ČASŤ 1 Odhalenie vplyvu životného prostredia na Cistanche Salsa: Od globálnej ekologickej regionalizácie k pôdnym mikrobiálnym charakteristikám komunity

ABSTRAKT:Pochopiť regulačný vzťah medzi prostredím aCistanche salsa, tu sme integrovali metódy makro a mikro dimenzií. Z makro pohľadu model MaxEnt naznačil, že krajiny pozdĺž iniciatívy Belt and Road, ako napríklad Čína, Egypt a Líbya, boli obzvlášť vhodné na rastC. salsaod staroveku (posledné glaciálne maximum a stredný holocén) do budúcnosti (2050 a 2070). Jackknife test odhalil, že zrážky sú dôležitým ekologickým faktorom, ktorý ovplyvňuje rozšírenie C. salsa. Z makro perspektívy údaje zo sekvenovania amplikónu 16S rRNA ukázali, že spoločenstvá pôdnych mikroorganizmov troch ekotypov (púšť-step, trávnaté porasty a štrk-púšť) boli výrazne odlišné (p < 0,001).="" analýza="" jadrového="" mikrobiómu="" ukázala,="" že="" bakteriálne="" rody="" arthrobacter,="" sphingomonas="" a="" bacillus="" boli="" obohatené="" o="" základné="">C. salsa. LEfSe a náhodný les sa použili na vykopanie Gillisia (púštna step), Flaviolibacter (trávne porasty) a Variibacter(štrková púšť) ako biomarkery, ktoré dokážu rozlíšiť medzi mikrobiálnymi spoločenstvami z troch ekotypov. Predikčný profil ukázal, že metabolická funkcia mikrobiálnej komunity bola obohatená o metabolické dráhy a spracovanie environmentálnych informácií. Korelačné analýzy odhalili, že nadmorská výška, zrážky v najteplejšej štvrti (bio18), priemerný denný rozsah (bio2) a priemerná teplota najteplejšej štvrti (bio10) boli dôležitými ekologickými faktormi, ktoré ovplyvňujú zloženie pôdnych mikrobiálnych spoločenstiev. Táto práca poskytla nový pohľad na regulačný vzťah medzi vhodnou distribúciouC. salsa, pôdne mikrobiálne spoločenstvá a ekologické faktory. Navyše to prehĺbilo pochopenie interakcie medzi púštnymi rastlinami a ekologickými faktormi v suchom prostredí.

KĽÚČOVÉ SLOVÁ:Cistanche salsa, MaxEnt, sekvenovanie amplikónu 16S rRNA, pôdna mikrobiálna komunita, vplyv na životné prostredie.

Cistanche deserticola má mnoho účinkov, kliknite sem a dozviete sa viac

Pre viac informácií kontaktujte:Joanna.jia@wecistanche.com

1. ÚVOD

Ekonomická hodnota liečivých rastlín sa v posledných rokoch rapídne zvýšila s celosvetovým rozvojom a využívaním prírodných rastlín. Dužinatá stonkaCistanche salsaje jedlý a liečivý rastlinný orgán, ktorý sa bežne používa ako obličkové tonikum, afrodiziakum, kúra proti starnutiu a proti oxidácii, črevné preháňadlo, kúra na ochranu pečene a kúra proti ožiareniu. Moderné fytochemické štúdie na C. salsa viedli k identifikácii a izolácii značného množstva bioaktívnych zlúčenín, ako sú rôzne fenyletanoidové glykozidy, iridoidy, alditoly a lignín, ktoré majú dôležité medicínske a jedlé hodnoty.1 S rýchlym rozvojom trhu pre lieky a zdravé potraviny, dopyt poC. salsasa prudko zvýšil a je sprevádzaný nadmerným využívaním a drancovaním divokých zdrojov. Preto rozsiahle umelé zavádzanie a pestovanieC. salsasa stali dôležitým opatrením na ochranu divokých zdrojov a pomalú ekologickú dezertifikáciu. Avšak výskum o umelom pestovaníC. salsazostáva obmedzený.

Životné prostredie má obrovský vplyv na rast a vývoj C. salsa.2 Rastliny rastú v rôznych prostrediach, vytvárajú rôzne ekotypy, ktoré vykazujú významné zmeny v neaktívnych zložkách a expresii génov.3,4 Na makroúrovni výskum zistil, že teplota, svetlo, zrážky a typy pôdy majú vplyv na rast rastlín a ich aktívne zložky.5,6 Štúdium interakcie medzi prostredím a rastlinami a komplexná charakterizácia rôznych ekotypov rastlín sú prospešné pre výber a pestovanie vysokých -kvalitné odrody.7 Z makrohľadiska môžu mať rastliny značný vplyv na pôdne organizmy, aj keď majú malý alebo žiadny priamy kontakt s pôdnym systémom cez korene.8,9 Súčasný výskum vzťahu medzi rastlinami a prostredie vrátane klimatických faktorov a pôdneho mikrobiálneho spoločenstva je stále nejasné.

Model distribúcie druhov (SDM) je štatistický model, ktorý bol vytvorený pomocou existujúcich údajov o distribúcii druhov a environmentálnych premenných na odvodenie ekologických potrieb druhov a projektovanie oblastí ich potenciálneho rozšírenia,10,11 preskúmanie vhodných oblastí rastu kombináciou klimatických a pôdnych faktorov, určovať vhodné prostredie pre liečivé rastliny a vedecky chrániť a pestovať ohrozené rastliny.12,13 SDM, ako sú MaxEnt a biomod2, úspešne reagovali na predpovede distribučných trendov kladených na ohrozené a ekologické rastliny počas klimatických zmien.14,15

Sekvenovanie amplikónov 16S rRNA vzoriek pôdy z rizosféry rastlín sa uskutočnilo s cieľom preskúmať diverzitu mikrobiálnych spoločenstiev, čo poskytuje nový pohľad na vzťah medzi rastlinami a pôdnymi mikrobiálnymi spoločenstvami.16,17

V tejto štúdii sme skúmali vzťah medzi prostredím aC. salsaz makro- a mikro dimenzií. Vykonali sme nasledovné. (1) Použili sme model MaxEnt na predpovedanie oblastí globálneho vhodného rastuC. salsaod staroveku do budúcnosti (päť období: posledné ľadovcové maximum [LGM], stredný holocén [MH], súčasnosť, 2050 a 2070) a vypočítali vhodné oblasti rôznych úrovní a mieru príspevku a rozsah bioklimatických premenných ovplyvňujúcich distribúciaC. salsa.(2) V kombinácii s prácou v teréne sme zozbierali vzorky pôdy troch ekotypov (púštna step, trávnatá plocha a štrková púšť) z najlepšie pestovateľskej oblasti (Tacheng a Xinjiang)

C. salsa. Vykonali sme sekvenovanie amplikónu 16S rRNA, aby sme preskúmali charakteristiky pôdnych mikrobiálnych spoločenstiev. Porovnali sme tiež rozdiely v pôdnych mikrobiómoch v troch ekotypoch a určili sme základné mikrobiómy a biomarkery, ktoré by mohli rozlišovať medzi týmito tromi ekotypmi. (3) Vykonali sme korelačnú analýzu a redundantnú analýzu na základe množstva základných mikrobiómov, biomarkerov a bioklimatických premenných, aby sme preskúmali regulačný vzťah medziC. salsaa životné prostredie.

Cistanchemá mnoho účinkov proti únave

2. MATERIÁLY A METÓDY

2.1. Ekologické modelovanie výklenkov.

V tomto výskume bolo použitých päť zdrojov na vyhľadávanie súčasných lokalítC. salsacelosvetovo: (1) GBIF ; (3) Národná vzorová informačná infraštruktúra (4) publikovaná literatúra; a (5) práca v teréne. Vzorové údaje bez zemepisnej šírky a dĺžky boli založené na online dotaze na zemepisnú šírku a dĺžku na mape. Metóda vyrovnávacej pamäte bola použitá na kontrolu a filtrovanie získaných distribučných bodov, aby sa eliminoval efekt simulácie preplnenia spôsobenej veľkou priestorovou koreláciou. Priestorové rozlíšenie bioklimatických premenných bolo 2,5 oblúkovej minúty (asi 4,5 km2) a vzdialenosť nárazníka bola nastavená na 3 km. Len jeden distribučný bod bol zachovaný, keď bola vzdialenosť medzi distribučnými bodmi menšia ako 3 km. Po odstránení duplicitných bodov sa zhromaždilo a použilo na analýzu 76 výskytov, všetky z oblasti skutočnej produkcie C. salsa (obrázok 1a, doplnkový súbor 1).

Použili sme 19 bioklimatických premenných WorldClim ako environmentálnych prediktorov. Súčasné údaje o bioklimatických premenných tejto štúdie boli zozbierané z monitorovacích údajov databázy WorldClim verzie 1.418 počas rokov 1960–1990 s rozlíšením 2,5 oblúkovej minúty. Staroveké (LGM a MH) a budúce (budúcnosť 2050 a budúcnosť 2070) bioklimatické premenné dostupné vo WorldClim verzii 1.4 s rozlíšením 2,5 oblúkových minút boli použité ako prediktory modelov distribúcie druhov. Aby sme sa vyhli multikolinearite, vykonali sme korelačnú analýzu bodov pozadia a eliminovali sme jednu z premenných v každom páre pomocou Pearsonovej

hodnota korelácie > 0,819 (obrázok S1). Osem bioklimatických premenných nakoniec zahrnutých do modelov bolo priemerný denný rozsah (bio2), priemerná teplota najvlhkejšej štvrti (bio8), priemerná teplota najsuchšej štvrti (bio9), priemerná teplota najteplejšej štvrti (bio10) ročné zrážky (bio12), zrážky v najsuchšej štvrti (bio17), zrážky v najteplejšej štvrti (bio18) a zrážky v najchladnejšej štvrti (bio19).

Použili sme model maximálnej entropie softvérového balíka s otvoreným zdrojovým kódom (MaxEnt v.3.4.0),20 ktorý je možné stiahnuť na vytvorenie modelu distribúcie druhov preC. salsa. V základných nastaveniach boli použité nasledujúce parametre: náhodné semeno a náhodné testovacie percento 25 a 10 opakovaní. Nastavením percenta náhodného testu na 25 percent sme náhodne vybrali 75 percent distribučných bodov pre tréningovú množinu. Nastavením počtu replikátov na 10 sme model spustili 10-krát s rovnakými nastaveniami a spriemerovali sme výstup všetkých cyklov, aby sme získali konečný výsledok. Oblasť pod krivkou prijímajúceho operátora (AUC) sa použila na vyhodnotenie dobrej zhody modelu a model s najvyššou hodnotou AUC sa považoval za najlepší. Na posúdenie dôležitosti premenných bola použitá procedúra jackknife. Krivky odozvy sa použili na získanie rozsahu bioklimatických premenných.

ArcGIS sa použil na analýzu bioklimatických premenných, ktoré ovplyvňujú rozšírenie C. salsa a na klasifikáciu a výpočet oblasti vhodnej na produkciu.

2.2. Zber vzoriek pôdy a popis. C. salsa

je prirodzene distribuovaný v troch ekotypoch štrko-púšť, trávnaté porasty a púštne stepi. V apríli 2017 sme odobrali vzorky mäsitých stoniek a pôdy predstavujúce hlavné ekotypy C. salsa v Tacheng, Xinjiang, Čína (obrázok 1b, tabuľka 1). Vzorky štrkovej púšte sa odobrali z Hejiaoke, okres Toli (HJ1, HJ2 a HJ3). Vzorky trávnych porastov sa odobrali z okresu Yumin (YM1, YM2, YM3 a YM4). Vzorky z púšte a stepí boli odobraté z Jiang Alhan (JA1, JA2, JA3, JA4, JA5 a JA6). Všetky vzorky pôdy, ktoré sme odobrali, pochádzajú z pôdy na povrchu C. salsa a jej hostiteľskej parazitickej lokality. Poukazové exempláre s

čísla poukazov od 20170510079-DT do 20170510091-DT boli uložené v herbári Inštitútu vývoja liečivých rastlín pri Čínskej akadémii lekárskych vied v Pekingu, Čína. Po vyčistení boli sukulentné kmeňové tkanivá narezané na malé kúsky, okamžite zmrazené v tekutom dusíku a potom skladované pri teplote -80 stupňov až do ďalšieho spracovania. Pôdne jadrá sa odobrali v hĺbke 20 cm pomocou

nerezová valcová vŕtačka s priemerom 5 cm a následne uskladnená pri −20 stupňoch v prenosnej chladničke. Po prevoze do laboratória vzorky pôdy prešli cez 2 mm sito, aby sa odstránili rastlinné tkanivá, korene, kamene a iné nečistoty, a potom sa pred ďalšími experimentmi skladovali pri teplote -20 stupňov v chladničke.

2.3. Extrakcia DNA a sekvenovanie 16S rRNA.

DNA pôdy bola extrahovaná pomocou súpravy PowerSoil DNA Isolation Kit (MoBio Laboratories, Carlsbad, CA) v súlade s manuálom. Čistota a kvalita genómovej DNA sa kontrolovala na 0,8 % agarózových géloch. Hypervariabilná oblasť V3-4 bakteriálneho génu 16S rRNA bola amplifikovaná primérmi 338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) a 806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT).21 Pre každú vzorku pôdy sa k sekvencii čiarového kódu 5 pridala 10-miestna ′ koniec dopredného a spätného priméru (Allwegene Co., Peking). PCR sa uskutočnila na zariadení Mastercycler Gradient (Eppendorf, Nemecko) s použitím 25 μl reakčných objemov obsahujúcich 12,5 μl KAPA 2G Robust HotStart ReadyMix, 1 μl forwardového primeru (5 μM), 1 μl reverzného primeru (5 μM), 5 μl DNA (celkové množstvo templátu je 30 ng) a 5,5 μl H2O. Parametre cyklovania boli nasledovné: 95 stupňov počas 5 minút, po ktorých nasledovalo 28 cyklov 95 stupňov počas 45 s, 55 stupňov počas 50 s a 72 stupňov počas 45 s, s konečným predĺžením pri 72 stupňoch počas 10 minút. Tri produkty PCR na vzorku sa spojili, aby sa zmiernili odchýlky PCR na reakčnej úrovni. Produkty PCR sa purifikovali pomocou súpravy QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Nemecko) a potom sa kvantifikovali pomocou PCR v reálnom čase. Hlboké sekvenovanie sa uskutočnilo na platforme MiSeq od Allwegene Co. (Peking). Po behu sa vykonala analýza obrazu, volanie bázy a odhad chýb pomocou analýzy Illumina Analysis Pipeline verzie 2.6.

2.4. Analýza údajov sekvenovania 16S rRNA amplikónu.

Všetky údaje o sekvenovaní boli odoslané do krátkeho archívu NCBI (SRA) pod predložením SRA SUB7456002. Najprv sa skrínovali nespracované dáta a sekvencie sa odstránili na základe nasledujúcich úvah: sekvencie kratšie ako 200 bp so skóre nízkej kvality (menšie alebo rovné 20) a obsahujúce nejednoznačné bázy alebo nezhodujúce sa sekvencie primérov a značky čiarového kódu. Kvalifikované hodnoty boli oddelené pomocou sekvencií čiarových kódov špecifických pre vzorku a orezané pomocou Illumina Analysis Pipeline Version 2.6. Potom sa súbory údajov analyzovali pomocou QIIME. Sekvencie boli zoskupené do operačných taxonomických jednotiek (OTU) na úrovni podobnosti 97 percent22, aby sa vytvorili krivky riedenia a vypočítali sa indexy bohatosti a diverzity. Nástroj Ribosomal Database Project Classifier sa použil na klasifikáciu všetkých sekvencií do rôznych taxonomických skupín, v ktorých je prah spoľahlivosti nastavený na 0,7,23 Klastrovacie analýzy sa vykonali na základe informácií OTU z každej vzorky pomocou R 3.6.1 na preskúmanie podobnosť medzi rôznymi vzorkami.24 Matica vzdialeností UniFrac medzi mikrobiálnymi komunitami z každej vzorky bola vypočítaná pomocou Taycovho koeficientu a reprezentovaná ako nevážená metóda párových skupín s aritmetickým priemerom zhlukovacieho stromu, ktorý popisuje odlišnosť (1- podobnosť) medzi Viacnásobné vzorky.25 Prostredníctvom tejto analýzy bol tiež vytvorený stromový súbor vo formáte Newick. Alfa diverzita sa použila na analýzu zložitosti druhovej diverzity pre vzorku pomocou štyroch indexov, konkrétne Chao1, pozorované druhy a Shannon a Fisher.

indexy diverzity. Tieto indexy boli vypočítané pomocou softvéru QIIME (Boulder, CO, USA) v Pythone (v.1.8.0) (La Jolla, CA, USA).26 Na vyhodnotenie rozdielov vo vzorkách z hľadiska druhová zložitosť. Beta diverzita bola vypočítaná pomocou hlavnej súradnicovej analýzy (PCoA) a zhlukovej analýzy v QIIME.27 Analýza molekulárnej variancie (AMOVA) bola vykonaná s použitím matky.28 Kruskal-Wallisov test sa použil na výpočet OTU rozdielu medzi skupinami (p-hodnota<0.05), and="" heat="" maps="" were="" drawn="" using="" pheatmap="" (r="" package).="" core="" microbiome="" analysis="" was="" adopted="" from="" the="" core="" function="" in="" the="" r="" package="" microbiome="" (sample="" prevalence="20%," relative="" abundance="0.01%)" by="" microbiomeanalyst29="" (https://www.="">

Na určenie biomarkerov mikrobiómov sa použili metódy lineárnej diskriminačnej analýzy (LDA) a náhodného lesa (RF) na webovej stránke MicrobiomeAnalyst. Najprv sa vykonal neparametrický faktoriálny Kruskal-Wallisov sum-rank test, aby sa identifikovali znaky s významným rozdielnym výskytom vzhľadom na experimentálny faktor alebo záujmovú triedu. Ďalej sa vykonalo LDA (prah je nastavený na 2), aby sa vypočítala veľkosť účinku každého rozdielne bohatého prvku. Vlastnosti sa považovali za významné na základe ich upravenej p-hodnoty. Predvolená upravená medzná hodnota p-hodnoty bola 0,05. RF analýza sa uskutočnila pomocou balíka randomForest5. Táto metóda využíva súbor klasifikačných stromov, z ktorých každý sa pestuje náhodným výberom prvkov zo vzorky bootstrapu v každej vetve.

Tax4Fun (balík R, http://tax4fun.gobics.de/) sa použil na predpovedanie mikrobiálnych funkčných profilov mikrobiómov vo vzorkách pôdy. Tabuľka OTU Biom pôdneho mikrobiómu bola použitá ako vstupný súbor pre imputáciu metagenómu vzoriek pôdy C. salsa. Potom sa predpovedané početnosti génových tried analyzovali na úrovni skupiny KEGG Orthology (KO) 3. Výsledky z Tax4Fun sa analyzovali v Doby (R balík).

2.5. Korelačná analýza kľúčových mikrobiálnych spoločenstiev a bioklimatických faktorov.

Použili sme ArcGIS na číselnú extrakciu kľúčových bioklimatických faktorov z 13 miest odberu vzoriek pôdy. Redundantná analýza kľúčových rodov mikrobiálnych spoločenstiev (päť biomarkerov, päť jadrových mikrobiómov) a bioklimatických faktorov sa uskutočnila pomocou

Softvér Canoco 5. Konverzia údajov log2 sa pred analýzou jednotne uskutočňovala. Spearmanove korelačné koeficienty sa vypočítali pre množstvo piatich biomarkerov, piatich základných mikrobiómov a integráciu údajov o bioklimatickom faktore pomocou aplikácie SPSS. Výsledky korelačnej analýzy boli nakreslené pomocou pheatmap (balík R).

Cistanchedokáže odolávať starnutiu

3. VÝSLEDKY

Predikcia globálneho posunu distribúcie C. salsa v rôznych obdobiach. Ukázalo sa vypočítané ROC

že hodnota AUC bola {{0}},977 (obrázok S2), čo naznačuje, že model dobre súhlasil s údajmi.30 Výsledky simulácie vhodnosti biotopu pre päť období (LGM, MH, súčasnosť, 2050 a 2070 ) sú znázornené na obrázku 2 a tabuľke 2. C. Vhodnosť na pestovanie salsy bola rozdelená do piatich kategórií na základe štatistického prahovania: nevhodné (trieda 5: 0–20 percent), okrajové (trieda 4: 20–50 percent), spravodlivé (trieda 3: 50-75 percent), dobré (trieda 2: 75-

90 percent) a vynikajúce (trieda 1: 90–100 percent). Tento článok diskutoval iba o vhodných distribučných oblastiach pre triedu 1, triedu 2 a triedu 3. Súčasné potenciálne distribúcie C. salsa naznačujú, že tento druh bol široko rozšírený v troch klimatických zónach: mierne púštne podnebie, subtropické stredomorské podnebie a tropická púšť klimatické regióny. Všetky kontinenty, okrem Antarktídy, obsahujú oblasti, ktoré boli vhodné pre C. salsa. Tieto regióny boli distribuované hlavne v strednej a západnej Ázii a severnej Afrike a boli rozptýlené v strednej a západnej Severnej Amerike, strednej Južnej Amerike a západnej Oceánii. Vynikajúce (trieda 1) vhodné oblasti boli najrozšírenejšie v Egypte (76 750 km2), zatiaľ čo dobré (trieda 2) a spravodlivé (trieda 3) vhodné oblasti boli najrozšírenejšie v Číne (trieda 2: {{ 13}} km2 a trieda 3: 1 024 600 km2). Ekologicky vhodné oblasti v Ázii boli primárne obmedzené na Čínu (trieda 1: 45 775 km2), Jordánsko (trieda 1: 16 075 km2), Izrael (trieda 1: 14 975 km2), Saudskú Arábiu Arábia (trieda 1: 14 925 km2) a Irán (1. trieda: 12 600 km2). Vhodné oblasti C. salsa v Afrike boli distribuované najmä v Egypte, Líbyi (trieda 1: 34 400 km2) a Tunisku (trieda 1: 275 km2). Vhodné oblasti pre C. salsa v Južnej Amerike boli distribuované hlavne v Čile (trieda 1: 16 550 km2).

Z priestorového hľadiska (obrázok 2) sa vhodný trend regionálnej zmeny pre päť období najprv zvýšil a potom sa znížil s najväčšou rozlohou v roku 2050 (obrázok 3a, obrázok S3). Videli sme veľký pokles vhodnej oblasti C. salsa v rámci LGM v porovnaní s oblasťou v ostatných štyroch obdobiach. V porovnaní so súčasnosťou (4 358 775 km2) sa vhodné plochy zmenšili o 50 percent (2 160 975 km2) v období LGM, o 10 percent (MH: 3 910 350 km2) v období MH, a o 1 percento (4 328 800 km2) v období roku 2070 a vzrástol o 2 percentá (4 428 950 km2) v období roku 2050. Je pozoruhodné, že od súčasnosti do budúcnosti (od roku 1960 do roku 2080) sa vynikajúca oblasť (trieda 1) pre C. salsa postupne zmenšovala (súčasnosť, 243 200 km2; 2050, 232 425 km2; 2070, { {29}} km2).

Cistancheextrakt má veľazdravievýhod

3.2. Predpoveď vhodných distribučných oblastí C. salsa v Číne a rozsah bioklimatických premenných.

Vhodné oblasti pre rast C. salsa v Číne boli obmedzené hlavne na severozápad Sin-ťiang, stredné Vnútorné Mongolsko, severné Shaanxi, severné Shanxi, severovýchodné Qinghai, severné Gansu a väčšinu Ningxie (obrázok 2b). Najvhodnejšie oblasti v Číne boli rozmiestnené najmä v Sin-ťiangu, z ktorých vynikajúca oblasť (trieda 1) pokrývala 23 650 km2, dobrá oblasť (trieda 1)

2) pokrývala 220 950 km2 a výstavná plocha (trieda 3) pokrývala 189 975 km2. Medzi dobrými oblasťami (trieda 2) tvoril Sin-ťiang 60,99 percenta, nasledovalo Vnútorné Mongolsko (86 300 km2) a Gansu (24 450 km2) s 23,82 percentami a 6,75 percentami (obrázok 3b). Výsledky modelu MaxEnt ukázali, že Xinjiang bol obzvlášť vhodný na rast C. salsa. Počas výletov do terénu sa však v tej istej oblasti našli rôzne biotopy, ako napríklad štrková púšť, trávne porasty a púštne stepi. Preto sme sa veľmi zaujímali o charakteristiky pôdnych mikrobiálnych spoločenstiev a ich vzťah k životnému prostrediu v rôznych ekotypoch C. salsa v Tacheng, Xinjiang, Čína.

Dôležitosť každej bioklimatickej premennej pre distribúciu C. salsa je uvedená v tabuľke 2. Všetky hodnoty boli priemermi z 1 0 opakovaní. Tri hlavné bioklimatické premenné s najväčším vplyvom na distribúciu C. salsa boli zrážky v najsuchšom štvrťroku (bio17), zrážky v najteplejšom štvrťroku (bio18) a priemerný denný rozsah (bio2) s relatívnou mierou príspevku 25,81 percenta , 17,65 percenta a 13,70 percenta . Ako naznačuje krivka odozvy získaná modelom MaxEnt, rozsah biofaktora bolo možné vypočítať, keď pravdepodobnosť predpovede presiahla 0,5. Napríklad rozsah bio17 bol od -135,30 do 11,34 mm, rozsah bio 18 bol od -206,60 do 4,40 mm a rozsah bio2 bol od 11,65 do 12,50 stupňa.

3.3. Pôdne mikrobiómy z troch ekotypov C. salsa s odlišnými a prekrývajúcimi sa mikrobiálnymi komunitami.

Sekvenovanie 16S rRNA viedlo k 518 217 nespracovaným čítaniam, z ktorých 441 576 bolo skrínovaných na kvalitu a dĺžku. Súbor údajov obsahoval 11 818-{4}} (priemer: 20 150) sekvencií na vzorku. Vysokokvalitné čítania boli zoskupené na základe

>97-percentná sekvenčná identita s 2 788 mikrobiálnymi OTU (tabuľka 1).

Mikrobiálne spoločenstvo bolo klasifikované do 34 kmeňov a 321 rodov. Na úrovni kmeňa (obrázok 4a) sú Actinobacteria (DS, 31,94 percenta; GD; 46,42 percenta; GL, 33,33 percenta), proteobaktérie (DS,

23,25 percenta; GD, 22,53 percenta; GL, 24,68 percenta) a Gemmatimonadetes (DS, 17,77 percenta; GD, 8,02 percenta; GL, 8,36 percenta) boli dominantné v týchto troch ekotypoch. Na úrovni rodu (obrázok 4b) v púšti-stepi dominovali Euzebya (4,82 percenta) a Arthrobacter (1,74 percenta), zatiaľ čo najdominantnejšími rodmi v štrkovej - púšti boli Arthrobacter (8,35 percenta) a Bacillus (4,95 percenta). ). Na trávnatých porastoch dominovali Bacillus (6,89 percenta) a Arthrobacter (5,57 percenta). Top 10 najpočetnejších mikrobiálnych spoločenstiev v púštnej stepi bolo klasifikovaných do ôsmich kmeňov (obrázok 4c), tie v štrkovej púšti boli klasifikované do siedmich kmeňov (obrázok 4d) a tie v trávnatých porastoch boli klasifikované do 10 kmeňov (obrázok 4e ).

Merania diverzity v rámci vzorky (-diverzita) odhalili zmenu diverzity z trávnatých porastov na štrkovú púšť a púštnu step (obrázok 4f). Diverzita pôdnych mikrobiálnych spoločenstiev v každej vzorke bola hodnotená pomocou indexov Shannon, Chao 1, Fisher a pozorovaných indexov druhovej diverzity. Shannon, Chao 1, pozorované druhy a Fisherove indexy naznačujú, že diverzita trávnatých pôdnych spoločenstiev

bola vyššia ako u ostatných dvoch ekotypových spoločenstiev. Výsledky kriviek zriedenia (obrázok S5) boli podobné výsledkom uvedeným vyššie, s výnimkou YM1 a HJ3. Výsledky AMOVA (tabuľka S3) ukázali, že medzi tromi ekotypmi existujú významné rozdiely (p < 0,01).="" výsledky="" neobmedzených="" pcoas="" nevážených="" 2d="" grafov="" vzdialenosti="" unifrac="" (obrázok="" 4g)="" ukázali,="" že="" pôdne="" vzorky="" bakteriálnych="" mikrobiómov="" z="" rôznych="" ekotypov,="" okrem="" ym1="" a="" hj3,="" boli="" dobre="" zoskupené.="" zhlukovanie="" stromov="" diverzity="" vzdialenosti="" bray="" na="" základe="" výsledkov="" algoritmu="" s="" jedným="" zhlukom="" (obrázok="" 4h)="" vzoriek="" pôdy="" troch="" ekotypov="" preukázalo,="" že="" vzorky="" trávnych="" porastov,="" okrem="" ym2,="" boli="" tesne="" zoskupené,="" vzorky="" pôdy="" z="" púšte="" a="" stepí,="" okrem="" ja1,="" boli="" tesne="" zoskupené,="" a="" vzorky="" štrko-púštnej="" pôdy="" boli="" tesne="">

3.4. Diferenciálny mikrobiómový skríning troch ekotypov C. salsa.

Tepelné mapy početnosti rôznych rodov (obrázok 5a) ukázali, že početnosť rodu vzoriek z púštnej stepi sa líšila od počtu vzoriek z ostatných dvoch ekotypov. Ako je uvedené vo výsledkoch o

LEfSe (obrázok 5c) a RF (obrázok 5d), mini tepelná mapa vpravo ukazuje množstvo mikrobiálnych znakov v troch ekotypoch na úrovni rodu. Medzi rody, ktoré môžu reprezentovať púštno-stepný ekotyp patria Gillisia, Illumatobacter, Salegentibacter, Marinimicrobium atď. Variibacter je symbolický

úroveň rodu, ktorá môže predstavovať ekotyp štrko-púšť. Biomarkery v ekotype trávnych porastov obsahujú Flavisolibacter a Agromyces. Po spojení výsledkov týchto dvoch metód sa vybralo 11 biomarkerov (tabuľka S4). Obrázok 5b ukazuje tepelnú mapu množstva 11 biomarkerov.

3.5. Skríning základného mikrobiómu a predikcia metabolickej funkcie troch ekotypov C. salsa.

Vennov diagram (obrázok 5e) bol vynesený pre OTU získané zo všetkých vzoriek pôdy a výsledky ukázali, že tieto tri ekotypy zdieľali 1712 OTU. Metóda perzistencie bola prevzatá zo základnej funkcie v mikrobióme balíka R na identifikáciu základného mikrobiómu v troch ekotypoch C. salsa. Tento jadrový bakteriálny mikrobióm obsahoval šesť OTU a zodpovedal 19,64 percentám celého mikrobiómu. S vylúčením nedefinovaných a duplikovaných rodov boli tieto OTU klasifikované do šiestich rodov a ich početnosť bola zakreslená do tepelnej mapy (obrázok 5f).

Výsledky funkčnej predikcie (obrázok 6, doplnkový súbor 2) naznačujú, že funkčné metabolické dráhy pôdnych mikrobiómov v troch ekotypoch C. salsa boli identické v uhľohydrátoch a že metabolizmus aminokyselín bol medzi metabolickými cestami bohatý. Membránový transport a signálna transdukcia boli tiež bohaté na spracovanie environmentálnych informácií.

3.6. Korelačná analýza medzi mikrobiálnymi komunitami a bioklimatickými premennými troch ekotypov C. salsa.

Redundantná analýza jadra, množstva biomarkerových mikrobiómov a bioklimatických premenných sa uskutočnila na úrovni rodu a opätovná analýza sa uskutočnila na základe účinkov. Upravená interpretácia rozptylu bola 32,5 percenta. Zrážky v najteplejšom štvrťroku (bio18) vysvetlili 23,9 percenta mikrobiálnych spoločenstiev (p=0,07). Priemerná teplota najteplejšej štvrtiny (bio10) a priemerný denný rozsah (bio2) pozitívne korelovali s Illumatobacter a negatívne korelovali s Bacillus (obrázok 7a).

Korelačná analýza sa uskutočnila pre jadro, množstvo biomarkerových mikrobiómov a sedem bioklimatických premenných. Výsledky korelačnej siete (obrázok 7b) odhalili, že Illumatobacter a Salegentibacter (biomarkery v púštnej stepi) významne pozitívne korelovali s priemerným denným rozsahom (bio2) a priemernou teplotou najteplejšej štvrti (bio10), ale významne negatívne korelovali s nadmorskou výškou ( alt) a zrážok najteplejšej štvrti (bio18). Naopak, Agromyces (biomarker v trávnatých porastoch) pozitívne koreloval s nadmorskou výškou (alt) a zrážkami v najteplejšej štvrti (bio18), ale negatívne koreloval s priemerným denným rozsahom (bio2) a priemernou teplotou najteplejšej štvrti (bio10). Okrem toho Arthrobacter (jadrový mikrobióm) významne negatívne koreloval s priemerným denným rozsahom (bio2) a priemernou teplotou najteplejšej štvrti (bio10). Rubrobacter signifikantne pozitívne koreloval s ročnými zrážkami (bio12).