Časť 1: Oligosacharid z ľudského mlieka 2/-fukozyllaktóza indukuje neuroprotekciu pred intracerebrálnou hemoragickou mŕtvicou

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Tsai-Wei Hung 1, Kuo-Jen Wu 1, Yu-Syuan Wang 1, Eun-Kyung Bae 1, YoungHa Song 2 , JongWon Yoon 2 a Seong-Jin Yu1,*

1Centrum pre neuropsychiatrický výskum, National Health Research Institutes, Zhunan 35053, Taiwan;

pilypily@nhri.edu.tw (T.-WH); kjwu@nhri.edu.tw (K.-JW); yswang@nhri.edu.tw (Y.-SW);

baee@nhri.edu.tw (E.-KB)

2Advanced Protein Technologies Corporation, Suwon-si 16229, Kórea; yhsong@aptech.biz (YS);

jongwon.yoon91@gmail.com (JY)

Korešpondencia: b7508@nhri.edu.tw; Tel.: plus 886-37206166 (ext. 36710)

Abstrakt:

Intracerebrálne krvácanie (ICH) nastáva, keď prasknú krvné cievy v mozgu, čo spôsobí zápal a smrť buniek. 2-Fukozyllaktóza (2FL), oligosacharid ľudského mlieka, má silné antiapoptotické a protizápalové účinky. Účelom tejto štúdie bolo preskúmať ochranný účinok 2FL v bunkových a hlodavčích modeloch ICH. Hemín bol pridaný do primárneho kortikálu potkananeurónovéa kokultivácia mikroglií BV2 na simuláciu ICH in vitro. IBA1 a MAP2 imunoreaktivity sa použili na stanovenie zápalu aneurónovéprežitie. Hemin významne zvýšil IBA1, zatiaľ čo znížil imunoreaktivitu MAP2. 2FL významne antagonizovali obe odpovede. Ochranný účinok 2FL sa ďalej skúmal na potkanom modeli ICH. Intracerebrálne podanie kolagenázy typu VII znížilo lokomotorickú aktivitu v otvorenom poli. Včasná post-liečba s 2FL významne zlepšila lokomotorickú aktivitu. Mozgové tkanivá sa odobrali na imunohistochémiu a analýzu qRT-PCR. 2FL znížil imunoreaktivitu IBA1 a CD4 v poškodenom striate. 2FL downreguloval expresiu ER stresových markerov (PERK a CHOP), zatiaľ čo upreguloval M2 makrofágové markery (CD206 a TGF ) v poranenom mozgu. Celkovo možno povedať, že naša dátová podpora, ktorú má 2FL aneuroprotektívneúčinok proti ICH prostredníctvom inhibícieneurozápala ER stres. 2FL môže mať klinické dôsledky na liečbu ICH.

Kľúčové slová: 2-fukozyllaktóza; mŕtvica intracerebrálneho krvácania; zápal; endoplazmatického retikula

účinky extraktu z cistanche: liečte neurochoroby

Pls kliknite sem pre časť 2

1. Úvod

Intracerebrálne krvácanie (ICH) je závažnéneurologicképorucha spojená s vysokým rizikom úmrtia u dospelých [1,2]. ICH predstavuje 10–15 percent všetkých prípadov akútnej cievnej mozgovej príhody [3]. Niekoľko epidemiologických štúdií potvrdilo rodové rozdiely u pacientov s ICH [4] alebo cerebrovaskulárnymi ochoreniami [5]. U malej časti pacientov s ICH sa vyvinie hemoragický lakunárny syndróm [6]. Súčasná liečba ICH sa zameriava na kontrolu krvácania, odstránenie krvnej zrazeniny a zmiernenie intrakraniálneho tlaku spôsobeného krvácaním. Neexistuje účinná farmakologická liečba ICH.

Zápal hrá rozhodujúcu úlohu pri indukcii ICHneurodegeneráciu. Po nástupe ICH krvné bunky vstupujú do mozgového parenchýmu, aktivujú mikroglie a iniciujú produkciu prozápalových cytokínov [7,8]. Hemín, vedľajší produkt hemoglobínu, spôsobujeneurónovésmrť a indukuje apoptózu a zápal [9,10]. Niekoľko štúdií podporilo účinnosť protizápalovej liečby na zvieracích modeloch ICH [11,12]. Nedávno sme preukázali, že skorá post-liečba antagonistom CXCR4 CX807 inhibovala zápal a zlepšila behaviorálnu funkciu u experimentálnych potkanov ICH [13]. Tieto údaje naznačujú, že protizápalová liečba môže znížiť poškodenie mozgu

po ICH.

Ľudské materské mlieko obsahuje výživu a niekoľko dôležitých bioaktívnych zložiek [14], napr. oligosacharidy ľudského mlieka (HMO) [15]. 2'-Fukozyllaktóza (2FL) je hlavným oligosacharidom v ľudskom mlieku. Orálne podanie 2FL sa zlepšiloPamäťa učenie u potkanov [16,17]. Okrem toho 2FL potláčal lipopolysacharidmi indukovanú expresiu CD14 a zápal v ľudských enterocytoch [18]. Nedávno sme informovali, že 2FL sa zmiernilneurozápalv mozgu trpiacom ischemickou mozgovou príhodou [19]. Tieto údaje naznačujú, že 2FL je silné protizápalové činidlo, a preto môže byť užitočné pri liečbe ICH.

Účelom tejto štúdie bolo preskúmať nervové ochranné účinky 2FL v bunkových a zvieracích modeloch ICH. Hemín sa použil na simuláciu ICH v bunkovej kultúre [20]. Preukázali sme, že 2FL antagonizoval hemínom sprostredkovanú aktiváciu mikroglií. Kolagenáza typu VII sa použila na vytvorenie fokálnej ICH u dospelých potkanov [13]. Zistili sme, že 2FL významne zmiernil ICH-indukovanú aktiváciu mikroglií, infiltráciu CD4 plus lymfocytov a ER stres v poranenom mozgu a zlepšil behaviorálnu funkciu. Naša dátová podpora, ktorú má 2FL aneuroprotektívneúčinok proti ICH.

účinky extraktu cistanche

2. Výsledky

2.1. 2FL Redukovaná hemínom sprostredkovaná neurodegenerácia v primárnych kortikálnych neurónoch a kokultúre BV2 mikroglie

Ochranný účinok 2FL bol najprv skúmaný na bunkovom modeli cerebrálneho krvácania. Primárna kôraneurónovéa BV2 mikrogliové kokultúry boli ošetrené hemínom (10 uM) počas 48 hodín (pozri časovú os na obrázku 1E). Hemin utlmenýneurónovémarker MAP2 (obrázok 1A), zatiaľ čo zvýšil marker mikroglií IBA1 (obrázok 1B). Tieto reakcie boli obe antagonizované 2FL (1 uM, obrázok 1A, B). Imunoreaktivity MAP2 a IBA1 sa ďalej analyzovali meraním hustoty pixelov špecifických markerov. Ako je vidieť na obrázku 1C,D, hemín významne znížil imunoreaktivitu MAP2 (Map2-ir) a zvýšil IBA1-ir (p < 0.00="" 1,="" jednosmerná="" anova,="" n="6" v="" každej="" skupine).="" tieto="" odpovede="" boli="" významne="" antagonizované="" 2fl="" (map2:="" p="">< 0,001,="" f2,="" 14="115.863;" iba1:="" p="">< 0,001,="" f2,15="134" 0,644,="" jednosmerná="">

F

Obrázok 1neuroprotektívneúčinok 2FL v primárnej kôreneuróna kokultúra mikroglií BV2. (A) Reprezentatívne mikrofotografie ukazujú, že hemín znižuje imunoreaktivitu MAP2 (-ir). Súbežné podávanie s 2FL antagonizovalo hemínom sprostredkovanú stratu MAP-ir. (B) Hemin zvýšil IBA1-ir. Spoločná správa s 2FL znížila IBA1-ir. (C,D) Hustota pixelov MAP2-ir alebo IBA{{10}}ir bola analyzovaná pomocou softvéru NIS Elements AR 5.11. (C) 2FL významne antagonizovaná hemínom sprostredkovaná strata MAP2-ir. (D) 2FL významne zoslabil hemínom indukovanú aktivitu IBA1. (E) Časová os experimentu. * p < 0,05.="" mierka="100">

cistanche extrakt prínos

2.2. Post-liečba s 2FL zlepšenou lokomotorickou aktivitou u ICH potkanov

Ochranný účinok 2FL sa ďalej skúmal na zvieracom modeli ICH. Celkom 14 dospelým samcom potkanov bola stereotakticky podávaná nízka dávka (0,5 jednotiek/ul x 1 ul) kolagenázy typu VII na vyvolanie cerebrálneho krvácania v pravom striatu. 2FL (400 mg/kg/d, ip, n=7) alebo vehikulum (fyziologický roztok, ip, n=7) ​​sa podávali denne počas 5 dní, počnúc 1 dňom po mŕtvici (časovú os nájdete v Obrázok 2G). Potom, 2 hodiny po poslednej 2FL alebo injekcii vehikula v deň 5, boli zvieratá jednotlivo umiestnené do komôr s infračervenou aktivitou na 30 minút. Počas 30 minút sa skúmalo lokomotorické správanie v otvorenom poli. Zistili sme, že 2FL výrazne zvýšil vertikálnu aktivitu (VACTV, obrázok 2A), celkovú prejdenú vzdialenosť (TOTDIST, obrázok 2B), vertikálny čas (VTIME, obrázok 2C), horizontálnu aktivitu (HACTV, obrázok 2D), čas pohybu (MOVTME, obrázok 2E ) a číslo pohybu (MOVNO, obrázok 2F). Podrobné štatistiky (obojsmerné ANOVA plus post hoc Newman-Keulsove (NK) testy) sú uvedené v tabuľke 1.

Obrázok 2. Následná liečba 2FL zlepšuje nervové funkcie u potkanov ICH. Dospelé potkany boli liečené kolagenázou typu VII na D0 (G, časová os). 2FL alebo vehikulum sa podávalo systémovo denne počas 5 dní. Lokomotorické správanie sa skúmalo v D5. 2FL výrazne zlepšila (A) vertikálnu aktivitu, (B) celkovú prejdenú vzdialenosť, (C) vertikálny čas, (D) horizontálnu aktivitu, (E) čas pohybu a (F) pohyb

číslo. n {{0}} v každej skupine. * p < 0.05,="" dvojcestná="" anova;="" #="" p="">< 0,05,="" post="" hoc="" nk="">

Tabuľka 1. Významné rozdiely v lokomotorickom správaní medzi ICH plus veh a ICH plus 2FL.

2.3. Včasná post-liečba s 2FL redukovanou mikrogliálnou aktiváciou v postihnutej oblasti

Osem potkanov ICH (2FL, n=4; Veh, n=4) bolo usmrtených a perfundovaných na imunohistochémiu IBA1 po behaviorálnom teste v deň 5. Typický IBA1-ir je znázornený na obrázku 3 IBA1-ir bol zvýšený v peri-léziovej oblasti v striate (obrázok 3B) v porovnaní so zodpovedajúcimi miestami v kontralaterálnom nepoškodenom striate (obrázok 3A) u potkanov s mozgovou príhodou, ktorí dostávali veh. Pri vysokom zväčšení boli v poškodenej oblasti nájdené deramifikované alebo améboidné mikrogliálne bunky (obrázok 3B, vložka), zatiaľ čo pokojové mikroglie vykazujúce rozvetvenú morfológiu sa našli v nepoškodenom striatu (obrázok 3A, vložka). Liečba 2FL znížila IBA{17}}ir a čiastočne obnovila morfologické rozvetvenie mikroglie (obrázok 3C, vložka). IBA1-ir bol kvantifikovaný a spriemerovaný v troch po sebe nasledujúcich častiach mozgu s vizualizovanou prednou komisurou u všetkých zvierat. 2FL významne znížil IBA1-alebo v mozgu ICH (obrázok 3D, p < 0.001,="" f2,12="50.357," jednosmerná="">

Obrázok 3. Skorá liečba 2FL znížila mikrogliálnu aktiváciu v poškodenom striate. Zvieratá dostávali vehikulum alebo 2FL po injekcii kolagenázy od 1. do 5. dňa. Zvieratá boli usmrtené v deň 5. Zvýšená imunoreaktivita IBA1 s de-ramifikovanou morfológiou bola zistená v poškodenom striatu (B vs. A). Liečba 2FL znížila imunoreaktivitu IBA (C vs. B). (D) 2FL významne znížil imunoreaktivitu IBA1 v poranenom mozgu. * p < 0,05,="" jednosmerný="" test="" anova="" plus="">

2.4. 2FL zmiernil infiltráciu CD4 plus lymfocytov do poškodených mozgov

Podávanie kolagenázy zvýšilo infiltráciu CD4 plus lymfocytov do poškodeného striata (obrázok 4B). V nepoškodenom striate neboli nájdené takmer žiadne bunky CD4 (obrázok 4A). Infiltrácia buniek CD4 do poškodeného striata bola zmiernená liečbou 2FL (obrázok 4C vs. obrázok 4B; p < 0.001,="" f2,="" 6="173.485," jednosmerná="" anova,="" obrázok="">

Obrázok 4. Post-liečba 2FL znížila infiltráciu CD4 plus lymfocytov do poškodeného mozgu. Reprezentatívne mikrofotografie demonštrujú imunoreaktivitu CD4 v (A) nepoškodenom striatu a (B) poranenom striatu od potkana, ktorý dostáva vehikulum pri malom (kalibrácia=50 um) a vysokom zväčšení (vložka, kalibrácia=10 um), ako aj (C) poškodené striatum od potkana dostávajúceho 2FL. (D) 2FL signifikantne znížené CD{{10}}}ir v poranenom mozgu (* p < 0,001,="">

spôsobom ANOVA).

2.5. 2FL rozdielne zmenila expresiu zápalových markerov M1 a M2 v ICH mozgoch

Striatálne tkanivá sa odobrali ôsmim potkanom (veh, n {{0}}; 2FL, n=4) v deň 5. Expresia zápalových markerov M1/M2 sa skúmala pomocou qRT-PCR. ICH významne zvýšilo expresiu M1 markera CD86 (obrázok 5A, p=0.005) a M2 markerov CD206 a TGF (obrázok 5B, C, p=0.005). 2FL nezmenila expresiu CD86 (obrázok 5A, p=0.356, dvojcestná ANOVA). Výrazne však upreguloval expresiu CD206 (obrázok 5B) a TGF na poškodenej strane (p < 0,05,="" nk="">

cistanche extrakt prínos

2.6. 2FL zmenil expresiu ER stresu a apoptotických markerov v mozgu ICH

Expresia ER stresu a apoptotických markerov sa skúmala u ôsmich potkanov (veh, n=4; 2FL, n=4). 2FL významne znížila expresiu PERK (obrázok 6A, p=0,016), IRE1 (obrázok 6B, p=0,018), CHOP (obrázok 6C, p=0,032) a SigmaR1 (Obrázok 6D, p=0.017) v poškodenom striate. 2FL nezmenila expresiu BIP (obrázok 6E, p=0.841) a ATF6 (obrázok 6F, p=0.403). Okrem toho expresia kaspázy3 bola významne znížená pomocou 2FL (obrázok 6G, p=0,029, t-test).

Obrázok 5. 2FL upreguloval expresiu M2 markerov v ICH mozgoch. ICH významne zvýšilo expresiu (A) M1 marker CD86 a M2 markerov (B) CD206 a (C) TGF (# p=0.005, obojsmerný ANOVA). (A) 2FL signifikantne upreguloval expresiu (B) CD206 a (C) TGF, ale nie (A) CD86 v poškodenom striate (* p < 0,05,="" nk="">

Obrázok 6. 2FL potlačil expresiu ER stresu a apoptotických markerov. Expresia (A) PERK, (B) IRE1, (C) CHOP, (D) SigmaR1 a (G) kaspáza3 bola významne inhibovaná 2FL v hemoragických mozgoch. Expresia (E) BIP a (F) ATF6 nebola zmenená 2FL. * p < 0.05.="" er,="" endoplazmatické="" retikulum;="" perk,="" proteínkináza="" r-podobná="" er="" kináza;="" ire1,="" enzým="" vyžadujúci="" inozitol="" 1;="" chop,="" homológny="" proteín="" viažuci="" zosilňovač="" ccaat;="" sigmar1,="" sigma="" 1="" receptor;="" atf6,="" aktivačný="" transkripčný="" faktor="">

cistanche doplnok