Časť 2: Verbascoside chráni pankreatické bunky pred ER stresom
Mar 05, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Alessandra Galli 1, plus , Paola Marciani 1, plus , Algerta Marku 1, Silvia Ghislanzoni 1, Federico Bertuzzi 2, Rafaella Rossi 3, Alessia Di Giancamillo 3 , Michela Castagna 1 a Carla Perego 1,*
Pls Kliknite sem späť na časť 1
3.4 Moduláty verbaskozidu – mitochondriálna aktivita a dynamika buniek
Testy životaschopnosti MTT naznačujú možný vplyvverbaskozidpriamo na mitochondriách, čo zaisťuje spojenie sekrécie inzulínu s nutričným stavom a prežitím buniek v tomto type buniek. Tvar a membránový potenciál sú markermi mitochondriálneho zdravia [42]. Najprv sme vyhodnotili potenciál mitochondriálnej membrány označením buniek pomocou MitoSpyw Orange CMTMRos, priepustného farbiva, ktorého koncentrácia závisí od vnútorného potenciálu mitochondriálnej membrány, zatiaľ čo MitoSpyw Green FM sa použil na normalizáciu údajov na mitochondriálnu hmotu (obrázok 4A, B). Membránový potenciál mitochondrií vverbaskozid-ošetrených buniek bol zvýšený v porovnaní s kontrolou v bazálnych aj stresových podmienkach. zaujimave,verbaskozidmetabolity mali rôzne účinky. Kaviarenská kyselina nezlepšila mitochondriálny potenciál, zatiaľ čo hydroxytyrozol spôsobil poškodenie mitochondriálnej funkcie závislé od dávky, v súlade s údajmi o životaschopnosti buniek bol takýto účinok evidentnejší po expozícii H2O2 (obrázok S3).
Keďže funkcia úzko súvisí s morfológiou, zmerali sme Feretov priemer, plochu a kruhovitosť mitochondrií. Akútny oxidačný stres podporuje rozsiahle mitochondriálne štiepenie, čo vedie k menším kruhovým mitochondriám [42]. V podmienkach stresu H2O2 boli mitochondrie buniek ošetrených verbascozidom viac predĺžené a vykazovali zvýšený povrch ako kontrolné (obrázok 4C, D a obrázok S4). Mitochondriálna cirkularita bola nižšia v bunkách ošetrených verbascozidom ako v kontrolách a rozdiely boli zreteľnejšie v bunkách ošetrených H2O2 (obrázok S3), čo opäť potvrdzuje ochrannú úlohu polyfenolu.
Schopnosť týchto organel modifikovať svoj tvar v reakcii na nutričné stavy alebo stresové podmienky je pod kontrolou fúznych a štiepnych udalostí a vyžaduje mitochondriálnu motilitu [39]. Sledovanie pohybov mitochondrií nás viedlo k výpočtu kumulatívnej prejdenej vzdialenosti a analýza odhalila významné zvýšenie dynamiky mitochondrií v bunkách ošetrených verbascozidom v porovnaní s kontrolou, už v bazálnych podmienkach (obrázok 4E, F a videá S1–S4). Účinok bol výraznejší po ošetrení H2O2, skutočne predbežné ošetrenie verbascozidom takmer úplne zvrátilo vplyv oxidačného stresu na mitochondriálnu dynamiku.
Celkovo tieto údaje silne podporujú kľúčovú úlohu verbascozidu pri zabezpečovaní dynamiky mitochondrií, čo je kľúčové na podporu rýchlej adaptácie tejto organely na stresové podmienky.
3.5 Vplyv verbascozidu na prežitie a funkciu Langerhansa
Vzhľadom na translačný potenciálverbaskozidaplikácii v ľudskom zdraví sme overili jeho vplyv na ľudské izolované Langerhansove ostrovčeky, čo je relevantnejší model pre fyziopatologické a farmakologické štúdie na bunkách. Izolované ostrovčeky sa ošetrili 16 uM verbascozidom počas 5 dní a vyhodnotil sa potenciál mitochondriálnej membrány. Ako je uvedené na obrázku 5A, zatiaľ čo organelový potenciál bol ohrozený v kontrolných ľudských ostrovčekoch po expozícii H2O2, vnútorný membránový potenciál mitochondrií v ostrovčekoch vopred ošetrených verbascozidom sa významne neznížil, čo podporuje hypotézu o ochrannej úlohe verbascozidu proti ROS-indukovaným - dysfunkcia buniek. Analýza expresie ER-stresových markerov ukázala dôležité zníženie frakcie P-eIF2 v dvoch odlišných prípravkoch ostrovčekov udržiavaných v 16 uM verbaskozidu, čo potvrdzuje downreguláciu tejto dráhy aj v ľudských vzorkách (obrázok 5D). Priaznivé účinky liečby polyfenolom boli potvrdené zvýšeným obsahom inzulínu pozorovaným na ostrovčekoch ošetrených verbaskozidom v porovnaní s kontrolami (obrázok 5B). Rozptyľovanie údajov v našich experimentoch neumožnilo preukázať žiadny významný rozdiel v sekrécii inzulínu stimulovaného glukózou (GSIS) v ostrovčekoch ošetrených verbascozidom, hoci sa zdá, že pozitívny trend je zrejmý v bazálnych aj stresových podmienkach (obrázok 5C).
4. Diskusia
Oxidačný stres a zápal sú základom dysfunkcie buniek vyskytujúcej sa počas T2D [43,44] ako také, funkčné potraviny, nutraceutiká a fytochemikálie boli skúmané ako nástroje na prevenciu diabetu 2. typu [45]. V tejto práci sme sa zamerali na verbaskozid, o ktorom je známe, že má protizápalové a antioxidačné aktivity v neurónoch [18]. Napriek vysokej štruktúrnej komplexnosti sa verbaskozid a izoverbaskozid našli v krvnej plazme potkanov kŕmených extraktom z Lippia citriodora spolu s niektorými metabolitmi [20]. Okrem toho sa v bunkovej línii rakoviny prsníka SKBR3 [23] zistila bunková akumulácia verbaskozidu a je verbaskozidom [23] a štúdie uskutočnené na bunkách Caco{12}} dokazujú, že mierne množstvá verbascozidu a izoverbaskozidu zostávajú po in vitro trávení nedotknuté a biologicky dostupné. proces. Okrem toho môže Caco{13}} absorbovať obe molekuly rýchlym a lineárnym transportom v rozsahu 10 až 100 uM [22]. Neboli hlásené žiadne údaje o biologickej dostupnosti verbaskozidu u ľudí, a napriek tomu vyššie uvedené štúdie naznačujú, že je možné, aby nemetabolizovaný verbaskozid prekročil črevnú bariéru, cirkuloval v krvnej plazme a mal antioxidačné účinky na endokrinné bunky pankreasu.
Zistili sme od dávky závislú (0.8–16 uM) ochrannú úlohu verbascozidu na klonálnych a ľudských bunkách, a to v bazálnych aj stresových podmienkach. Tento účinok je spôsobený samotným verbascozidom a nie jeho metabolitmi kyselina kofeínová a hydroxytyrozol, ktoré sa v skutočnosti javia ako cytotoxické pri koncentrácii 16 uM. Koncentrácie preukázané ako účinné v našich experimentoch sú v súlade s koncentráciami opísanými u zvierat kŕmených verbaskozidom [20].
Hoci nevieme, či verbaskozid pôsobí extracelulárne väzbou na membránový receptor alebo je internalizovaný endocytózou a pôsobí intracelulárne, naše údaje potvrdzujú, že verbaskozid má antioxidačné a protizápalové vlastnosti a chráni bunky pred dysfunkciami spojenými so stresom ER znížením UPR a podpora mitochondriálnej dynamiky.
V skutočnosti sme zistili významný pokles obsahu ROS v bunkách ošetrených verbascozidom, čo je ďalej potvrdené znížením peroxidácie lipidov meranou prostredníctvom expresie HNE a akroleínu. Na rozdiel od väčšiny rastlinných polyfenolov sa aktivita verbaskozidu na zachytávanie ROS sleduje skôr nepriamo (prostredníctvom zvýšenej regulácie enzýmov odstraňujúcich ROS) než po priamych cestách. V skutočnosti zvyšuje génovú transkripciu niektorých antioxidačných enzýmov prostredníctvom aktivácie dráhy Nrf2 (NF-E2-príbuzný faktor 2) a prostredníctvom mechanizmu závislého od AhR (aryl hydrocarbon receptor) [24,29]. Ako také sme zistili zvýšenú expresiu SOD1 v bunkách ošetrených verbascozidom.
Homeostáza ROS je mimoriadne dôležitá v patológii buniek. V dôsledku nedostatku antioxidačných enzýmov nemožno neutralizovať zvýšenú produkciu ROS a vyvoláva sa nesprávne poskladanie proteínov podporujúce stres ER. ER stres vedie k zníženiu transkripcie a translácie inzulínu prostredníctvom aktivácie UPR [44,46]. Táto dráha má hlavný účel obnoviť funkciu ER prostredníctvom preprogramovania génovej expresie, avšak pri nadmernej stimulácii spúšťa apoptózu. Naše údaje naznačujú, že dôležitým účinkom verbascozidu je zmierniť UPR, čo umožňuje úpravy potrebné na opravu dysfunkcie ER bez toho, aby spôsobili apoptózu. Podľa tejto možnosti bola expresia proteínov BIP, HSP70 a PERK znížená v bunkách ošetrených verbascozidom a aktivácia dráhy PERK bola oslabená v reakcii na stres ER vyvolaný tunicamycínom. Podobný účinok bol zaznamenaný pre tyrozol v inzulinómovej NIT{6}} bunkovej línii [47].
Zvlášť zaujímavá je schopnosť verbascozidu modulovať aktiváciu PERK vetvy UPR. V -bunkách je táto dráha potrebná na udržanie bazálnej sekrečnej homeostázy a prežitia -buniek a pri cukrovke je vážne deregulovaná [41,48]. Ešte zaujímavejšie je, že bežné varianty v PERK prispievajú k riziku prediabetu a recesívne mutácie v géne EIF2AK3 (kódujúce PERK) sú základom náchylnosti na Wolcott-Rallisonov syndróm charakterizovaný permanentným novorodeneckým diabetom závislým od inzulínu [49,50].
Downregulácia IKB -NFKB zápalovej dráhy bola tiež zistená v našom systéme v prítomnosti verbascozidu. NFKB predstavuje hlavnú zápalovú dráhu v bunkách a jej trvalá aktivácia spúšťa kaskádu udalostí, ktoré kulminujú smrťou buniek. V stresovaných bunkách chráni zníženie expresie NFKB pankreatické bunky pred diabetogénnymi agensmi [27,51], čo ďalej podporuje aplikáciu verbascozidu v prevencii diabetu. Je zaujímavé, že signalizácia PERK aktivuje transkripčné faktory NFR2 (podieľa sa na redoxnej homeostáze) a NFKB, čím sa vysvetľuje antioxidačné a protizápalové účinky verbascozidu [40,52].
Naše údaje tiež odhaľujú dôležitú úlohu verbascozidu na mitochondriálnu aktivitu a dynamiku.
Markerom prevádzkovej kvality mitochondrií je ich dynamika, proces charakterizovaný koordinovanými cyklami fúznych a štiepnych udalostí, ktoré regulujú počet, distribúciu, morfológiu a membránový potenciál mitochondrií [39]. V súlade s touto možnosťou verbaskozid zlepšuje potenciál mitochondriálnej membrány tc3 v bazálnych aj stresových podmienkach. Účinok je opäť spôsobený verbaskozidom a nie jeho metabolitmi, pretože kyselina kofeínová nezlepšuje mitochondriálnu funkciu a hydroxytyrozol výrazne znižuje organelový potenciál. Zvýšená dynamika mitochondrií a zmeny v ich morfológii sa pozorovali sledovaním mitochondriálnych pohybov, čo naznačuje, že verbaskozid podporuje program mitomorfózy. Pretvarovanie bunkovej mitochondriálnej siete ovplyvňuje zostavenie superkomplexov dýchacieho reťazca, čím sa mení nielen metabolizmus buniek, ale aj ich redoxný stav a umožňuje bunkám lepšie pôsobiť proti oxidačnému stresu a zápalom [5,37,39].
Hoci molekulárny mechanizmus je stále neznámy, môžeme predpokladať, že verbaskozid, podobne ako iné polyfenoly, chráni mitochondriálnu DNA znížením koncentrácie ROS [53] a bráni otvoreniu prechodového póru mitochondriálnej permeability [54], čím zabezpečuje fyziologickú mitochondriálnu aktivitu. Ďalšou zaujímavou možnosťou je, že modifikácia dynamiky a aktivity mitochondrií je opäť sprostredkovaná pôsobením verbascozidu na UPR. Nedávny výskum v mitochondriálnej oblasti skutočne naznačuje, že miesta interakcie ER-mitochondrie hrajú kľúčovú úlohu pri kontrole mitochondriálnej dynamiky a aktivity v reakcii na oxidačný stres a PERK sa podieľa na tomto fenoméne [55]. Väčšina štúdií in vitro s polyfenolmi bola vykonaná na bunkových líniách, často nádorového pôvodu, ktoré sa od pôvodných buniek líšia metabolizmom a tvorbou ROS. Tu uvádzame dôkaz, že verbaskozid má ochranný účinok aj na ľudské izolované Langerhansove ostrovčeky, ktoré sú konečným cieľom intervencie pri cukrovke. Je zaujímavé, že polyfenol zmierňuje aktiváciu signalizácie PERK už za bazálnych podmienok, čím zvyšuje obsah inzulínu a zabraňuje mitochondriálnym dysfunkciám sprostredkovaným oxidačným stresom. Zostáva objasniť, či polyfenolový účinok na obsah inzulínu odráža schopnosť zlúčeniny zabrániť smrti buniek, zmierniť ER stres alebo priamo kontrolovať expresiu inzulínového génu, ako je uvedené pre iné polyfenolové zlúčeniny [56]. Tieto údaje sú obzvlášť dôležité vzhľadom na možné použitie verbascozidu ako doplnkovej liečby pri liečbe cukrovky.
5. Závery
Tu uvedené štúdie in vitro na klonálnych a ľudských bunkách naznačujú, že verbascozid má ochranné účinky proti dysfunkciám spojeným so stresom ER, čím zmierňuje aktiváciu vetvy PERK UPR a zlepšuje dynamiku mitochondrií. Keďže narušenie homeostázy ER spúšťa poškodenie buniek a diabetes, tieto údaje poskytujú odôvodnenie pre možné použitie verbascozidu ako nutraceutika pri prevencii a liečbe chorôb. Na efektívnu klinickú aplikáciu verbascozidu je však potrebné vyriešiť mnoho problémov. Napriek množstvu laboratórnych štúdií sú spoľahlivé klinické štúdie potvrdzujúce zdravotné účinky verbascozidu in vivo obmedzené. Okrem toho je pre budúce použitie tejto zlúčeniny v ľudskom zdraví nevyhnutné zvýšenie jej stability a biologickej dostupnosti. Z tohto hľadiska je verbaskozid zaujímavou molekulou, pretože jeho skelet má rôzne reaktívne miesta, ktoré možno modifikovať kombinačnou chémiou. Očakávame, že informácie vyplývajúce z týchto štúdií otvoria cesty pre terapeutickú moduláciu oxidačného stresu a zápalu pri patologických stavoch pomocou prírodných zlúčenín.
Doplnkové materiály: Nasledujúce materiály sú dostupné online na http://www.mdpi.com/2227-9059/8/12/582/s1. Obrázok S1: Účinky kyseliny kofeínu a hydroxytyrozolu na životaschopnosť buniek. Obrázok S2: Účinky verbascozidu na tunicamycínom indukovaný ER stres. Obrázok S3: Účinky kyseliny kofeínu a hydroxytyrozolu na potenciál mitochondriálnej membrány. Obrázok S4: Kvantitatívne obrazové analýzy mitochondrií v bunkách ošetrených kyselinou kofeínovou a hydroxytyrozolom. Video S1, S2 Videá: Dynamika mitochondrií zaznamenaná za bazálnych podmienok, v neprítomnosti (S1) alebo prítomnosti (S2) verbascozidu. Video S3, S4: Dynamika mitochondrií zaznamenaná v podmienkach oxidačného stresu, v neprítomnosti (S3) alebo prítomnosti (S4) verbascozidu.
Autorské príspevky: Konceptualizácia, AG, PM a CP; správa údajov, AG a PM; formálna analýza, AG a PM; získavanie financií, CP; vyšetrovanie, MC; metodika, AM a SG; zdroje, FB, RR a ADG; dozor, CP; validácia, AM, SG a MC; vizualizácia, AG a AM; písanie—originálny návrh, AG; písanie – recenzia a úprava, PM, AM, FB, RR, ADG, MC a CP Všetci autori si prečítali a súhlasili s publikovanou verziou rukopisu.
Financovanie: Tento výskum nezískal žiadne externé financovanie.
Poďakovanie: Radi by sme poďakovali Carlovi Corinovi a Mariovi Dell'Aglimu za činidlá a užitočnú diskusiu.
Konflikt záujmov: Autori nevyhlasujú žiadny konflikt záujmov.
Referencie
1. Cho, NH; Shaw, JE; Karuranga, S.; Huang, Y.; da Rocha Fernandes, JD; Ohlrogge, AW; Malanda, B. Diabetes Atlas IDF: Globálne odhady prevalencie diabetu na rok 2017 a projekcie na rok 2045. Diabetes Res. Clin. Prax. 2018, 138, 271–281. [CrossRef]
2. Leslie, RD; Palmer, J.; Schlott, NC; Lernmark, A. Diabetes na križovatke: Význam klasifikácie chorôb pre patofyziológiu a liečbu. Diabetológia 2016, 59, 13–20. [CrossRef] [PubMed]
3. Tokarz, VL; MacDonald, PE; Klip, A. Bunková biológia systémovej funkcie inzulínu. J. Cell Biol. 2018, 217, 2273–2289. [CrossRef] [PubMed]
4. Perego, C.; Da Dalt, L.; Pirillo, A.; Galli, A.; Catapano, AL; Norata, GD Metabolizmus cholesterolu, funkcia pankreatických buniek a diabetes. Biochim. et Biophys. Acta (BBA) Mol. Basis Dis. 2019, 1865, 2149–2156. [CrossRef] [PubMed]
5. Galli, A.; Alžírsko, M.; Marciani, P.; Schulte, C.; Leonardi, C.; Milani, P.; Mafoli, E.; Tedeschi, G.; Perego, C. Tvarovanie diferenciácie a fungovania pankreatických buniek: Vplyv mechanotransdukcie. Bunky 2020, 9, 413. [CrossRef]
6. Ashcroft, FM; Rorsman, P. Diabetes Mellitus a bunka: Posledných desať rokov. Cela 2012, 148, 1160–1171. [CrossRef] [PubMed]
7. Rosengren, AH; Braun, M.; Mahdi, T.; Andersson, SA; Travers, ME; Shigeto, M.; Zhang, E.; Almgren, P.; Ladenvall, C.; Axelsson, AS; a kol. Znížená exocytóza inzulínu v ľudských pankreatických bunkách s génovými variantmi spojenými s diabetom 2. Diabetes 2012, 61, 1726–1733. [CrossRef] [PubMed]
8. Polonský, KS Dynamika sekrécie inzulínu pri obezite a cukrovke. Int. J. Obes. 2000, 24, S29–S31. [CrossRef]
9. Roden, M.; Shulman, GI Integratívna biológia diabetu 2. typu. Príroda 2019, 576, 51–60. [CrossRef]
