Časť 2: Antifibrotický účinok 6-Bróm-indirubínu-3 ′-oxímu (6-BIO) prostredníctvom regulácie aktivačného proteínu-1 (AP-1) a špecifickosť proteínu-1 (SP-1) transkripčné faktory v obličkových bunkách

Pre časť 1 kliknitetu.

3.3. 6-BIO oslabuje markery fibrózy a signálne dráhy spojené s fibrózou v bunkách proximálneho tubulu (HK-2) a intersticiálnych fibroblastoch (NRK49F)

Ďalej sme potvrdili účinok 6-BIO na proximálne tubulárne bunky a intersticiálne fibroblastové bunky. Pozorovali sme koncentračne a časovo závislú redukciu expresie GSK3 mRNA pomocou 6-BIO v bunkách HK-2 a NRK49F (obr. S2A a B) a expresiu zahrnutých proteínov súvisiacich s ECM a EMT vobličkybunkafibrózabol tiež znížený (obr. S2E). Okrem toho sa zvýšená expresia GSK3 po expozícii týchto buniek TGF tiež znížila 6-BIO liečbou (obr. S2C a D). Obr. 3 ukazuje proteínovú expresiuobličkyfibrózamarkery v bunkách HK-2 a NRK49F ošetrených TGF. Ako je znázornené na obr. 3A, expresia proteínov PAI-1 a CTGF sa významne zvýšila v reakcii na liečbu 5 a 10 ng/ml TGF v bunkách HK{6}} a NRK49F, v danom poradí. Ich expresia sa však po liečbe 6-BIO výrazne znížila (obr. 3B).SMADa MAPK signálne dráhy boli upregulované liečbou TGF, čo bolo zvrátené 6-BIO liečbou (obr. 4). Ďalej sme skúmali expresiu transkripčných faktorov AP-1 a SP{3}} zapojených do signalizácie sprostredkovanej TGF v bunkách HK-2 a NRK49F. Obr. 4D ukazuje, že TGF-sprostredkované zvýšenie PC-JUN a PC-FOS bolo znížené v reakcii na liečbu 6-BIO a JNK inhibítorom SP600125 a po dominantne negatívnej C-JUN transfekcii. Obr. 4E ukazuje zmenu intenzity proteínu vzhľadom na kontrolu. Okrem toho zvýšenie hladiny SP-1 sprostredkované TGF bolo významne oslabené v reakcii na liečbu siRNA 6-BIO a SP{20}} (obr. 4F). Obr. 4G ukazuje zmenu intenzity proteínu vzhľadom na kontrolu. Tieto výsledky naznačujú, že TGF /SMADa MAPK signalizácia, ako aj transkripčné faktory, AP-1 a SP-1, sú regulované 6-BIO.

3.4. 6-BIO tlmí jadrovú expresiu PC-JUN, PC-FOS a SP-1 proteínov v proximálnych tubulárnych a intersticiálnych fibroblastoch

Obr. 5A a B znázorňujú lokalizáciu PAI-1 a CTGF s PC-JUN, PC-FOS a SP-1. Červené farbenie PC-JUN, PC-FOS a SP-1 ukázalo ich nadmernú expresiu v jadre po liečbe TGF; podobne zelené farbenie PAI{12}} a CTGF indikovalo ich nadmernú expresiu v cytosóle. Avšak hladiny expresie PC-JUN, PC-FOS a SP-1 boli znížené 6-BIO liečbou. Tieto výsledky naznačujú, že 6-BIO priamo ovplyvňuje AP-1 a SP-1, transkripčné faktory regulujúce expresiu PAI-1 a CTGF.

3.5. 6-BIO zoslabuje aktivitu promótora PAI-1, CTGF, AP-1 a SP-1 v bunkách proximálnych tubulárnych a intersticiálnych fibroblastov

Ďalej sme skúmali, či 6-BIO inhibuje promótorové aktivity génov PAI-1, CTGF, AP-1 a SP-1. Aktivita promótora PAI-1 a CTGF sa zvýšila ako odpoveď na TGF, ale bola znížená 6-BIO liečbou (obr. 6A a B). Okrem toho bol pokles pozoruhodný, keď boli bunky ošetrené samotným 6-BIO ako v prítomnosti TGF. AP-1 a SP-1 sa viažu na propagátorov PAI{10}} a CTGF. Obr. 6C a 6D ukazujú aktivitu promótora AP-1 a SP-1. Aktivita luciferázy AP-1 a SP{16}} sa zvýšila liečbou TGF a znížila 6-BIO spôsobom závislým od dávky. Obr. 6E ukazuje expresiu transkripčného faktora v extraktoch jadrového proteínu. Potvrdili sme teda, že jadrová expresia PC-JUN, PC-FOS a SP-1 sa zvýšila v reakcii na liečbu TGF a bola potlačená 6-BIO liečbou. Obr. 6F ukazuje zmenu intenzity proteínu vzhľadom na kontrolu. Okrem toho naše výsledky naznačujú, že 6-BIO pôsobí na väzbové miesto transkripčného faktora promótora, čím oslabuje väzbu AP-1 a SP-1. Uskutočnili sme in vitro test väzby promótora v prítomnosti 6-BIO, aby sme to potvrdili. Väzba jadrových proteínov a PC-JUN, PC-FOS a SP-1 bola oslabená pridaním 6-BIO spôsobom závislým od koncentrácie (doplnkový obrázok 3). Tieto výsledky naznačujú, že 6-BIO inhibuje aktivity promótora PAI{40}} a CTGF, ako aj funkcie AP-1 a SP{42}}; teda môže mať terapeutický potenciál vobličkyfibróza.

4. Diskusia

S použitím potkanieho modelu liečeného UUO a TGFobličkybunkové línie odvodené od proximálnych tubulov a intersticiálnych fibroblastov sme preukázali, že 6-BIO liečba môže oslabiťobličkyškody. Model UUO je reprezentatívny zvierací model obštrukčnej nefropatie, ktorý sa vyznačuje progresívnou tubulointersticiálnoufibróza[43]. Histopatologická analýzaobličkytkanivách získaných z modelu UUO ukázali, že akumulácia ECM a tubulárna atrofia v intersticiálnom priestore boli obnovené 6-BIO liečbou. Okrem toho s použitím TGF-ošetrenéhoobličkybunkami proximálnych tubulov a intersticiálnymi fibroblastmi sme dokázali, že 6-BIO liečba môže zmierniťobličkyškody. V modeli UUO a bunkách HK-2 a NRK49F ošetrených TGF inhiboval 6-BIO expresiuobličkyfibrózamarkery ako aj MAPK aSMADsignálne dráhy. Okrem toho 6-BIO liečba znížila expresiu PC-JUN, PC-FOS a SP-1 proteínov indukovanú UUO a TGF, ako aj jadrovú expresiu a promótorovú aktivitu AP{{6 }} a SP-1 v bunkách HK-2 a NRK49F liečených TGF- -. Inhibícia transkripčných faktorov AP-1 a SP{12}} pomocou 6-BIO liečby bola spojená s inhibíciou akumulácie ECM, ktorá vedie k exacerbáciiobličkyfibróza. To sa dosiahne potlačením MAPK aSMADsignálne dráhy, ktoré vedú k zníženiu expresie PAI-1 a CTGF. Naše výsledky naznačujú, že 6-BIO môže byť potenciálnym terapeutickým prostriedkom protiobličkychorôb, ako aj na prevenciuobličkyškody spôsobené UUO a TGF .

Kliknite na organickú Cistanche na ochorenie obličiek

Semisyntetický bunkovo-permeabilný derivát indirubínu 6-BIO patrí do rodiny bis-indolov a prirodzene sa vyskytuje v jedlých mäkkýšoch a rastlinách ulitníkov [12]. Indirubín obsahuje intramolekulárnu vodíkovú väzbu medzi 2-C dvojitou väzbou O a N1-H skupinou a ďalšiu medzimolekulovú vodíkovú väzbu medzi molekulami. 6-BIO má chemicky modifikovanú štruktúru, v ktorej je poloha 6- nahradená Br, aby sa prekonala nevýhoda zlých farmakokinetických vlastností v dôsledku nízkej rozpustnosti indirubínu vo vode [44]. Mnohé indirubíny v dôsledku kompetitívnej väzby s ATP pôsobia ako duálne inhibítory cyklín-dependentnej kinázy (CDK) a glykogénsyntázy kinázy{{10}} (GSK-3) a vykazujú viac ako {{ 12}-násobok selektivity oproti CDK5 [12]. Okrem toho 6-BIO vykazuje výrazne selektívnu inhibíciu GSK-3 s hodnotou IC50 0,005 μM [12]. Podľa správ niekoľkých skupín 6-BIO úplne inhibuje proliferáciu buniek MCF-7 a blokuje migráciu približne o 75 percent pri koncentrácii 10 μM a inhibuje fosforyláciu PDK1. To ukázalo, že 6-BIO bol vložený do väzbovej kapsy PDK1, aby sa vytvorili tri vodíkové väzby so zvyškami v pántovej oblasti, a väzobná kapsa ľahko prijala ďalšie atómy Br v 6-BIO [45]. S týmito vlastnosťami sa 6-BIO študuje ako nový liek na reguláciu bunkových procesov, ako sú zápaly súvisiace so starnutím, oxidačný stres, prežívanie buniek, proliferácia a apoptóza pri rakovine, cukrovke a degeneratívnych ochoreniach [46,47 ]. Štúdie o génovej regulácii a molekulárnych mechanizmoch však súvisiaobličkybunkafibrózasú vzácne. Preto sme sa snažili zistiť, či 6-BIO oslabujeobličkyfibrózainhibíciou regulácie génov PAI{0}} a CTGFobličkybuniek, čím sa zníži akumulácia ECM.

Niekoľko štúdií použilo model UUO na oznámenie korelácie medzi akumuláciou ECM a chronickouobličkyochorenie spôsobené tubulárnou intersticiálnoufibróza[43]. Navyše nadmerne exprimovaný PAI-1 a CTGF sú údajne spojené s vysokou akumuláciou ECM počas progresie chronickejobličkychoroba. Identifikácia terapeutickej molekuly, ktorá inhibuje signalizáciu a transkripciu génov spojených so zvýšenou akumuláciou ECM, je teda dôležitá pre účinnú inhibíciuobličkyfibróza. Preto sme v tejto štúdii hodnotili 6-BIO, jeden z inhibítorov glykogénsyntázy kinázy 3 (GSK-3), vobličkyfibróza.

Študovali sme vplyv proteínov PAI{0}} a CTGF naobličkybunkafibrózaa potvrdili, že ich expresia bola regulovaná bežnými transkripčnými faktormi, AP-1 a SP-1. Transkripčný faktor, AP-1, je heterodimér zložený z proteínov patriacich k JUN (C-JUN, JUNB a JUND), FOS (C-FOS, FOSB, Fra{5}} a Fra{ {6}}), rodina ATF (aktivačný transkripčný faktor) a JDP (JUN dimerizačný proteín) [48]. Reguluje niekoľko bunkových procesov, ako je bunková proliferácia, smrť,

diferenciácia a vaskularizácia. Skoršia štúdia uvádza, že aktivita AP{0}} sa zvyšuje v pečeni a pľúcach aktiváciou kolagénu typu VI a fibroblastov [49,50]. Dve hlavné zložky AP-1, C-JUN a C-FOS reagujú na rôzne stimuly, ako sú cytokíny, rastové faktory a stres [51]. Pozorovali sme zvýšenú fosforyláciu C-JUN a C-FOS v modeli potkanov UUO a bunkách HK-2 a NRK49F ošetrených TGF (obr. 2D a 4D). C-JUN a C-FOS tvoria heterodiméry a viažu sa na väzbové miesto AP-1 v DNA, čím pôsobia ako transkripčné faktory na reguláciu expresie iných génov. Okrem toho fosforylácia ERK1/2 a JNK aktivuje C-FOS a C-JUN. V našej štúdii sa fosforylácia ERK1/2 a JNK, ako aj C-JUN a C-FOS v jadre výrazne zvýšila v reakcii na liečbu TGF . 6-BIO liečba však tieto účinky výrazne zvrátila. Naša štúdia ukázala, že 6-BIO účinne inhibuje fosforyláciu ERK1/2 a JNK a znižuje aktivitu transkripčného faktora AP-1, čím inhibuje fosforyláciu C-JUN a C-FOS, ktoré sú jeho downstream efektory. SP-1 inhibícia v pečeňových astrocytoch vyvoláva ananti-fibrotickéúčinok [52]. Iná štúdia ukázala, že SP-1 zohral dôležitú úlohu vfibróza[52,53]. Preto sme vyhodnotili, či 6-BIO môže inhibovať transkripčný faktor SP-1. Pozorovali sme, že expresia proteínu SP-1 sa zvýšila v reakcii na liečbu TGF, ako aj v modeli UUO, zatiaľ čo po liečbe 6-BIO sa znížila. Navyše, jadrová expresia SP-1 indukovaná TGF bola potlačená 6-BIO liečbou. Výsledkom je, že promótorové aktivity PAI-1 a CTGF, ktoré majú AP-1 a SP{10}} väzbové miesta, boli tiež znížené liečbou 6-BIO (obr. 6 ). Tieto zistenia preto naznačujú, že zníženie aktivity promótora PAI-1 a CTGF 6-BIO liečbou znížilo expresiu proteínu PAI-1 a CTGF a znížilo akumuláciu ECM, čím sa znížiloobličkybunkafibróza.

5. Záver

6-BIO liečba znížila expresiu PAI{1}} a CTGF v modeli UUO a liečba TGFobličkybunky. Okrem toho 6-BIO inhibovala aktiváciu vyvolanú TGFSMADa MAPK signalizácia, pričom zároveň inhibuje aktivity AP-1 a SP-1, dvoch z niekoľkých transkripčných faktorov viažucich sa na promótory génov PAI-1 a CTGF. Inhibícia AP-1 a SP-1 sa javí ako jeden z kľúčových mechanizmov, ktorým 6-BIO inhibujeobličkyfibróza. Naše výsledky teda naznačujú, že 6-BIO môže byť potenciálnym terapeutickým prostriedkom protiobličkychoroby.

vyhlásenie o autorskom príspevku CRediT

Jung Sun Park: Konceptualizácia, Metodológia, Spracovanie údajov, Písanie − príprava pôvodného návrhu, Písanie − kontrola a úprava, Vizualizácia, Získavanie financií. In Ae Jung: Spracovanie údajov, písanie – kontrola a úprava. Hong Sang Choi: Spracovanie údajov, písanie – kontrola a úprava. Dong-Hyun Kim: Metodológia, spracovanie údajov. Hoon In Choi: Metodológia, Spracovanie údajov. Eun Hui Bae: Písanie – recenzia a úprava, supervízia. Seong Kwon Ma: Písanie – recenzie a úpravy,

6. Referencie

Zdroj je od Jung Sun Park et, al na Biomedicíne a farmakoterapii 145 (2022) 112402