Časť 1: Echinakozid zvyšuje množstvo spermií u potkanov zacielením na hypotalamický androgénny receptor

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Zhihui Jiang1,2, Bo Zhou2, Xinping Li2, Gordon M. Kirby3 & Xiaoying Zhang1,2

Pls kliknite sem pre časť 2

Mužská neplodnosť je hlavným zdravotným problémom s odhadovanou prevalenciou 4,2 percenta mužskej neplodnosti na celom svete. Naša raná práca to ukázalaCistanche extraktychrániť pred poškodením spermií u myší a toechinakozid(ECH) je jednou z hlavných aktívnych zložiek. Tu uvádzame zásadnú úlohu ECH, prírodného produktu, ktorý zvráti alebo chráni pred oligoastenospermiou u potkanov. ECH bola testovaná pomocou HPLC, kvantita a kvalita spermií boli hodnotené a hladiny hormónov boli stanovené rádio-imunosorbentným testom. ECH znížila hladiny androgénneho receptora (AR) a kľúčových génov súvisiacich so steroidogénmi, ako bolo stanovené analýzou Western blot a qPCR. Interakcia medzi ECH a AR bola hodnotená nepriamou ELISA a molekulárnym dokovaním. Výsledky ukazujú, že ECH v kombinácii s hypotalamickou AR vo vrecku Met-894 a Val-713 inhibuje prenos AR z cytoplazmy do jadier v hypotalame. Zatiaľ čo negatívna spätná väzba regulácie pohlavných hormónov bola inhibovaná, pozitívna spätná väzba bola stimulovaná na zvýšenie sekrécie luteinizačného hormónu a testosterónu, čím sa následne zvýšilo množstvo spermií. Celkovo tieto údaje ukazujú, že ECH blokuje aktivitu AR v hypotalame, aby sa zvýšilo množstvo spermií a chránilo sa pred oligoastenospermiou u potkanov.

Cistanche

Produkcia testosterónu v testikulárnych bunkách je silne regulovaná osou hypotalamus-hypofýza-gonáda (HPG) vytvorením homeostatickej spätnoväzbovej slučky1. Hormón uvoľňujúci gonadotropín (GnRH), vylučovaný hypotalamom, môže stimulovať sekréciu luteinizačného hormónu (LH) z hypofýzy, čo ďalej stimuluje produkciu testosterónu v testikulárnych Leydigových bunkách. Testosterón je biosyntetizovaný radom steroidogénnych enzýmov. Ako jedna z hlavných ciest môže steroidogénny akútny regulačný proteín (StAR) transportovať cholesterol z vnútrobunkových zdrojov do mitochondrií2, kde je vystavený enzýmu štiepiacemu bočný reťazec cholesterolu (CYP11A1), 3 -hydroxysteroid dehydrogenáze (HSD3), { {10}}hydroxyláza (CYP17A1) a 17 -hydroxysteroid dehydrogenáza (HSD 17 ), ktoré katalyzujú premenu cholesterolu na testosterón3,4. Testosterón sa potom negatívne vracia späť do prvku HPG, aby znížil ďalšiu sekréciu LH spôsobom závislým od dávky.

Účinok testosterónu na slučku spätnej väzby osi HPG nastáva väzbou na androgénny receptor (AR), ktorý sa nachádza v hypotalame aj hypofýze5. U myší ablácia AR a minimálna produkcia testosterónu spôsobuje zvýšenie hladín LH a folikuly stimulujúceho hormónu (FSH), čo naznačuje, že AR sa podieľa na regulácii negatívnej kŕmnej slučky. Klasický genómový mechanizmus testosterónovej signalizácie nastáva, keď testosterón difunduje do bunky a viaže sa na AR. Tento komplex ligand-receptor sa potom premiestni do jadra, kde sa viaže na elementy reakcie na androgén (ARE) v regulačných oblastiach génov reagujúcich na testosterón, aby sa modifikovala ich translokácia. Testosterón tiež indukuje neklasickú dráhu účinku steroidných hormónov, charakterizovanú rýchlymi udalosťami, ktoré vedú k aktivácii cytosolických signálnych kaskád, ktoré sú normálne spúšťané rastovými faktormi7,8. Klasické aj neklasické dráhy testosterónu prispievajú k zachovaniu spermatogenézy a plodnosti. Funkcia AR je však dôležitejšia v klasickej dráhe, pretože testosterón pôsobí na zvýšenie kvality spermií.

Echinakozid(ECH) je jednou z bioaktívnych zložiek odvodených z liečivých rastlín druhu Echinacea9 aCistanche10. So širokým spektrom farmakologických aktivít sú extrakty z Echinacey 1Výskumné centrum modernej biotechnológie, Škola biotechnológie a potravinárskeho inžinierstva, Anyang Institute of Technology, Anyang, Henan, 455000, Čína. 2 College of Veterinary Medicine, Northwest A & F University, Yangling, Shaanxi, 712100, Čína. 3Department of Biomedical Sciences, Ontario Veterinary College, University of Guelph, Guelph, Ontario, N1G 2W1, Kanada. Korešpondenciu a žiadosti o materiály adresujte XZ

jeden z najpopulárnejších bylinných doplnkov v Európe a USA najmä vďaka svojim antioxidačným vlastnostiam11 a ich schopnosti predchádzať bežnému prechladnutiu12. zaujimave,Cistanche extrakty a ECH sa v tradičnej čínskej medicíne tradične používajú ako tonikum na liečbu reprodukčnej dysfunkcie a na zvýšenie mužskej sexuálnej aktivity10. Niektoré OTC produkty zCistanche extrakcia boli vyvinuté ako výživové doplnky a získavajú na popularite na trhoch so zdravou výživou v Číne a niektorých ďalších ázijských krajinách (China Food and Drug Administration)13. Základné mechanizmy pôsobenia ECH však zostávajú nejasné.

Mužská neplodnosť je hlavným zdravotným problémom s odhadovanou prevalenciou 4,2 percenta mužskej neplodnosti na celom svete14. Diagnóza mužskej neplodnosti je v súčasnosti založená na štúdiu kvality spermií vrátane analýzy semenných parametrov, ako je koncentrácia spermií, motilita a morfológia15. Estrogén napodobňujúci Bisfenol A (BPA) je rozšírený environmentálny kontaminant, ktorý bol študovaný z hľadiska jeho vplyvu na mužskú plodnosť u niekoľkých druhov zvierat a ľudí16. BPA narúša os hypotalamus-hypofýza-gonáda, inhibuje expresiu testikulárnych steroidogénnych enzýmov a syntézu testosterónu u mláďat samcov17, čo spôsobuje stav hypogonadotropného hypogonadizmu18. V tejto štúdii skúmame účinky ECH na kvalitu spermií a hladiny hormónov. Okrem toho bol BPA vybraný ako modelové činidlo poranenia spermií na ďalšie štúdium ochranného účinku ECH proti zlej kvalite spermií.

Cistanche extrakty

Výsledky

ECH zvyšuje množstvo spermií. Počty spermií v cauda nadsemenníku, životaschopnosť spermií a pohyblivosť spermií sú uvedené v tabuľke 1. Liečba 80 mg/kg ECH a 15 mg/kg testosterón propionátu (TP) významne zvýšila počet nadsemenníkov. Nezistil sa však žiadny významný rozdiel v životaschopnosti spermií a pohyblivosti spermií.

ECH zvyšuje hladiny testosterónu a LH v sére, encefalóne plus hypofýze a semenníkoch. Liečba ECH výrazne zvýšila hladiny LH v sére, encefalóne plus hypofýze a semenníkoch (obr. 1A). V skupine ECH(H) sa hladiny LH výrazne zvýšili 1.1-násobne v sére, 1.4-násobne v mozgu a hypofýze a 1.2-násobne v semenníkoch. Testosterón sa po liečbe ECH(H) významne zvýšil 1,5 a 1{10}}násobne v encefalóne plus hypofýze a semenníkoch, ale nie v sére. Po liečbe TP sa hladiny testosterónu významne zvýšili 1,6, 1,8 a 1{16}}násobne v sére, encefalóne, hypofýze a semenníkoch.

ECH zvýšila expresiu génu steroidogénneho enzýmu. ECH významne zvýšilo expresiu kľúčových steroidogénnych enzýmov v semenníkoch (obr. 1B). Hladiny mRNA CYP11A1, CYP17A1, HSD3 1/2 a HSD17 v skupine ECH(H) sa zvýšili viac ako 3-násobne, zatiaľ čo hladiny mRNA StAR nevykazovali žiadne významné rozdiely pri všetkých ošetreniach ECH (p > 0.05). TP významne nezmenil expresiu CYP11A1, CYP17A1, HSD3 1/2 a HSD17. To sa odráža v komplexnej analýze teplotnej mapy účinku ECH na expresiu steroidogénnych enzýmov, čo naznačuje, že ECH významne zvýšilo hladiny mRNA CYP11A1, CYP17A1, HSD3 1/2 a HSD17, a najmä HSD3 1/ 2 (obr. 1C).

ECH môže prechádzať cez hematoencefalickú bariéru a v menšej miere cez hematoencefalickú bariéru. Na vyhodnotenie androgénnej spätnoväzbovej slučky na HPG-osi sa v sérii PK štúdií hodnotila schopnosť ECH vstúpiť do hypotalamu. Koncentrácie ECH boli detegované v hypotalame po 12-hodinovom jednorazovom perorálnom podaní 30 mg/kg ECH a ECH vykazovalo výraznú penetráciu hypotalamu s priemerným pomerom hypotalamus/plazma 33,92 percent (obr. 2A). Hodnoty T1/2 boli 2,61 ± 0,42 h a 1,88 ± 0,22 h v plazme a hypotalame (obr. 2B). Pomocou HPLC sa však zistil veľmi obmedzený prístup ECH do semenníkov. Koncentrácie ECH v semenníkoch boli 0.083 ug/ml, 0,043 ug/ml a 0,028 ug/ml po 0,5 h, 1 h a 1,5 h po liečbe.

ECH znižuje translokáciu AR hypotalamu do jadra. Na testovanie účinku ECH na translokáciu AR sa stanovila expresia AR v cytoplazme a jadre semenníkov a hypotalamu pomocou analýzy western blot. Ako je znázornené na obr. 3A, ECH znížila AR proteín v hypotalamických jadrách násobne v porovnaní s kontrolnou skupinou. Liečba enzalutamidom, inhibítorom AR, znížila hladiny proteínu AR v hypotalamických jadrách 4.8--krát. Je pozoruhodné, že cytoplazmatická AR bola vyššia pri liečbe ECH a liečbe enzalutamidom ako kontroly, čo naznačuje, že ECH blokuje transport AR z cytoplazmy do jadra v hypotalame. Ako sa očakávalo, ECH neinhibuje transport AR z cytoplazmy do jadra v semenníkoch (obr. 3B).

ECH zvýšila expresiu génov súvisiacich s HPG osou. ECH signifikantne zvýšilo expresiu LH, LHR, GnRH1 a Gnrhr v zmesiach encefalónu a hypofýzy, avšak po liečbe TP nebol žiadny významný rozdiel v hladinách GnRH1. Analýza teplotnej mapy ukazuje, že expresie GnRH 1 a LH boli najvyššie medzi génmi súvisiacimi s osou HPG.

Obrázok 1. Účinok ECH na hladiny LH, testosterónu a hlavných steroidogénnych enzýmov. Poznámka: (A) hladiny LH v sére, encefalóne plus hypofýze a semenníkoch (mIU/ml, priemer ± SD);

hladiny T v sére, encefalóne plus hypofýze a semenníkoch (ng/ml, priemer ± SD); (B) expresia hlavných steroidogénnych enzýmov;

(C) hierarchické zoskupovanie expresie mRNA rôznych steroidogénnych enzýmov v semenníkoch. Zelená, zeleno-červená a červená farba predstavujú nízke,

stredná a vysoká abundancia, n=7. a,b,c Rôzne písmená označujú štatisticky odlišné skupiny (p <>

Obrázok 2. Distribúcia a farmakokinetické parametre ECH v hypotalame. Poznámky: (A) Pomery hypotalamus/plazma ( percentá ) boli vypočítané na základe plazmatických a hypotalamových expozícií ECH (koncentrácia) pri 0,5 h, 1.0 h, 1,5 h, 2.{101} {8}} h, 2,5 h, 3.{12}} h, 6.{14}} h, 9.{16}} h a 12.{18}} h po perorálnom podaní. (B) Farmakokinetické (PK) parametre ECH v plazme a hypotalame. T1/2, polčas rozpadu; Cmax, maximálna koncentrácia; Vz/F, zdanlivý distribučný objem; MRT, stredný retenčný čas; AUC, plocha pod krivkou závislosti koncentrácie od času.

AR je cieľom ECH. Na potvrdenie vzťahov medzi ECH a AR bol úspešne syntetizovaný ECH-ovalbumín (ECH-OVA) (obr. 5A,B). Molekulová hmotnosť ECH-OVA je väčšia ako OVA, takže majú rôznu mieru mobility (obr. 5A) a vrchol absorbancie ECH-OVA je medzi ECH a OVA (obr. 5B),

Cistanche extrakty

Obrázok 3. Vplyv ECH na transport AR v semenníkoch a hypotalame. Poznámky: (A) Účinok ECH na transport AR v hypotalame. Hladiny AR proteínu boli stanovené analýzou Western blot a stĺpce predstavujú denzitometrickú kvantifikáciu jadrového AR normalizovaného na Lamin B a cytoplazmatického AR normalizovaného na GAPDH. Každá hodnota predstavuje priemer ± SD šiestich nezávislých experimentov. a,b,c Rôzne písmená nad stĺpcami označujú štatisticky odlišné skupiny (p < 0.05);="">B) Vplyv ECH na transport AR v semenníkoch.

čo naznačuje, že ECH bol úspešne konjugovaný s OVA. Nepriame výsledky ELISA (obr. 5C) ukazujú, že anti-AR protilátka je schopná detegovať AR proteín prítomný v jamkách obsahujúcich ECH-OVA (indikované anti-OVA protilátkou), čo naznačuje, že ECH sa môže viazať na AR proteín.

ECH sa kombinuje s AR pocket of Met-894 a Val-713. Zlúčenina ECH bola pripojená k miestu AF2 na povrchu ľudského AR a teoretický väzbový režim ECH a AR bol znázornený na obr. 5D. Zlúčenina ECH prijala kompaktnú konformačnú väzbu vo vrecku ľudského AR. Dve fenylové skupiny ECH sa viažu na hydrofóbnu doménu vrecka AR a udržiavajú tesné hydrofóbne kontakty so zvyškami Leu-712, Val-716, Met{6}}, Ile-737 , Met-894 a Ile-898, zatiaľ čo ostatné dve strany ECH boli umiestnené pri vchode do vrecka a nadviazali len niekoľko kontaktov. Podrobná analýza ukázala, že Met{10}} (dĺžka väzby: 2,4 Á) aj Val{13}} (dĺžka väzby: 2,7 Á) vytvorili vodíkové väzby s hydroxy1 skupinami ECH, čo bola hlavná interakcia medzi ECH a ľudský AR.

ECH zmierňuje BPA-indukované reprodukčné poškodenie. Na skúmanie účinku ECH na reprodukčné poškodenie sa skúmala kvalita spermií a hladiny pohlavných hormónov a steroidogénnych enzýmov u myší indukovaných BPA. Ako je znázornené na obr. 6, liečba BPA významne znížila počet spermií o 26,5 percent a pohyblivosť spermií o 39,2 percent. Podávanie ECH zabránilo zníženiu počtu spermií o 35,5 percenta a pohyblivosti spermií o 30,1 percenta. Podávanie BPA tiež viedlo k významnému zníženiu sekrécie LH a T a ECH značne zvýšilo hladiny LH a T o 24,1 percenta a 18,3 percenta v porovnaní s liečbou samotným BPA (obr. 6A, B). Hladiny mRNA StAR, CYP17A1, 3 -HSD a 17 -HSD pri liečbe BPA-ECH boli významne zvýšené v porovnaní s liečbou BPA (obr. 6C, D).

Obrázok 4. Zmeny v génovej expresii súvisiacej s HPA po liečbe ECH. Poznámky: Stĺpce (A–D) predstavujú hladiny mRNA LH, LHr, Gnrh 1 a Gnrhr v mozgu a hypofýze. a,b,c Rôzne písmená nad stĺpcami označujú štatisticky odlišné skupiny (p < 0.05).="" (e)="" hierarchické="" zoskupovanie="" expresie="" mrna="" rôznych="" steroidogénnych="" enzýmov.="" zelená,="" zeleno-červená="" a="" červená="" predstavujú="" nízku,="" strednú="" a="" vysokú="" abundanciu,="" n="7." kontrolná="" (liečená="" normálnym="" fyziologickým="" roztokom="" 10="" ml/kg),="" ech(l)="" (liečená="" ech="" 5="" mg/kg),="" ech(m)="" skupina="" (liečená="" ech="" 20="" mg/kg),="" ech(h)="" (liečená="" ech="" 80="" mg/kg),="" tp="" (liečený="" tp="" 15="">