Časť 2: Echinakozid izolovaný z Cistanche Tubulosa údajne stimuluje sekréciu rastového hormónu prostredníctvom aktivácie receptora grelínu

Echinakozid izolovaný z Cistanche tubulosa údajne stimuluje sekréciu rastového hormónu prostredníctvom aktivácie receptora grelínu

Chieh-Ju Wu 1, Mei-Yin Chien 2, Nan-Hei Lin 1, Yi-Chiao Lin 1, Wen-Ying Chen 3, Chao-Hsiang Chen 2,4,* a Jason TC Tzen 1,*

1 Absolventský inštitút biotechnológie, Národná univerzita Chung-Hsing, Taichung 402, Taiwan; baby159357520@gmail.com (C.-JW); CMNHEI@mohw.gov.tw (N.-HL); s9755702@gmail.com (Y.-CL)

2 Ko Da Pharmaceutical Co. Ltd., Taoyuan 324, Taiwan; rd1@koda.com.tw

3 Katedra veterinárnej medicíny, Národná univerzita Chung-Hsing, Taichung 402, Taiwan; wychen@dragon.nchu.edu.tw

4 Graduate Institute of Pharmacognosy, Taipei Medical University, Taipei 110, Taiwan

* Korešpondencia: gm@koda.com.tw (C.-HC); TCTZEN@dragon.nchu.edu.tw (JTCT); Tel.: plus 886-4-22840328 (ext. 776) (JTCT); Fax: plus 886-4-22853527 (JTCT)

Akademický redaktor: Pinarosa Avato

Prijaté: 22. januára 2019; Prijaté: 14. februára 2019; Zverejnené: 17.2.2019

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Abstrakt:Cistanchedruh, ženšen z púšte, má podľa tradičnej čínskej farmakopei mnoho biologických aktivít a používa sa ako liek proti starnutiu. Tri fenyletanoidové glykozidy – echinakozid, tubulozid A aakteozid—boli zistené vo vodnom extrakte zCistanche tubulosa(Schenk) R. Wight a hlavná zložka, echinakozid, sa ďalej purifikovali. Echinakozid s koncentráciou vyššou ako 10_6 M vykazoval významnú aktivitu pri stimulácii sekrécie rastového hormónu v bunkách hypofýzy potkanov. Podobne ako v prípade hormónu uvoľňujúceho rastový hormón-6, syntetického analógu ghrelínu, stimuláciu sekrécie rastového hormónu echinakozidom inhibovala [D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11]-látka P , inverzný agonista grelínového receptora. Molekulárne modelovanie ukázalo, že všetky tri fenyletanoidové glykozidy adekvátne interagovali s väzbovou kapsou ghrelínového receptora a echinakozid vykazoval o niečo lepšiu interakciu s receptorom ako tubulozid A a akteozid. Výsledky naznačujú, že fenyletanoidové glykozidy, najmä echinakozid, sú aktívnymi zložkami, ktoré sú údajne zodpovedné za účinky C. tubulosa proti starnutiu a možno ich považovať za nepeptidové analógy ghrelínu.

Kľúčové slová: cistanchetubulosa; echinakozid; ghrelin; sekrécia rastového hormónu; fenyletanoidové glykozidy

Pls kliknite sem pre časť 1; Pls kliknite sem pre časť 3

echinakozidvcistanchemá veľa účinkov

Obrázok 4.Inhibícia [D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11]-látky P (antagonista GHSR) na stimulačné účinky sekrécie GH pomocou GHRP-6 a liečby echinakozidmi.

Primárne bunky prednej hypofýzy potkana boli inkubované s GHRP{{0}} (10_7 M) a echinakozidom (10_5 M) v prítomnosti a neprítomnosti [D-Arg1, D-Phe5 D-Trp7,9, Leull]-látka P (0,5 uM) počas 15 min.

Údaje boli prezentované ako priemer o SD s n =6. Úrovne významnosti pozorované T testom boli * p < 0.05 oproti kontrole, # p < 0,05 a ## p < 0,005 signifikantné rozdiely medzi stĺpcami.

2.3. Molekulárne pripojenie echinakozidu, tubulozidu A a akteozidu ku ghrelínovému receptoru

V porovnaní s GHRP-6 sú tri fenyletanolové glykozidy vC. tubulosa—echinakozid, tubulozid A a akteozid - boli podrobené molekulárnemu modelovaniu a dokovaniu do väzbovej kapsy ghrelínového receptora, GHSR. Výsledky ukázali, že všetky trifenyletanolglykozidysa mohli viazať na ghrelín viažucu kapsu GHSR, hoci ich interakcie vo väzbovej kapse boli relatívne slabé v porovnaní s GHRP-6 (obrázok 5A). Medzi nimi sa vytvorili dva typy intermolekulárnej interakcie, H-väzba a stohovanieechinakozida GHSR (obrázok 5B). Medzi echinakozidom a GHSR sa vytvorilo šesť H-väzieb; dve medzi C6 hydroxylovou skupinou cukrovej časti a S207 GHSR, jednu medzi C6 hydroxylovou skupinou cukrovej časti a V205 GHSR, jednu medzi C2 hydroxylovou skupinou cukrovej časti a N305 GHSR, jednu medzi C2 hydroxylovou skupinou glykozidu časť a R283 z GHSR, a jedna medzi C3 hydroxylovou skupinou dihydroxyfenyletanolovej časti a Q120 z GHSR. Jedna stohovacia interakcia sa vytvorila medzi kávovou kyselinou echinakozidu a F309 GHSR. Medzi tubulozidom A a GHSR sa vytvoril iba jeden typ intermolekulárnej interakcie, H-väzba (obrázok 5C). Medzi nimi sa vytvorilo päť H-väziebtubulozidA a GHSR; dve medzi hydroxylovou skupinou C3 ramnózovej časti a N305 GHSR, jednu medzi hydroxylovou skupinou časti kyseliny kávovej a G208 GHSR, jednu medzi hydroxylovou skupinou dihydroxyfenyletanolovej časti a R283 GHSR a jednu medzi C4 glykozidu zvyšok a Q120 z GHSR. Medzi akteozidom a GHSR sa vytvorili dva typy intermolekulárnych interakcií, H-väzba a stohovanie (obrázok 5D). Medzi akteozidom a GHSR sa vytvorili štyri H-väzby; dve medzi hydroxylovými skupinami C2 a C3 ramnózovej časti a N305 GHSR, jednu medzi hydroxylovou skupinou časti kyseliny kávovej a C198 GHSR a jednu medzi hydroxylovou skupinou dihydroxyfenyletanolovej časti a E124 GHSR. Medzi dihydroxyfenyletanolovou skupinou akteozidu a F220 GHSR sa vytvorila jednovrstvová interakcia. Väzbové afinity (chemická energia) vypočítané pomocou GEMDOCK teda ukázali, že echinakozid, tubulozid A a akteozid mali porovnateľnú silu interakcie ligand-receptor, zatiaľ čo echinakozid vykazoval o niečo lepšiu interakciu s receptorom ako tubulozid A a akteozid pri dokovaní do väzbovej kapsy. ghrelínového receptora skonštruovaného s priestorom vrecka zaberaným GHRP-6 (tabuľka 1).

Obrázok 5.Modelovanie štyroch ligandov, GHRP-6 (A),echinakozid(B), tubulozid A (C) a akteozid (D) začlenený do GHSR,

a podrobná intermolekulárna interakcia v týchto zložitých štruktúrach. Ľavý panel: ligandy (štruktúra guľôčky) vo väzbovom mieste ghrelínu GHSR (štruktúra pásky). Stredný panel:

aminokyseliny (štruktúra tyčinky) v blízkosti ligandov (štruktúra tyčinky) v týchto zložitých štruktúrach. Pravý panel: podrobná intermolekulárna interakcia medzi ligandmi a GHSR. Aminokyseliny GHSR

zapojené do tvorby interakcie s ligandmi sú znázornené v štvorcoch. Sú označené vzdialenosti H-väzby (červené čiary), náboj-náboj (zelená čiara) a interakcie (modré čiary).

Stôl 1.Chemická energia vypočítaná pomocou GEMDOCK pre interakciu medzi väzbovou kapsou ghrelínového receptora (GHSR) a tromi fenyletanoidnými glykozidmi (echinakozid, tubulozid A a akteozid).

3. Diskusia

V literatúre sa uvádza ghrelín (známy ako endogénny hormón) aechinakozidzistené ako hlavný fenyletanoidný glykozid u druhov Cistanche, bolo zdokumentované, že má niekoľko ekvivalentných fyziologických aktivít, vrátane účinkov proti starnutiu, pravdepodobne prostredníctvom osi hypotalamus-hypofýza-gonáda. Vskutku, aj ghrelín aechinakozidboli navrhnuté ako terapeutické liečivá pri Alzheimerovej chorobe a Parkinsonovej chorobe [3,4,8,25–27]. V tejto štúdii sme ukázali, že echinakozid izolovaný z C. tubulosa by mohol stimulovať sekréciu rastového hormónu z primárnych buniek prednej hypofýzy potkana pravdepodobne prostredníctvom aktivácie GHSR podobným spôsobom ako ghrelín. Zdá sa, že stimulácia sekrécie rastového hormónu spúšťaná echinakozidom podporuje dobre známe účinky proti starnutiu druhov Cistanche a fenyletanoidové glykozidy, najmä echinakozid, sú aktívne zložky, ktoré sú údajne zodpovedné za terapeutické účinky.

Odhadované z relatívnej schopnosti stimulovať sekréciu rastového hormónu z buniek hypofýzy potkanov,echinakozidsa zdalo byť približne 100-krát slabšie ako GHRP-6, keďže boli pozorované porovnateľné stimulačné aktivity medziechinakozid10_5 M a GHRP-6 10_7 M pre 15- a 30-minútovú liečbu (obrázok 3). Relatívne aktivity echinakozidu a GHRP-6 pri indukcii sekrécie rastového hormónu boli v dobrej zhode s molekulárnym modelovaním, pretože GHRP-6 silne interagoval so zvyškami okolo väzobného vrecka GHSR prostredníctvom troch typov interakcie – H-väzba, náboj-nabíjanie a interakcia - zatiaľ čo echinakozid interagoval s GHSR prostredníctvom dvoch typov interakcie - H-väzby a stohovania (obrázok 5). Predovšetkým bolo zdôraznené, že interakcia náboj-náboj medzi kladne nabitou amóniovou skupinou GHRP-6 a záporne nabitou E124 GHSR hrá rozhodujúcu úlohu pri väzbe GHRP-6 na ghrelínový receptor [28]. Relatívne slabý stimulačný účinok echinakozidu na indukciu sekrécie rastového hormónu z buniek hypofýzy potkana možno pripísať hlavne nedostatočnej interakcii náboj-náboj vo väzbovom vrecku GHSR.

Podľa testu aktivity v tejto štúdii (obrázok 3) je minimálna účinná koncentrácia echinakozidu (Mr 786) na stimuláciu sekrécie rastového hormónu z buniek hypofýzy potkana okolo 10_6 M. Pre dospelého s hmotnosťou 65 kg objem krvi je približne 5 l (65 kg × 1/13 =1 kg ≈ 5 l), a preto je potrebných približne 4 mg echinakozidu na dosiahnutie koncentrácie {{10}} M( 5 l × 10_6 M × 786=3,93 mg). Z 1 g sušenej stonky C. tubulosa sa extrahuje približne 20 mg echinakozidu [24]. Na získanie 4 mg echinakozidu je potrebných 0,2 g sušenej stonky C. tubulosa.

Bežne sa pri príprave liekov pridáva viac ako 1 g sušenej stonky C. tubulosa. Preto sa zdá, že účinná dávka echinakozidu je v dobrej zhode s empirickou konzumáciou C. tubulosa ako bylinného lieku proti starnutiu. Samozrejme, účinná dávka echinakozidu by mala byť vyššia ako vyššie uvedený odhad, pretože dostupnosť echinakozidu má tendenciu byť znížená po absorpcii v čreve a prechode cez hematoencefalickú bariéru. Na presné určenie účinnej dávky echinakozidu u zvierat sú potrebné ďalšie experimenty.

V našich predchádzajúcich štúdiách sa tiež ukázalo, že teagrelín a ginkgogrelín, jedinečné acylované flavonoidové glykozidy izolované z čaju Chin-shin oolong a listov Ginkgo biloba, indukujú sekréciu rastového hormónu v bunkách hypofýzy potkanov prostredníctvom väzby na ghrelínový receptor [20,22]. Je zaujímavé, že minimálna účinná koncentrácia teagrelínu alebo ginkgogrelínu na stimuláciu sekrécie rastového hormónu z buniek hypofýzy potkanov je tiež okolo 10_6 M, a teda ekvivalentná

k echinakozidu. Avšak obsah teagrelínu a ginkgogrelínu v čaji Chin-shin oolong a listoch Ginkgo biloba bol relatívne nízky; v 1 g čaju Chin-shin oolong bolo približne 1 mg teagrelínu a 0.33 mg ginkgogrelínu v 1 g listov Ginkgo biloba na rozdiel od 20 mg echinakozidu v 1 g C. tubulosa. Preto sú účinné dávky čaju Chin-shin oolong a listov Ginkgo biloba okolo 5–10 g a 10–20 g. Zdá sa, že drastický rozdiel v účinnej dávke medzi C. tubulosa (0,2 g) a čajom Chin-shin oolong alebo listami Ginkgo biloba vysvetľuje, prečo sa C. tubulosa používa ako bylinný liek proti starnutiu, zatiaľ čo čaj Chin-shin oolong a Ginkgo biloba listy sa konzumujú ako nápoje z bylinných čajov.