ČASŤ 1 Echinacozid inhibuje uvoľňovanie glutamátu potlačením vstupu Ca2+ závislého od napätia a proteínovej kinázy C v termináloch mozgových nervov potkanov

Cheng Wei Lu 1,2, Tzu Yu Lin 1,2, Shu Kuei Huang 1 a Su Jane Wang 3,*

1 Oddelenie anestéziológie, Far-Eastern Memorial Hospital, Pan-Chiao District, New Taipei City 22060, Taiwan; drluchengwei@gmail.com (C.W.L.); drlin1971@gmail.com (T.Y.L.);nskh9450n@yahoo.com.tw (S.K.H.)

2 Katedra strojárstva, Yuan Ze University, Taoyuan 32003, Taiwan

3 Lekárska fakulta, Fu Jen Catholic University, č. 510, Zhongzheng Rd., Xinzhuang Dist., New Taipei 24205, Taiwan.

Abstraktný:Glutamatergický systém sa môže podieľať na účinkoch neuroprotektívnej liečby. Echinacozid, fenyletanoid glykozid extrahovaný z liečivej čínskej bylinyHerba Cistanche,Má neuroprotektívne účinky. Táto štúdia skúmala účinky echinakozidu na uvoľňovanie glutamátu vyvolaného 4-aminopyridínom v termináloch mozgových nervov potkanov (synaptómy). Echinacozid inhibovaný Ca²⁺Závislý, ale nie Ca²⁺-nezávislý, 4-aminopyridínom vyvolaný glutamát, ktorý sa uvoľňuje spôsobom závislým od koncentrácie. Echinakozid tiež znížil zvýšenie 4-aminopyridínu vyvolaného zvýšenia cytoplazmatického bez ca²⁺koncentrácia, ale nezmenila potenciál synaptozomálnej membrány. Inhibičnému účinku echinakozidu na uvoľňovanie glutamátu vyvolaného 4 aminopyridínom zabránili cu-conotoxín MVIIC, širokospektrálny blokátor kanálov Cav2.2 (N-typ) a Cav2.1 (P/Q-typ), ale bol necitlivý na intracelulárny Ca²⁺inhibítory uvoľňovania dantrolénu a 7-chloro-5-(2-chlorophenyl)-1,5-dihydro-4,1-benzodiazepín-2(3H)-jeden (CGP37157). Okrem toho echinakozid znížil fosforyláciu proteínovej kinázy C vyvolanú 4 aminopyridínom a inhibítory proteínovej kinázy C zrušili účinok echinakozidu na uvoľňovanie glutamátu. Podľa týchto výsledkov navrhujeme, aby inhibičný účinok echinakozidu na vyvolané uvoľňovanie glutamátu bol spojený so zníženým napätím závislým ca²⁺vstup a následné potlačenie aktivity proteínovej kinázy C.

Kľúčové slová:echinakozid; uvoľnenie glutamátu; terminály mozgových nervov; Ca závislá od napätia²+ kanály; proteínová kináza C Parkinsonovej choroby, Alzheimerovej choroby a oklúzie strednej mozgovej tepny[9-12]. Mechanizmus, ktorým echinakozid indukuje neuroprotekciu, však nie je úplne pochopený.

Pre viac informácií kontaktujte:Joanna.jia@wecistanche.com

Echinacozidv cistanche majú veľa funkcií

1. Úvod

Echinacozidje hlavným fenyletanoidným glykozidom prítomným vHerba Cistanche, známa tradičná čínska medicína používaná na liečbu zábudlivosti, impotencie a chronickej zápchy[ 1].Echinacozidmá rôzne bioaktívnosti, ako je antioxidácia, protizápal, protirakovinový účinok, hepatoprotekcia a imunitná modulácia [2-4]. Najmäechinakozidmá neuroprotektívne účinky; môže napríklad chrániť pred oxidačným stresom alebo neurotoxínom vyvolanou neurotoxikitou v primárnych kortikálnych neurónoch potkanov, ľudských neuroblastómových bunkách SH-SY5Y a bunkách feochromocytómu (PC12) [5–8]. Navyšeechinakozidzmierňuje poškodenie mozgu a zlepšuje kognitívne funkcie v zvieracích modeloch Parkinsonovej choroby, Alzheimerovej choroby a oklúzie strednej mozgovej tepny [9-12]. Mechanizmus, prostredníctvom ktoréhoechinakozidIndukácia neuroprotekcie nie je úplne pochopená.

Neuroprotekcia je komplexný proces zachovania neurónovej štruktúry a funkcie pri toxických urážkach. Zníženie glutamátu excitotoxicity sa považuje za potenciálny mechanizmus, ktorý sa podieľa na neuroprotekcii mozgu. Glutamát, excitačný neurotransmiter aminokyselín, má kľúčovú úlohu v niekoľkých mozgových funkciách. Avšak nadmerná aktivácia glutamátových receptorov pri vysokých koncentráciách glutamátu spôsobuje vnútrobunkové preťaženie Ca2+, mitochondriálnu dysfunkciu, produkciu voľných radikálov a neurónovú smrť [14,15]. Tento patologický proces sa podieľa na mnohých poruchách mozgu vrátane mozgovej ischémie, traumatického poranenia mozgu, epilepsie a neurodegeneratívnych ochorení[ 16,17]. Preto inhibítory blokujúce patofyziologický glutamatergický prenos sa považujú za potenciálne neuroprotektívne lieky. Pozoruhodnými príkladmi sú antagonisti glutamátových receptorov [18,19]; klinické skúšky týchto liekov však zlyhali z dôvodu menšej účinnosti a nežiaducich alebo dokonca cytotoxických vedľajších účinkov [20,21]. Okrem priamej blokády glutamátových receptorov môže byť inhibícia uvoľňovania glutamátu účinnou stratégiou neuroprotekcie. Niekoľko neuroprotektív (napr. memantín a riluzol) môže znížiť uvoľňovanie glutamátu v mozgových tkanivách potkanov [22-24].

Berúc do úvahy úlohu glutamátu v excitotoxicite a neuroprotektívny profilechinakozid, v tejto štúdii sa použili izolované nervové terminály (synaptozómy) očistené od mozgovej kôry potkanov, aby sa skúmal účinokechinakozido uvoľňovaní glutamátu a ďalej skúmaných potenciálnych mechanizmoch. Izolovaný prípravok nervového terminálu je dobre zavedeným modelom pre štúdium presynaptickej regulácie uvoľňovania neurotransmiterov liekmi pri absencii akýchkoľvek postynaptických účinkov [25]. Použitím tohto modelu sme zhodnotili účinokechinakozidpri uvoľňovaní glutamátu, membránovom potenciáli, presynaptickom prílive Ca2+ a aktivite proteínovej kinázy C. Podľa nášho prehľadu literatúry ide o prvú správu dokumentujúcu mechanizmus, prostredníctvom ktoréhoechinakozidinhibuje uvoľňovanie endogénneho glutamátu na presynaptickej úrovni.

Echinakozid môže byť antioxidačný

2. Výsledky

2.1.EchinacozidInhibuje uvoľňovanie 4-aminopyridín-evokovaného glutamátu z mozgovotrovírusových nervových terminálov potkanov znížením vezikulárnej exocytózy

Obrázok 1 ilustruje účinok závislý od koncentrácieechinakozidna 4-aminopyridínom vyvolanom glutamáte z purifified potkanov cerebrocortálnych synaptozómov. V synaptozómoch inkubovaných 1 mM CaCl2, 1 mM 4-aminopyridín vyvolal uvoľnenie glutamátu 7,4 ̆ 0,1 nmol/mg/5 min, ktoré bolo znížené o 1, 5, 10, 30 a 50 μMechinakoziddo 6,5 ̆ 0,2, 5,8 ̆ 0,3, 4,8 ̆ 0,2, 4,1 ̆ 0,1 alebo 2,3 ̆ 0,4 nmol/mg/5 min (F(5,24) = 67,1, p = 0,000). Hodnota IC50 preechinakozid-sprostredkovaná inhibícia uvoľňovania glutamátu vyvolaného 4-aminopyridínom, odvodená zo krivky reakcie na dávku, bola 24 μM. Okrem toho uvoľňovanie glutamátu vyvolané 1 mM 4-aminopyridínom v extracelulárnom roztoku bez ca2+, ktorý obsahoval 300 μM etylénglykol bis(β-aminoetyléteru)-N,N,N1,N1,N1 -tetraacetová kyselina (EGTA) bola 2,1 ̆ 0,2 nmol/mg/5 min (F(2,12) = 310,65, p = 0,000) a táto Ca2+nezávislá zložka 4-aminopyridín-evokovaného glutamátu bola neovplyvnená o 20 μMechinakozid(1,8 ̆ 0,2 nmol/mg/5 min; p = 0,58; Obrázok 1). V synaptozómoch liečených 0,1 μM bafifilomycínom A1, inhibítorom vezikulárneho transportéra [26], sa 4-aminopyridínom vyvolané glutamátové uvoľňovanie výrazne znížilo (2,2 ̆ 0,2 nmol/mg/5 min; F (2,12) = 249,518, p = 0,000). V prítomnosti bafifilomycínu A1 sa 20 μM echinakozidu nepodarilo výrazne inhibovať uvoľňovanie glutamátu (2,1 ̆ 0,2 nmol/mg/5 min; p = 0,94; Obrázok 1). Naproti tomu 10 μM DL-dl-threo-beta-benzyl-oxyaspartát (DL-TBOA, inhibítor rekuperácie glutamátu glutamátu) [27], zvýšené uvoľňovanie 4-aminopyridínu-evokovaného glutamátu na 11,8 ̆ 0,4 nmol/mg/5 min (t(8) = '11,31, p = 0,000). Dokonca aj v prítomnosti DL-TBOA, 20 μMechinakozidinhibované 4-aminopyridínom vyvolané glutamátové uvoľňovanie výrazne (7,7 ̆ 0,2 nmol/mg/5 min; F(2,12) = 87,23, p = 0,000; Obrázok 1)

2.2. EchinacozidZnižuje cytosolickú ca²+Koncentrácia, ale nemení synaptozomálny

Mem brane Potenciál

Synaptozómová depolarizácia spôsobená 1 mM 4-aminopyridínom zvýšená Ca²+ koncentrácia(p= 0,000; Tabuľka 1). Aplikácia 20 |vMechinakozidvýznamne neovplyvnil baral Ca²+ koncentrácia (t(8) = 0,06,p= 0,95), ale výrazne znížil zvýšenie iia Ca vyvolané 4 aminopyridínom²+ koncentrácia (t(10)= 6,16,p =0.000). Okrem toho sa 1 mM 4-aminopyridín zvýšil v 3',3',3'-dipropylthiadicarbocyanín jodid [DiSCSC₃(5)] fluorescencia (p= 0,000). Doplnenie o⁽20 fdM echinacozid nezmenil pokojový membránový potenciál (t(8) = 0,976,p= 0,36) alebo významne zmeniť zvýšenie DiSC sprostredkované 4-aminopyridínom₃(5) fluorescencia (t(8) = —0,014,p= 0,99; Tabuľka 1).

Cistancheechinakozidmôže liečiť ochorenie obličiek

2.3.Znížená - CO2+Príliv cez kanály Cav2.2 (N-Type) a Cav2.1 (P/Q-Type) môže byť spojený s inhibíciou uvoľňovania glutamátu 4-aminopyridín-evokovaného glutamátuEchinacozid

Obrázok2ukazuje, že 2 cu-conotoxín MVIIC, N-a P / Q-type Ca²+ blokátor kanálov,

znížené uvoľňovanie glutamátu vyvolaného 4 aminopyridínom zo 7,4 土 0,2 na 2,0 土 0,1 nmol/mg/5 min (t(9) = 25,35,p= 0,000). V prítomnosti cu-conotoxínu MVIIC bol účinok 20 pM echinakozidu na uvoľňovanie glutamátu vyvolaného 4 aminopyridínom bezvýznamný (1,8 土 0,2 nmol/mg/5 min;t(8) = 1,06,p= 0,32). Dantrolén (10 ^M), inhibítor intracelulárneho Ca²+ uvoľnite Crom endoplazmatické retikulum [28], znížené uvoľňovanie glutamátu vyvolaného 4-aminopyridínom (5,6 土 0,3 nmol/mg/5 min; F(2,14) = 104,95,p= 0,000). Avšak v prítomnosti dantrolénu, 20 pJMechinakozidmôže stále výrazne inhibovať uvoľňovanie glutamátu (3,3 土 0, 2 nmol/mg/5 min;p= 0,000). Podobné výsledky boli pozorované pomocou 100 pM 7-chloro-5-(2-chloropheny)-1,5-dihydro-4,1-benzothiazepin-2(3H)-one (CGP37157), membránovo-permeaPeblátor mitochondriálnej Na⁺/Ca²+ výmena. V piatich skúmaných synaptozomálnych prípravkoch 20 pMechinakozidv kombinácii so 100 pM CGP37157 zníženým 4-aminopyridínom vyvolaným glutamátom o 48,3% 土 5,2% (F(2,13) = 136,79,p= 7,000), podobne ako inhibícia samotným echinakozidom (46,2% 土 2,3%;p= 0,89;

2.4.EchinacozidInhibcts 4-Aminopyridín-evokovaný (glutamát uvoľňovanie signalizáciou cez proteínovú kinázu C

Ako je znázornené na obrázku 3, 10 °jlM 2-[1-(3-dimetyl-3-dimetyl-3-yl]-3-(indol-3-yl) maleimid (GF109203X), gen er al proteinkináza C inhibítor [29], redpyruc ed 4-aminodidín-evokovaný glutamát (F(2,13) = 19,46, p = 0,000). V synaptozómoch liečených GF109203X znížil 20 pM echinakozid 4-aminopyridínom vyvolaný glutamátom iba o 5,5% 土 1,8% (p = 0,89), menej ako samotný echinakozid (42,4% 土 2,3%; p = f.000). Podobné výsledky boli získané s 5,6,7,13-tetrahydro-13-metyl-5-oxo-12H-indolo[2,3-a]pyrrolo[3,4-c]carbazole-12-propanenitrile (Go6976), selektívny pre ca2+dependentné proteínové kinázové C izoformy (a, |3I, |3II, y) [29]. Za prítomnosti 3 pM Go6976, 20 pMechinakozidznížené uvoľňovanie glutamátu o 11,9% 土 2,9% (p = 0,59), čo znamená významné zníženie v porovnaní s tým samotným echinakozidom (42,4% 土 2,3%; p = 0,000; Obrázok 3). Naproti tomu rottlerín 3 pM, inhibítor ca2+-nezávislej proteínovej kinázy C6 [30], významne nezmenil 4-aminopyridín (1 mM)-evokovaný glutamát (p = 0,45). Avšak v prítomnosti rottlerínu 20 pM echinakozid účinnet spôsobil priemernú inhibíciu 37, 1% 土 5,6% uvoľňovania (F(2,13) = 19,72, p = 0,000), podobne ako samotný echinakozid (p = 0,41; Obrázok 3). Okrem toho inhibítor proteínovej kinázy aktivovaný mitogénom 2-(2-amino-3-metoxyfenyl)-4H-1-benzopyran-4-one) (PD98059) (PD98059) (50 pM) a inhibítor proteínovej kinázy A N-[2-(p-bromocinnamylamino)etyl]-5-izoquinolínsulfonamid (H89) (100 pM) znížili uvoľňovanie 4-aminopyridínu-evokovaného glutamátu (p = 0,000). Dokonca aj v prítomnosti PD98059 alebo H89, 20 pMechinakozidúčinne znížilo uvoľňovanie (F(2,13) = 52,3, p = 0,000; Obrázok 3).

Obrázok 4 ukazuje, že tha11 mM 4-aminopyridín zvýšil fosforyláciu proteínovej kinázy C v synaptozómoch (t(4) = —6,871,p= 0,002). Keď sa synaptozómy predliečili 20 pM echinakozidom po dobu 10 minút pred pridaním 4-aminopyridínu, 4-aminopyridínom indukovaný fosforyláciou proteínovej kinázy C sa výrazne znížil (F(2)_a6) = 29.202,p= 0,00 1).

EchinacozidvcistancheMôže zvýšiťimunitný systém

2.5.EchinacozidSprostredkovaná inhibícia uvoľňovania glutamátu nezahŕňa kyselinu gama-aminomaslovú typu A (GAB)³A_A) Receptor

Na obrázku 5 účinok echinakozidu na uvoľňovanie glutamátu vyvolaného 4-aminopyridínom v neprítomnosti alebo prítomnosti SR95531 (antagonista GABA_Areceptor) bol porovnávaný. Okrem toho 100 pM SR95531 významne nezmenilo uvoľňovanie glutamátu vyvolaného 4-aminopyridínom (1 mM). V

SR95531-liečené synaptozómy, aplikácia 20 pM echinakozidu viedla k 43% inhibícii uvoľňovania glutamátu vyvolaného 4-aminopyridínom (F(2,12) = 42,63,p= 0,000), čo sa výrazne nelíšilo od inhibície produkovanej samotným echinakozidom (40%;p= 0,000). Podobný výsledok bol získaný s ďalším antagonistom GABAA receptora, bikulínom (50 pM). Uvoľňovanie merané za prítomnosti bikulínu a