Časť 3: Kanabinoidný receptor typu 2 podporuje fibrózu obličiek prostredníctvom riadenia signalizácie B-katenínu
Mar 06, 2022
Kontakt: emily.li@wecistanche.com
Zriedkavo sa však uvádzalo, že existuje vzťah medzi CB2 a -katenínom.
CB2 je členom rodiny GPCR. Predtým sme zistili, že CB2 je exprimovaný v tubulárnych bunkách, fibroblastoch a makrofágoch. CB2 je tiež exprimovaný v podocytoch a mezangiálnych bunkách.3 Úloha CB2 pri CKD bola v minulosti kontroverzná. Napriek zvýšenej regulácii mRNA CB2 a jej hlavného endogénneho ligandu 2-AG v modeloch CKD sa už skôr uvádzalo, že agonista CB2 by mohol zlepšiť renálnu fibrózu.“ Na rozdiel od toho, naše predchádzajúce štúdie identifikovali škodlivú úlohu CB2 pri renálnej fibróze prostredníctvom genetických knockout experimentov a testov so selektívnejším CB2 inverzným agonistom XL-001, novým inverzným agonistom CB2, ktorý vykazuje najsilnejšiu väzbovú afinitu k receptoru CB2, s najlepšou selektivitou voči receptoru CB1 (2594-násobok) a Ki 0,5 nM. Je potrebné poznamenať, že -katenín a jeho ciele sú potlačené genetickou abláciou alebo farmakologickou inhibíciou CB2. Vzhľadom na to, že CB2 je členom rodiny GPCR, CB2 by mohol modulovať -katenín. Túto hypotézu je však potrebné overiť. V tejto štúdii sme ukázali, že CB2 sprostredkováva aktiváciu katenínu prostredníctvom signálnej vlny GPCR.
Naša štúdia tiež potvrdzuje vznikajúcu úlohu endokanabinoidného systému pri renálnej fibróze. Z 2 hlavných endokanabinoidov má anandamid (N-arachidonoyletanolamín) vyššiu afinitu k CB1, zatiaľ čo 2-AG má podobnú afinitu k CB1 a CB2 (jeho afinita k CB1 je o niečo vyššia). Preto {{ 7}}AG je primárny endokanabinoidný agonista pre CB2 receptor. Najmä,obličkycortex vykazuje podobne vysoké bazálne hladiny anandamidu a 2-AG; avšak 2-hladiny AG sú zvýšené viac pri obštrukčných ochoreniachfibrózazaobličkysprevádzaný poklesom hladín anandamidu, čo vedie k aktivácii CB2 aj CB1.obličkovéfibrózabola preukázaná genetickými prístupmi v našej nedávnej štúdii“ a je ďalej potvrdená v tejto štúdii.
Hoci predchádzajúca správa ukázala, že CB2 je exprimovaný zápalovými bunkami aj podocytmi na vysokej bazálnej úrovni8, CB2 a jeho hlavný endogénny ligand 2-AG sú v skutočnosti upregulované po UUO a IRI.7 Predovšetkým pri renálnej fibróze myší a rôznych ľudských nefropatií je CB2 prevažne exprimovaný v renálnom tubulárnom epiteli, ako aj v intersticiálnych fibroblastoch a leukocytoch (obrázok 2; doplnkový obrázok S1), čo naznačuje, že upregulácia CB2 je bežným patologickým znakom vo fibrotických obličkách. V našich štúdiách na zvieratách sme prijali fluorescenčnú in situ hybridizáciu CB2, aby sme identifikovali jeho expresný vzor kvôli jeho nízkej cene. Farbenie odhalilo, že CB2 je exprimovaný hlavne v tubulárnom epiteli. Dôvod tejto nezrovnalosti môže spočívať v citlivosti fluorescenčnej in situ hybridizačnej techniky pri detekcii vysoko hojných mRNA a expozičnom čase pre zobrazovanie. Pozorovali sme CB2 nielen v bunkovej membráne, ale aj v tubulárnej cytoplazmatickej oblasti, čo naznačuje internalizáciu receptora do intracelulárnych kompartmentov, ako sú endozómy a lyzozómy.6 Špecifickosť fluorescenčného testu in situ hybridizácie bola potvrdená primárnou protilátkou CB2 a obe boli kontrolované u knockoutovaných myší CB2 (doplnkový obrázok S1). Je zaujímavé, že sme pozorovali tvorbu heterodiméru CB2 s CB1 pri ovplyvnení UUOobličkya tubulárne bunky indukované transformujúcim rastovým faktorom - - (doplnkový obrázok S4), čo naznačuje, že ich stimulačné účinky môžu byť synergické. Expresia CB1 však nebola ovplyvnená AM1241 alebo XL-001, čo zvyšuje zložitosť mechanizmov. Ako už bolo spomenuté v súvislosti so vzájomne inhibičnými účinkami CB2 a CB1, malo by sa vykonať viac štúdií na overenie ich vzájomne prepojených účinkov, čo je vyšetrovanie nad rámec súčasnej štúdie. Napriek tomu naše predchádzajúce a súčasné zistenia konzistentne odhaľujú, že blokáda CB2 je potenciálnou terapeutickou intervenčnou stratégiou na prevenciu renálnej fibrózy. Spolu s informovaním pacientov s CKD naše zistenia poskytujú zdravotné varovania pre rýchlo rastúcu skupinu.
Obrázok 10| Kanabinoidný receptor typu 2 (CB2) je downstream cieľom -katenínu (-cat).(a)Bioinformatická analýza odhalila prítomnosť putatívnych väzbových miest T-bunkového faktora (TCF) (TBS) v promótorovej oblasti ľudského a myšacieho CB2 génov. Sekvencie a polohy predpokladaných TBS v génoch CB2 sú zvýraznené (červeno), zatiaľ čo konsenzuálna sekvencia TBS je uvedená v spodnej časti tohto panelu. (b) Výsledky testu reprezentatívnej imunoprecipitácie chromatínu (ChlP) ukazujúce väzbu TCF alebo faktora viazania lymfoidného zosilňovača (LEF) -1 na oblasť promótora génu CB2. Ľudskéobličkyproximálne tubulárne (HKC) -8 bunky boli transfekované -katenínovým expresným plazmidom (pFlag- -cat) alebo pcDNA3 počas 24 hodín. Bunkové lyzáty sa vyzrážali protilátkou proti TCF, LEF{5}}, histónu H3 alebo neimunitnému IgG a čipový test sa uskutočnil na promótory génu CB2. Celkový zriedený lyzát sa použil ako celková vstupná genómová DNA. (c) Grafické znázornenie hladiny CB2 mRNA. Bunky HKC-8 boli transfekované plazmidom pFlag{10}}cat alebo pcDNA3. Celková RNA bola analyzovaná kvantitatívnou polymerázovou reťazovou reakciou.*P<0.05 versus="" the="" pcdna3="" group="" (n="3)." (d,e)representative="" western="" blot="" and="" quantitative="" data="" show="" overexpression="" of="" β-catenin-induced="" upregulation="" of=""><0.05 versus="" the="" pcdna3="" group="" (n="3)." (f="" representative="" graphs="" show="" β-catenin="" induced="" the="" formation="" of="" a="" cb2/β-arrestin="" 1(β-arr1)/="" proto-oncogene="" src="" complex.="" cell="" lysates="" were="" immunoprecipitated="" (ip)="" with="" an="" antibody="" against="" cb2,="" followed="" by="" immunoblotting="" (b)="" with="" anti-β-arrestin="" 1(β-arr1),="" or="" anti-src.(g-i)representative="" westem="" blot="" and="" quantitative="" data="" show="" the="" expression="" of="" cb2,="" β-arrestin="" 1(β-arr1),="" and="" src.="" hkc-8="" cells="" were="" transfected="" with="" pflag-β-cat="" (or="" pcdna3)="" plasmid="" in="" the="" presence="" or="" absence="" of="" cb2="" small="" interfering="" rna=""><0.001 versus="" the="" pcdna3=""><0.001 versus="" the="" flag-β-catenin="" group="" alone="" (n="">konzumentov endokanabinoidov na rekreačné aj liečebné účely. Chronické ťažké užívanie môže viesť k nepretržitej aktivácii receptorov CB1 aj CB2, čo môže mať negatívny vplyv naobličkyzdravie.
Hoci predchádzajúca správa ukázala, že -arestín 1 hrá úlohu pri renálnej fibróze a aktivácii -katenínu, ďalej podrobne objasňujeme funkčné mechanizmy dráhy -arestínom 1-sprostredkovanej CB2/-katenínu. Zistili sme, 1 je hojnejší ako -arestín 2 u myší IRI (údaje nie sú uvedené). Je dobre známe, že -arestín 1 je zodpovedný za aktiváciu GPCR a downstream signálnu transdukciu cez Src, AKT, proteínkinázu regulovanú extracelulárnym signálom (ERK1/2) , a iné kinázy.2že aktivácia Src by mohla sprostredkovať niekoľko profibróznych dráh, ako je receptor epidermálneho rastového faktora a signálny prevodník a aktivátor transkripcie (STAT)3," nemohli sme vylúčiť možnosť, že tieto dráhy sú tiež následnými dráhami CB2. Napriek tomu, naše pozorovania naznačujú, že signalizácia -katenínu je sprostredkovaná CB2-indukovaným komplexom -arestín 1/Src. Okrem toho je -arestín 1 hlavným regulátorom kontrolného bodu a slúži ako skeletový proteín na spustenie aktivácie - katenínu jeho translokáciou do jadra. Ďalším novým zistením je, že CB2 je cieľom -katenínu. V tejto štúdii bolo predtým identifikovaných niekoľko cieľov -katenínu. V tejto štúdii bolo teda identifikované vytvoriť recipročnú aktivačnú slučku, ktorá kooperatívne podporuje patogenézu renálnej fibrózy.
Stručne povedané, naše výsledky naznačujú, že aberantne exprimovaný CB2 sa kriticky podieľa na renálnej fibróze prostredníctvom -arestínom 1-indukovanej aktivácie -katenínu. -katenín spúšťa expresiu CB2, čo uľahčuje aktiváciu receptora a prenos signálnej vlny. Tieto výsledky (i) ilustrujú novú dráhu CB2/-katenínu, ktorá podporuje renálnu fibrózu a (ii) naznačujú, že cielená inhibícia CB2 alebo -arestínu 1 môže chrániť pred fibrózou prostredníctvom inhibície recipročnej aktivačnej slučky.
STRUČNÉ METÓDY
Podrobné metódy nájdete v časti Doplnkové metódy.
Zvieracie modely
Samce myší C57BL/6 boli zakúpené od Experimental Animal Center of Southern Medical University (Guangzhou, Čína). V prípade modelu IRI boli bilaterálne pedikly odstrihnuté mikroaneuryzmatickými svorkami počas 32 minút pri 37,5 stupňoch počas ischémie a obdobia zotavenia. Model UUO bol vytvorený trojitým podviazaním ľavého močovodu hodvábom 4-0 po brušnej stredovej incízii. V prípade modelu UIRI boli ľavé pedikly odstrihnuté na 35 minút pomocou svoriek pre mikroaneuryzmu a kontralaterálneobličkybol odstránený 1 deň pred usmrtením. Pre model nefropatie vyvolanej kyselinou listovou sa samcom myší C57BL/6 liečila kyselina listová prostredníctvom jedinej intraperitoneálnej injekcie 25 mg/kg telesnej hmotnosti. In vivo expresia Wnt1 alebo CB2 alebo knockdown -arestínu 1 u myší sa uskutočňovali hydrodynamickým prístupom dodania génov.",5 Podrobné experimentálne návrhy sú znázornené na obrázkoch 5a, 7a a 9a. Experimenty na zvieratách boli schválené výborom Animal Ethics Committee na Southern Medical University, Guangzhou, Čína. Chovné páry CB2 nulových myší (CB2/) vo veku 6-8 týždňov, na pozadí C57BL/6N, boli zakúpené od Cyagen Biosciences (číslo akcie KOCMP{ {19}}Cnr2; Cyagen Biosciences, Guangzhou, Čína). Deficit CB2 receptora bol potvrdený pomocou reverznej transkripcie-PCR.
Vzorky biopsie ľudskej obličky a bunková kultúra
Ľudskéobličkyrezy (3 μm) boli získané z renálnych biopsií vykonaných v nemocnici Nanfang a okresnej ľudovej nemocnici Huadu, Southern Medical University, Guangzhou, Čína. Normálne kontrolné biopsie boli odvodené od nenádorovýchobličkytkanívpacientov, ktorí mali renálny karcinóm. Štúdie zahŕňajúce rezy ľudskej obličky boli vykonané s informovaným súhlasom pacienta a boli schválené Inštitucionálnym etickým výborom v nemocnici Nanfang a okresnej ľudovej nemocnici Huadu. Ľudské proximálne tubulárne epitelové bunky (HKC-8) poskytla Dr. Lorraine C. Racusen (Johns Hopkins University, Baltimore, MD). Jadrové a cytoplazmatické frakcie boli oddelené komerčnou súpravou (BestBio, Shanghai, Čína).
Stanovenie sérového kreatinínu a hladín dusíka močoviny v krvi
Hladiny sérového kreatinínu a dusíka močoviny v krvi boli stanovené automatickým chemickým analyzátorom (AU480 Chemistry Analyzer, Beckman Coulter, Atlanta, GA).
In situ hybridizácia
Sondy CB2 boli zakúpené od Boster Technology, Wuhan, Čína.Obličkyrezy (8 μm) boli fixované 4 percentami formaldehydu a hodnotené fluorescenčným farbením CB2 s použitím komerčnej súpravy (MK2530, Boster Biological Technology, Wuhan, Čína).
Histológia a imunohistochemické a imunofluorescenčné farbenie
Zaliate parafínomobličkyrezy boli zafarbené pomocou kyseliny jodistej-Schiff a Massonovo trichrómové farbenie, aby sa identifikovali poškodené tubuly a určilo sa ukladanie kolagénu. Lézie boli kvantifikované pomocou počítačom podporovanej techniky. Imunohistochemické a imunofluorescenčné farbenie sa uskutočnilo v parafínových a zmrazených rezoch. Protilátky sú opísané v doplnkových metódach.
