porovnaní s myšami bez nádoru. Aj keď je to menej pozoruhodné, dvojcestná ANOVA demonštruje významný účinok nádoru na pečeňovú génovú expresiu IL-6 (obrázok 4C). Dvojcestná ANOVA preukázala významný interakčný účinok medzi nádorom a DOX v Cxcl10 (obrázok 4H). Podávanie DOX znížilo nádorom indukovanú upreguláciu IL-1 a TNF- (obrázok 4B, D). Ani DOX, ani nádor nemali významný vplyv na pečeňovú expresiu zápalových chemokínov Mcp-1 a Cxcl1 (obrázok 4E, F).

2.5. Účinok podávania DOX na génovú expresiu zápalových markerov v obličkách myší bez nádorov a myší nesúcich nádor

Obličky boli odobraté z juvenilných myší C57BL/6N bez nádoru a lymfómu EL4 s nádorom jeden týždeň po podaní 4 mg/kg/týždeň DOX alebo ekvivalentného objemu sterilného fyziologického roztoku počas 3 týždňov (n=8 na skupina). Po extrakcii celkovej RNA sa renálna expresia mRNA zápalových markerov IL-1, IL-1, IL-6, TNF-, Mcp-1, Cxcl1, Cxcl9 a Cxcl10 boli stanovené pomocou PCR v reálnom čase. V súlade s pozorovanými zmenami v srdci a pečeni mali myši s nádorom významne zvýšenú renálnu expresiu prozápalových cytokínov IL-1 (obrázok 5A), IL{21}} (obrázok 5B), TNF- (obrázok 5D) a Mcp-1 (obrázok 5E) v porovnaní s myšami bez tumoru. Okrem toho dvojcestná ANOVA demonštruje významný účinok nádoru na renálnu génovú expresiu Cxcl1 (obrázok 5F), Cxcl9 (obrázok 5G) a Cxcl10 (obrázok 5H). Podávanie DOX myšiam s nádorom významne zlepšilo nádorom indukovanú upreguláciu IL-1 (obrázok 5B), IL-6 (obrázok 5C), TNF- (obrázok 5D) a Mcp{{43} } (obrázok 5E). V rámci týchto markerov dvojcestná ANOVA tiež preukázala významnú interakciu medzi DOX a nádorom, čo demonštruje rôzne účinky, ktoré má DOX na renálne zápalové markery u myší s nádorom v porovnaní s myšami bez nádoru.

2.6. Účinok podávania DOX na histopatologické znaky v srdci, pečeni a obličkách myší bez nádorov a myší nesúcich nádor

Srdcia, pečeň a obličky boli odobraté z jednej kohorty juvenilných myší C57BL/6N bez nádoru a lymfómu EL4 nesúcich nádor jeden týždeň po podaní 4 mg/kg/týždeň DOX alebo ekvivalentného objemu sterilného fyziologického roztoku počas 3 týždňov ( n=4 na skupinu). Histopatologické vyhodnotenie nepreukázalo žiadne veľké patologické zmeny v srdci (obrázok 6A). Len minimálna infiltrácia zápalových buniek, demonštrovaná ako zriedkavé ložiská minimálne bunkového zmiešaného (mononukleárneho a neutrofilného) zápalu, bola pozorovaná v pečeňových tkanivách odobratých z DOX-liečených myší s nádorom bez nádoru (tri zo štyroch myší), po ošetrení soľným roztokom s nádorom ( dve zo štyroch myší) a myši s nádorom liečené DOX (tri zo štyroch myší) (obrázok 6B). Histopatologické hodnotenie obličiek nepreukázalo žiadne veľké patologické zmeny vo všetkých skupinách okrem myší s nádorom liečených DOX (obrázok 6C), pričom dve zo štyroch myší v tejto skupine demonštrovali oblasti tubulárnej regenerácie v plnej hrúbke, fibrózy a miernej intersticiálnej zápal postihujúci približne 5 percent celkovej plochy tkaniva.

2.7. Divergentné účinky DOX na sérové ​​zápalové cytokíny u myší bez nádorov a myší s nádormi

Už sme predtým uviedli, že akútne podanie DOX vyvolalo systémovú zápalovú odpoveď u dospelých myší C57BL/6N [11]. V tomto dokumente sme stanovili účinok chronického podávania DOX na sérové ​​hladiny zápalových markerov IL-6 a TNF- u juvenilných myší bez nádoru a myší s nádorom. Myši s nádorom liečené fyziologickým roztokom vykazovali výrazné, aj keď štatisticky nevýznamné zvýšenie sérového IL-6 (obrázok 7A) a TNF- (obrázok 7B) v porovnaní s myšami bez tumoru. Dôležité je, že dvojcestná ANOVA preukázala významnú interakciu medzi podávaním DOX a nádorom na sérových hladinách IL-6 a TNF-. Podávanie DOX skutočne normalizovalo nádorom indukovanú upreguláciu IL-6 na podobnú úroveň ako u kontrolných myší bez nádoru (obrázok 7A).