Časť 1: Mapovanie epigenomickej a transkriptomickej súhry počas formovania a vybavovania pamäti v súbore Hippocampal Engram Ensemble
Mar 15, 2022
Ďalšie informácie:{0}}
Asaf Marco1,2,*, Hiruy S. Meharena1,2, Vishnu Dileep1,2, Ravikiran M. Raju1,4, Jose Davila- Velderrain3, Amy Zhang2, Chinnakkaruppan Adaikkan1,2, Jennie Z. Young1,2, Fan Gao1, Manolis Kellis3,5, Li-Huei Tsai1,2,5,*
1Picower Institute for Learning andPamäť, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, USA.
2Department of Brain and Cognitive Sciences, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, USA.
3 Laboratórium počítačovej vedy a umelej inteligencie, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, USA.
4Division of Newborn Medicine, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, USA.
5Broad Institute of Harvard a MIT, Cambridge, Massachusetts, USA.
Kliknite naVitamínový obchod Cistanche a Cistanche na pamäť
Abstraktné
Epigenóm a trojrozmerná (3D) – genómová architektúra sa objavujú ako kľúčové faktory v dynamickej regulácii rôznych transkripčných programov potrebných pre neurónové funkcie. Tu používame systém značkovania závislý od aktivity u myší na určenie epigenetického stavu, 3D-genómovej architektúry a transkripčnej krajiny engramových buniek počas životnostiPamäťformovanie a odvolanie. Naše zistenia to ukazujúPamäťkódovanie vedie k epigenetickej primárnej udalosti, ktorá sa vyznačuje zvýšenou dostupnosťou zosilňovačov bez zodpovedajúcich transkripčných zmien.Pamäťkonsolidácia následne vedie k priestorovej reorganizácii veľkých chromatínových segmentov a interakciám promótor-enhancer. Nakoniec, s reaktiváciou, engramové neuróny využívajú podskupinu interakcií denovolong-range, kde sa primárne aktivované zosilňovače dostali do kontaktu s ich príslušnými promótormi, aby upregulovali gény zapojené do lokálnej translácie proteínov v synaptických kompartmentoch. Naša práca spoločne objasňuje komplexný prepis a Používatelia môžu prezerať, tlačiť, kopírovať a sťahovať text a dolovať údaje z obsahu v takýchto dokumentoch pre akademický výskum, vždy v súlade s úplnými podmienkami používania: http://www.nature. com/authors/editorial_policies/license.html#terms
*Koešpondencia s: marcoa@mit.edu. lhtsai@mit.edu.
Príspevky autora:
AM a L.-HT projekt vypracovali a navrhli. AM a AZ vykonali behaviorálne experimenty, ISH, imunofarbenie a analýzu MARIS. CA vykonala injekciu vírusu a imunofarbenie. AM a HSM uskutočnili experimenty ATAC-seq. AM a AZ uskutočnili jadrové experimenty RNA-seq. AM, HSM a VD vykonali pc-Hi-C a Hi-C experimenty. AM, HSM, VD, RMR a JDV vykonali analýzu ATAC-seq. AM, RMR, HSM, VD a FG vykonali analýzu jadrovej RNA-seq. AM, VD, HSM a RMR vykonali analýzu pc-Hi-C a Hi-C. Všetci autori pomáhali interpretovať údaje. AM, HSM, VD, RMR, JZY, MK a LHT napísali rukopis s prispením všetkých autorov. LHT poskytla nástroje a dohliadala na projekt.
Konkurenčné záujmy:
Autori nedeklarujú žiadne konkurenčné záujmy.
epigenomická krajina počas celej životnostiPamäťformovanie a pripomenutie v súbore hipokampálneho engramu.
Tvorba a uchovanie dlhodobých spomienok závisí od koordinovanej génovej expresie a syntézy synaptických proteínov1. Tieto molekulárne procesy pôsobia v rámci špecifickej populácie neurónov, označovaných ako engramové bunky2–4. Nedávne prístupy využívajúce expresiu reportérov závislú od aktivity poskytli rámec na skúmanie súboru engram5–8, ale molekulárne mechanizmy, ktoré riadiaPamäťskladovanie a vyberanie zostáva nedostatočne pochopené. Konkrétne, epigenetické modifikácie a 3D-genomická architektúra sa objavujú ako kľúčový faktor v dynamickej regulácii génovej expresie9–17 a čoraz viac sa uznáva ich význam pre funkciu, vývoj a ochorenie neurónov14, 16, 18
Tu sme použili myšací model cielenej rekombinácie v aktívnych populáciách (TRAP)5, 6, v ktorom sú aktivované neuróny exprimujúce proteín spojený s aktivitou regulovaný cytoskeletom, gén (Arc), trvalo označené indukovateľným spôsobom. Aktivované neuróny počasPamäťkódovanie, konsolidácia a vyvolanie boli roztriedené a podrobené sekvenovaniu jadrovej RNA (nRNA-seq), testu na chromatín prístupný transpozázou pomocou sekvenovania (ATAC-seq) a zachytávaniu konformácie chromozómov (Hi-C). Dokazujú to naše údajePamäťkódovanie vedie k zvýšeniu dostupnosti chromatínu v celom genóme bez očakávaných zmien v génovej expresii. Ďalej demonštrujeme, že neskorá fáza konsolidácie pamäte bola spojená s re-lokalizáciou veľkých chromatínových segmentov (pododdielov) z neaktívnych do permisívnych prostredí a reorganizáciou prostredia interakcie promótor-enhancer. Nakoniec reaktivácia neurónov počasPamäťstiahnutie je spojené s interakciami denovopromótor-enhancer, pričom sa využíva veľká podskupina zosilňovačov, ktoré boli aktivované počasPamäťkódovanie. Tieto interakcie promótor-enhancer sú spojené s výraznou zmenou v expresii génov zapojených do lokálnej syntézy proteínov a synaptickej morfogenézy.
Výsledky
Časová a priestorová identifikácia aktivovaných a reaktivovaných engramových buniek
Sledovanie neuronálnej aktivity v priebehu času bolo jednou z hlavných výziev pri štúdiu engramových buniek, pretože markery neuronálnej aktivity, známe ako okamžité skoré gény (IEG), sa vracajú na základnú úroveň krátko po indukcii1,2. Na prekonanie tohto obmedzenia sme využili model TRAP5,6, ktorý vyžaduje dva transgény, jeden, ktorý exprimuje CreERT2 z promótora Arc závislého od aktivity a jeden, ktorý umožňuje expresiu reportéra žltého fluorescenčného proteínu (eYFP) v Cre- závislým spôsobom. Podávanie tamoxifénu (TAM) myšiam TRAP má za následok trvalé označenie eYFP v aktivovaných neurónoch Arc. Bez TAM je CreERT2 zadržaný v cytoplazme a eYFP nie je exprimovaný (rozšírené údaje obr. 1a). TRAP myši boli podrobené klasickej Pavlovovej paradigme kontextového podmieňovania strachu (CFC) (obr. 1a), čo je bežne používaná metóda na štúdium averzívnych spomienok19. Približne 1,5–2 hodiny po vystavení FS sa odobrali mozgy, aby sa identifikovali i) RNA viažuce proteín fox-1 homológ 3 (Rbfox3), tiež známy ako NeuN plus a eYFP plus označené neuróny, ktoré boli aktivované počas počiatočnej expozície (aktivované -skoré), ktoré možno odlíšiť od ii) NeuN plus /eYFP- neaktivované neuróny v bazálnom stave (Basal) (obr. 1a). Po piatich dňoch, v neprítomnosti získavania, sme zhromaždili iii) NeuN plus /eYFP plus neuróny, ktoré boli označené v tréningový deň, čo znamená dlhodobéPamäťkonsolidácia (Aktivovaná-neskoro). V
v inej kohorte boli myši opätovne vystavené podmienenému stimulu a následná expresia endogénneho proteínu ARC sa testovala 1, 5–2 hodiny po opätovnej expozícii. To umožnilo identifikáciu iv) dvojito pozitívnych NeuN plus /eYFP plus / endogénnych Arc plus engram neurónov, ktoré boli aktivované počas tréningu a reaktivované počasPamäťvyvolať (Reaktivované). Pozoruhodné je, že hoci rekombinácia DNA nemusí úplne nastať 1,5–2 hodiny po FS, pozorovali sme vysokú ko-lokalizáciu (v priemere 84 percent) medzi endogénnym proteínom Arc a reportérom Arc:eYFP (rozšírené údaje, obr. 1b), čo bolo tiež v súlade s predchádzajúcimi správami20.
Na potvrdeniePamäťkódovanie a vyvolávanie počas CFC, mrazivé správanie bolo zaznamenané počas tréningu a opätovného vystavenia podnetom vyvolávajúcim strach (rozšírené údaje obr. 1c). V súlade s predchádzajúcimi publikáciami6,20 naše údaje ukázali významný nárast počtu eYFP plus (aktivovaných skorých a neskorých) neurónov v hipokampe v porovnaní s myšami, ktoré zostali naivné voči CFC vo svojej domácej klietke (F (2, 70)=240.3, str<0.0001, fig.="" 1b).="" activity-dependent="" tagging="" was="" also="" negligible="" (~1%)="" in="" the="" absence="" of="" tam="" induction="" (fig.="" 1c,="" extended="" data="" fig.="" 1d).="" with="" tamoxifen="" treatment,="" we="" observed="" a="" wide="" distribution="" of="" activity-labeled="" populations="" across="" all="" hippocampal="" sub-regions,="" where="" early="" activation="" was="" predominantly="" observed="" in="" the="" dg="" and="" late="" tagging="" was="" most="" abundant="" in="" the="" ca1="" (fig.="" 1d).="" to="" further="" interrogate="" the="" specificity="" of="" engram="" formation,="" we="" subjected="" trap="" mice="" to="" cfc="" learning="" in="" context="" a="" and="" then="" exposed="" them="" 5="" days="" later="" to="" the="" same="" context="" (a-a)="" or="" a="" novel="" neutral="" context="" b="" (a-b)="" (fig.="" 1e,="" extended="" data="" fig.="" 1e).="" we="" found="" comparable="" numbers="" of="" activated="" –late="" neurons="" in="" both="" groups="" (p="0.9)" and="" significantly="" fewer="" reactivated="" neurons="" in="" the="" a-b="" group=""><0.0001, fig.="" 1f;="" extended="" data="" fig.="" 1f),="" confirming="" that="" the="" reactivated="" cells="" play="" a="" key="" role="" in="" encoding="" prior="">
Tvorba pamäte je spojená so zvýšenou dostupnosťou chromatínu, predovšetkým na zosilňovačoch
Aby sme lepšie pochopili molekulárne sily, ktoré riadia rôzne transkripčné programy, merali sme zmeny v dostupnosti chromatínu v rôznych fázach celého genómu.Pamäť. Hipokampálne tkanivá sa spojili a izolované jadrá (rozšírené údaje obr. 2a, doplnková tabuľka 1) sa podrobili príprave knižnice ATAC-seq. Analýza diferenčne prístupných oblastí (DAR) (Diffbind, režim DESeq2) medzi všetkými populáciami (obr. 2a) odhalila, že väčšina zmien v chromatínovom stave sa vyskytuje počas skorej fázy tvorby pamäte, kde 7,862 oblastí naprieč genómom pribúda dostupnosť (Bazálna vs. skorá, doplnková tabuľka 2). Na rozdiel od toho sme pozorovali relatívne minimálne zmeny v chromatínovom stave pri prechode z Activated-early na Activated-Late (582 DAR) a medzi Activated-Late a Reactivated neurónmi (725 DAR), pričom medzi nimi došlo k 48-percentnému prekrytiu (Rozšírené údaje Obr. 2b ). Je pozoruhodné, že sme identifikovali veľké percento (52 percent) stabilne získaných DAR, ktoré sa stali dostupnejšími v aktivovaných-skoro a zostali prístupné v aktivovaných-neskorých aj reaktivovaných neurónoch (obr. 2b, c; doplnková tabuľka 2). Je zaujímavé, že kým skoré zmeny (Basal vs. Skoré) a stabilne získané DAR boli obohatené o intergénne oblasti, neskoré zmeny chromatínu (Skoré vs. neskoré a Neskoré vs. Reaktivované) boli väčšinou obohatené o promótorové miesta (obr. 2d).
Funkčný prehľad bol poskytnutý hodnotením toho, ako sú DAR označené rôznymi modifikáciami histónov. Najprv sme použili ChromHMM na vytvorenie modelu chromatínového stavu z dvoch nezávislých štúdií, ktoré využívali objemové tkanivo hipokampu pred a po šoku nohy 21, 22. Ďalej sme vykonali analýzu násobného obohatenia (pozorovanú nad očakávanou distribúciou) DAR pre tieto rôzne stavy a odhalili sme, že skoré zmeny chromatínu a stabilné DAR boli obohatené o značky zosilňovačov (obr. 2e; rozšírené údaje obr. 2c, doplnková tabuľka 3) .
Tieto výsledky sú v súlade s predchádzajúcimi publikáciami, ktoré ukazujú, že stimulácia primárnej neurónovej kultúry indukuje predĺženú aktivitu zosilňovača12,23. Ďalej sme analyzovali prekrývanie jednotlivých stabilných lokusov s H3K4me1 a H3K27ac21. Tieto dve histónové značky vymedzujú rôzne populácie zosilňovačov, ktoré môžu byť buď „primované“ (iba H3K4me1), „aktívne“ (H3K4me1 a H3K27ac) alebo „latentné“ (bez značiek)18. Stabilné vrcholy vykazovali distribúciu medzi aktivovanými aj aktívnymi zosilňovačmi (rozšírené údaje, obr. 2d), kde sa predpokladalo, že 47 percent týchto miest je „latentných“ (bez prekrývania medzi DAR a histónovými značkami21 získanými 1 hodinu po FS). Na potvrdenie nášho modelu sme vykonali chromatínovú imunoprecipitáciu (ChIP) pre histónové markery H3K4me1 a H3K27ac, po ktorej nasledovala qPCR. Z našej predpokladanej modelovacej analýzy zosilňovača boli vybrané štyri vybrané miesta (rozšírené údaje, obr. 2d; zosilňovač 1 – predpokladaný aktivovaný, Enhancer 2- predpokladaný aktívny, zosilňovač 3 a 4 – predpokladaný latentný). V súlade s naším modelom sme identifikovali dva „latentné“ lokusy v bazálnom stave (enhancery 3 a 4), ktoré sa pretransformovali do „aktívneho“ stavu počasPamäťformácie (obr. 2f). Okrem toho sa zistilo, že predpokladaný zosilňovač 1 bol „primovaný“ v bazálnom stave a stal sa aktívnym, kde došlo k významnému stabilnému zvýšeniu markerov H3K27ac počas neskorej fázy a odvolania (obr. 2f). Tieto údaje spolu naznačujú, že repertoár novo dostupných zosilňovačov sa rozšíril v potencovaných engramových neurónoch, kde latentné alebo primované oblasti získali značky H3K4me1 a H3K27ac, a tak sa stali aktívnymi zosilňovačmi.
Aby sme pochopili funkčnú úlohu dostupných oblastí promótorov a zosilňovačov, vykonali sme analýzu obohatenia motívov (doplnková tabuľka 4). Naše údaje naznačujú, že väčšina (70 percent) motívov na dostupných promótoroch je rovnako obohatená a boli identifikované vo všetkých fázachPamäť(Rozšírené údaje Obr. 2e). Na rozdiel od toho väčšina miest zosilňovačov vykazovala odlišné vzory motívov viažucich transkripčný faktor (TF) v rôznych pamäťových fázach. Je zaujímavé, že všadeprítomne vyjadrené motívy z protoonkogénu Jun, podjednotky transkripčného faktora Ap{3}} (tj Jun-Ap1) a rodiny TF regulačných faktorov X (Rfx) boli významne obohatené až po počiatočnej fáze kódovanie (rozšírené dáta obr. 2e). Už skôr sa uvádzalo, že komplex Jun-Ap1 hrá ústrednú úlohu pri výbere zosilňovačov a môže pôsobiť ako priekopník TF na definovanie miest zosilňovačov počas vývoja mozgu a neuronálnej aktivity12, 24. Tieto zistenia sú v súlade s našimi údajmi, ktoré ukázali vysoké percento latentných/primovaných lokusov v bazálnom stave (obr. 2f, rozšírené údaje, obr. 2c, d). Zdá sa teda, že neurónová aktivita môže spustiť väzbu Jun-Ap1 na latentné zosilňovače, ktoré potom získavajú modifikátory chromatínu, ktoré aktivujú latentné zosilňovače. Podobne obohatenie motívov transkripčného faktora Yin Yang 1 (Yy1) iba v zosilňovačoch zo skorých a neskorých stavov naznačuje, že organizácia promótor-enhancér je aktívnym procesomPamäťformácie, ako sa nedávno uvádzalo, že Yy1 uľahčuje tvorbu týchto interakcií na veľké vzdialenosti25. Súhrnne tieto údaje naznačujú, že počiatočná fázaPamäťtvorba mení krajinu dostupnosti chromatínu v aktivovaných neurónoch, pričom dlhotrvajúce stabilné zmeny sa vyskytujú prevažne v oblastiach zosilňovača.
Dynamické zmeny v priestorovej jadrovej architektúre a dostupnosti chromatínu počas počiatočného obdobiaPamäťtvorba korešponduje so zvýšenou frekvenciou interakcií promótor-enhancer počasPamäťodvolať
Jadrová 3D architektúra sa objavuje ako kľúčový faktor v dynamickej regulácii génovej expresie v mnohých neurónových funkciách26–28. Preto nás zaujímalo vymedzenie presných zmien, ktoré sa vyskytujú v organizácii priestorového chromatínu počasPamäťformovanie a konsolidáciu. Vytvorili sme údaje Hi-C z bazálneho stavu a eYFP plus označených neurónov (skoré a neskoré, doplnková tabuľka 5). Chromatín je segregovaný do dvoch priestorovo odlišných subjadrových kompartmentov, „A“ a „B“, zodpovedajúcich transkripčne aktívnemu a neaktívnemu chromatínu15, 16,26. Skoré dôkazy naznačujú, že neuronálna aktivita a vonkajšia signalizácia môžu vyvolať reorganizáciu architektúry 3D-chromatínu14, 27, 28. Naša analýza stavu kompartmentu15, 16,26 (obr. 3a–c) odhalila re-lokalizáciu veľkých chromatínových segmentov z neaktívneho (B) do permisívneho prostredia (A) (a naopak) počas počiatočnej a neskorej fázyPamäťformácia (212 segmentov prešlo z A do B, 127 z B do A, priemerná veľkosť ~ 436 Kbp). Je zaujímavé, že 52 percent regiónov v ranej fáze, ktoré prešli z B do A, si udržalo tento stav v neskorej fáze (tj zostalo v stave A, obr. 3b, c; doplnková tabuľka 6). Navyše, takmer všetky tieto oblasti sa prekrývali so získanými DAR z našej analýzy ATAC-seq, čo potvrdzuje prechod pododdelenia z neaktívneho prostredia do tolerantného prostredia (obr. 3d). Tieto údaje naznačujú, že niektoré lokusy podstupujú prepínanie podkompartmentov v rôznych pamäťových fázach, a preto môžu prispievať k dlhodobým zmenám v neuronálnych vlastnostiach a funkciách po počiatočnej aktivácii.
Zatiaľ čo naše údaje Hi-C naznačovali rozsiahlu reorganizáciu, zostalo nejasné, či táto zmena orientácie umožnila interakciu nových repertoárov promótor-enhancer a jemné doladenie rôznych transkripčných programov (obr. 3e). Využitím techniky promótor-zachytenie Hi-C (pc-HiC) sme študovali presné zmeny, ktoré sa vyskytujú v interakciách promótor-enhancer počas procesuPamäťformovanie a odvolanie. Pre túto štúdiu sme použili na mieru navrhnuté „návnady“ zacielené na približne 5000 promotérov29. V súlade s predchádzajúcimi publikáciami29 sme zistili ~19 000 (na skupinu) významných interakcií promótor-zosilňovač (67,5 percenta) a promótor-promótor (46,2 percenta) (rozšírené údaje obr. 3a, b).
Pretože promótory v mozgu cicavcov by mohli byť pod kontrolou viacerých regulačných prvkov14, 30, 31, analyzovali sme prekrytie medzi všetkými interagujúcimi zosilňovačmi a ich príslušnými promótormi. Zistili sme, že počas každéhoPamäťfázy, tie isté promótory interagujú častejšie s odlišnou podskupinou zosilňovačov (tj jedinečný, bazálny – 3243, skorý - 7602, neskorý - 7028, reaktivovaný – 7244; obr. 4a,b; rozšírené údaje obr. 3c; Doplnková tabuľka 7). Tento výsledok je v súlade s predchádzajúcimi publikáciami, ktoré ukazujú, že viaceré zosilňovače obklopujúce niekoľko génov (c-Fos a Arc) sú kľúčové pre ich aktiváciu a frekvencia ich interakcie s ich príslušnými promótormi sa mení v reakcii na rôzne depolarizujúce činidlá v kultivovaných neurónoch31. Identifikovali sme tiež menšiu podskupinu interakcií, v ktorých promótory interagovali s rovnakými zosilňovačmi naprieč rôznymi spôsobmiPamäťfázy (tj bežné, ~ 31 percent všetkých interakcií; doplnková tabuľka 7). Okrem toho, reaktivované neuróny vykazovali výrazne silnejšie interakčné skóre (ako vypočítalo Chicago, obr. 4b; rozšírené údaje obr. 3d). Preto, hoci počet jedinečných interakcií bol podobný v skorých, neskorých a reaktivovaných stavoch, silnejšie interakčné skóre naznačujú, že špecifické interakcie promótor-enhancer sa vyskytujú častejšie počas pamäte.
odvolať. Táto predstava bola ďalej potvrdená experimentmi 3C s primérmi navrhnutými na meranie frekvencie interakcie medzi vybraným zosilňovačom (E) a génovými promótormi (P), ktoré kódujú podjednotku D eukaryotického faktora 3 iniciácie translácie (Eif3d) alebo glutamátový receptor, ionotropný kainát. 3 (Grik3) (obr. 4c). Naše údaje ukázali, že reaktivované neuróny mali v porovnaní s inými populáciami významné zvýšenie frekvencie interakcie medzi promótorom Eif3d a vybraným zosilňovačom (obr. 4c). Súhrnne tieto údaje naznačujú, že interakcie promótor-enhancer sa vyskytujú častejšiePamäťodvolať.
Ďalej sme sa pýtali, či dynamické interakcie s dlhým dosahom identifikované prostredníctvom pc-HiC zodpovedajú oblastiam chromatínu, ktoré sa stanú dostupnejšími, ako sa určilo pomocou ATAC-seq. To by potvrdilo, že zvýšená dostupnosť má funkčný dôsledok pri vytváraní nových interakcií promótor-zosilňovač. Aby sme to dosiahli, porovnali sme prekrytie medzi interagujúcimi zosilňovačmi v každej bunkovej populácii s DAR (pozorované) alebo náhodným súborom dostupných genómových lokusov (očakávané). Naša analýza odhalila významné prekrytie medzi oboma získanými DAR v aktivovaných skorých neurónoch a stabilne získanými DAR s interagujúcimi zosilňovačmi vo všetkých populáciách buniek (všetky P < 0.0001,="" rozšírené="" údaje,="" obr.="" 3e).="" na="" rozdiel="" od="" toho="" zmeny="" v="" dostupnosti="" chromatínu,="" ku="" ktorým="" došlo="" počas="" neskorej="">Pamäťkonsolidácia a reaktivácia sa významne neprekrývali s interagujúcimi zosilňovačmi (rozšírené údaje, obr. 3e). Tieto výsledky spoločne naznačujú, že zisk prístupnosti počas kódovania pamäte je primárnou udalosťou a tieto primované lokusy sa zapájajú do de-novo funkčných interakcií promótor-zosilňovač počas neskorších fázPamäťtvorenie. Táto dynamická krajina je ilustrovaná vizualizáciou genómových oblastí okolo génu eukaryotického translačného iniciačného faktora 5 podjednotky A (Eif5a) (obr. 4d). Táto dočasná molekulárna disekcia životnosti engramu zdôrazňuje, ako koordinované primovanie epigenetického stavu bunky počasPamäťkódovanie a konsolidácia uľahčuje interakcie na veľké vzdialenosti počas reaktivácie.
