Časť 3: Echinakozid izolovaný z Cistanche Tubulosa údajne stimuluje sekréciu rastového hormónu prostredníctvom aktivácie receptora grelínu

Echinakozid izolovaný z Cistanche tubulosa údajne stimuluje sekréciu rastového hormónu prostredníctvom aktivácie receptora grelínu

Chieh-Ju Wu 1, Mei-Yin Chien 2, Nan-Hei Lin 1, Yi-Chiao Lin 1, Wen-Ying Chen 3, Chao-Hsiang Chen 2,4,* a Jason TC Tzen 1,*

1 Absolventský inštitút biotechnológie, Národná univerzita Chung-Hsing, Taichung 402, Taiwan; baby159357520@gmail.com (C.-JW); CMNHEI@mohw.gov.tw (N.-HL); s9755702@gmail.com (Y.-CL)

2 Ko Da Pharmaceutical Co. Ltd., Taoyuan 324, Taiwan; rd1@koda.com.tw

3 Katedra veterinárnej medicíny, Národná univerzita Chung-Hsing, Taichung 402, Taiwan; wychen@dragon.nchu.edu.tw

4 Graduate Institute of Pharmacognosy, Taipei Medical University, Taipei 110, Taiwan

* Korešpondencia: gm@koda.com.tw (C.-HC); TCTZEN@dragon.nchu.edu.tw (JTCT); Tel.: plus 886-4-22840328 (ext. 776) (JTCT); Fax: plus 886-4-22853527 (JTCT)

Akademický redaktor: Pinarosa Avato

Prijaté: 22. januára 2019; Prijaté: 14. februára 2019; Zverejnené: 17.2.2019

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Abstrakt:Cistanchedruh, ženšen z púšte, má podľa tradičnej čínskej farmakopei mnoho biologických aktivít a používa sa ako liek proti starnutiu. Tri fenyletanoidové glykozidy –echinakozid, tubulozid A a akteozid boli detegované vo vodnom extrakte zCistanche tubulosa(Schenk) R. Wight a hlavná zložka,echinakozid, bol ďalej čistený.Echinakozids koncentráciou vyššou ako 10_6 M vykazovala významnú aktivitu na stimuláciu sekrécie rastového hormónu bunkami hypofýzy potkanov. Podobne ako v prípade hormónu uvoľňujúceho rastový hormón-6, syntetického analógu ghrelínu, stimuláciu sekrécie rastového hormónu echinakozidom inhibovala [D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11]-látka P , inverzný agonista grelínového receptora. Molekulárne modelovanie ukázalo, že všetky tri fenyletanoidové glykozidy adekvátne interagovali s väzbovou kapsou ghrelínového receptora a echinakozid vykazoval o niečo lepšiu interakciu s receptorom ako tubulozid A a akteozid. Výsledky naznačujú, že fenyletanoidové glykozidy, najmä echinakozid, sú aktívnymi zložkami, ktoré sú údajne zodpovedné za účinky C. tubulosa proti starnutiu a možno ich považovať za nepeptidové analógy ghrelínu.

Kľúčové slová: cistanchetubulosa;echinakozid; ghrelin; sekrécia rastového hormónu;fenyletanoidglykozidy

echinakozidvcistanchemá veľa účinkov

Pls kliknite sem pre časť 2

4. Materiály a metódy

4.1. Chemikálie a rastlinné materiály

Cistanchedeserticola YC Ma bola získaná z miestneho trhu a overená Dr. Nan-Hei Lin.Cistanchetubulosa (Schenk) R. Wight bola zakúpená od Sinopharm Tian-Li Pharmaceutical Co., Ltd., (Hangzhou, Čína). Acetonitril, kyselina mravčia a metanol v kvalite HPLC boli zakúpené od ECHO Chemical Co., Ltd, (Miaoli, Taiwan). Dulbeccovo modifikované Eaglovo médium (DMEM), dialyzované fetálne bovinné sérum (DFBS) a trypsín-EDTA boli zakúpené od Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). DNáza I bola zakúpená od spoločnosti Worthington Biochemical (Lakewood, NJ, USA). Hormón uvoľňujúci rastový hormón-6 (GHRP-6) bol získaný od Gen Way Biotech, Inc. (San Diego, CA, USA). Kolagenáza typu I a [D-Argl, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11]-látka P boli zakúpené od Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA). Súprava potkanieho rastového hormónu ELISA bola zakúpená od Sunred Biological Technology Corporation (Shanghai, Čína).

4.2. HPLC/UV a LC_MSn analýzy vodnej extrakcie Cistanche spp.

Sušené stonky (25 g).Cistanchedeserticola YC Ma aleboCistanchetubulosa (Schenk) R sa trikrát extrahovala 50}}0 ml destilovanej vody počas 60 minút pri 50 stupňoch vo vodnom kúpeli. Roztok sa prefiltroval cez 13 mm sýrsky filter s 0,45 um PP membránovým filtrom (Pall Corporation, Glen Cove, NY, USA) a podrobil sa nasledujúcim analýzam. Analyzovali sa chemické zložky v extraktoch

s použitím kolóny Syncronis C18 (vnútorný priemer 4,6 x 250 mm, 5 um, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) v systéme HPLC spojenej s detektorom fotodiódového poľa model 600E (Waters Corporation,

Milford, MA, USA). Mobilná fáza pozostávala z (A) vody obsahujúcej {{0}},1 % kyseliny mravčej a (B) acetonitrilu. Elučný gradient bol nasledujúci: 0-60 min, lineárny gradient od 14 percent B; 0–3 minúty, 14 percent až 17 percent B; 3–4 minúty, 17 percent B; 4–15 minút, 17 percent až 20 percent B; 15–20 minút, 20 percent B; 20–50 minút, 20 percent až 14 percent B; 50-60

min, 14 percent B. Vlnová dĺžka detekcie absorbancie ultrafialového žiarenia (UV) bola nastavená na 330 nm. Štvorpólový (LTQ) tandemový hmotnostný spektrometer (Thermo Electron, San Jose, CA, USA) vybavený elektrosprejovou ionizáciou (ESI) bol pripojený k systému Surveyor LC (Thermo Electron)

s 5 ul vzorkovacou slučkou. Elučný gradient bol nasledujúci: 0–90 min, lineárny gradient od 14 percent B; 0–24 minút, 14 percent až 17 percent B; 24–25 min, 17 percent B; 25–36 minút, 17 percent až 20 percent B; 36–37 min, 20 percent B; 37 – 80 minút,

20% to 14% B; 80–90 min, 14% B. The heated capillary temperature was set at 300℃ with a spray voltage of 4.5 kV. Negative ESI mode was firstly scanned ranging from m/z 400–1000. Data-dependent MSN was obtained using the high purity helium (>99,99 percenta) ako kolízny plyn.

4.3. Izolácia echinakozidu

Vodný extrakt zo sušenej stonky (25 g) C. tubulosa sa zahustil pri zníženom tlaku, čím sa získal tmavohnedý sirup. Surová extrakcia sa suspendovala v destilovanej vode a lyofilizovala sa v lyofilizačnom zariadení. Prášok 100 mg sa rozpustil v 5 ml destilovanej vody a podrobil sa čisteniu pomocou kolóny Sephadex LH-20 (100 ml; GE Healthcare Bio-Sciences AB, Švédsko) eluovanej 10 % vodným roztokom metanolu a monitoroval sa pomocou HPLC. . Frakcie obsahujúce echinakozid sa detegovali odčítaním absorbancie pri 245 nm a zozbierali sa pomocou autosamplera.

4.4. Zvieratá

Experimenty boli schválené Inštitucionálnym výborom pre starostlivosť a používanie zvierat Národnej univerzity Chung_Hsing s číslom schválenia IACUC 106-079. Samce potkanov Sprague_Dawley s hmotnosťou 250_300 g boli zakúpené od BioLASCO, Taiwan Co., Ltd. (Taipei, Taiwan). Dve zvieratá na klietku boli chované v kontrolovanom prostredí s teplotou 23°2, 60 až 10% vlhkosťou a 12 hodinovým cyklom svetlo/tma. Potkany boli kŕmené štandardnou stravou (poskytnuté kalórie).

28,7 % bielkovín, 13,4 % tuku a 57,9 % sacharidov, 5001 Rodent LabDiet, St. Louis, MO, USA) a destilovanej vody ad libitum.

4.5. Primárna bunková kultúra hypofýzy

Bunky hypofýzy boli izolované podľa modifikovanej enzymatickej disperznej metódy vyvinutej Yamazaki et al. [29]. Stručne povedané, samce potkanov Sprague Dawley boli anestetizované Zoletilom 50 (40 mg/kg, IP; Virbac Laboratories, Carros, Francúzsko) a predná hypofýza bola odstránená a dispergovaná do kultivácie buniek hypofýzy v suspenzii, ako bolo opísané vyššie [30].

4.6. Test sekrécie rastového hormónu

Primárne bunky prednej hypofýzy 4 x 104 buniek/jamka sa kultivovali pri 37 stupňoch pod 5 percentami CO2 počas 2 dní pred testom sekrécie rastového hormónu podľa protokolu opísaného vyššie [30].

Po odstránení kultivačného média boli bunky vyhladované v bezsérovom Dulbeccovom modifikovanom Eaglovom médiu (DMEM) počas 90 minút, aby sa stabilizovala bazálna sekrécia hormónov. Hladové médium bolo nahradené čerstvým DMEM obsahujúcim echinakozid (od 10_8 do 10_5 M) alebo GHRP-6 (agonista ľudského receptora ghrelínu, GHSR, 10_7 M) ako pozitívna kontrola a bunky sa inkubovali 15 a 30 minút pri 37 stupňoch pod 5 percentami CO2. Na detekciu antagonistického účinku sa bunky inkubovali s GHSR

inverzný agonista, [D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11]-látka P (0,5 uM), a potom ošetrené DMEM obsahujúcim echinakozid (10_5 M) alebo GHRP-6 (10_7 M) počas 30 min. Médium bolo zozbierané pre

stanovenie sekrécie rastového hormónu pomocou súpravy potkanieho rastového hormónu ELISA (Shanghai Sunred Biological Technology Corporation).

4.7. Štatistická analýza

Údaje boli prezentované ako stredné hodnoty o SD. Rozdiely boli analyzované T-testom. Štatistické výpočty sa uskutočnili pomocou GraphPad Prism 6 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA). Úroveň p < 0,05="" sa="" považovala="" za="" štatisticky="">

4.8. Homologické modelovanie a dokovanie

Homologické modelovanie a dokovanie k ľudskému receptoru ghrelínu, receptoru sekretagogu rastového hormónu (GHSR, prístupové číslo AAI13548), bolo stanovené na základe našej predchádzajúcej konštrukcie [21,24]. V stručnosti, kryštálové štruktúry 1 a 2 adrenergných receptorov (PDB 2YCY a 3PDS) s naviazanými ligandmi, kyanopindololom a FAUC50 boli použité ako templáty na konštrukciu štruktúry GHSR [31,32]. Štruktúra GHSR s najnižšou celkovou energiou PDF bola vybraná na ďalšie dokovanie s GHRP-6, echinakozidom, tubulozidom A a akteozidom. Všetky procesy modelovania boli vykonané pomocou platformy Discovery Studio 2.1 (http://accelrys.com/).

3D štruktúra GHRP-6 bola stiahnutá z databázy zlúčenín Pub-Chem na webovej stránke NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). 3D štruktúry echinakozidu, tubulozidu A a akteozidu boli vytvorené pomocou programu Chem3D (http://www.cambridgesoft.com/). Miesto viazania ligandu GHSR bolo definované ako sférický priestor s polomerom 14 Á od stredu väzbovej kapsy v simulácii dokovania. Pripojenie GHRP-6, echinakozidu, tubulozidu A alebo akteozidu k väzbovému miestu GHSR sa uskutočnilo in silico použitím modulu LibDock v balíku Discover Studio 2.1 a ďalej sa minimalizovalo pomocou algoritmu inteligentnej minimalizácie so silovým poľom CHARMm v Objavte balík Studio 2.1 [33]. Na porovnanie relatívnych väzbových afinit echinakozidu, tubulozidu A a akteozidu v GHSR sa na dokovanie použila aktívna stredová oblasť skonštruovaná pomocou GHRP-6 v GHSR a väzbová energia bola vypočítaná GEMDOCK (The Institute of Bioinformatics , Národná univerzita Chiao Tung, Taiwan).

Príspevky autorov: Animal experiments, C.-JW, Y.-CL a W.-YC; Identifikácia a čistenie: MY.C., N.-HL a C.-HC; Molekulárne modelovanie: C.-JW, Y.-CL a JTCT; Návrh a písanie projektu: C.-HC a JTCT

Financovanie: Práca bola čiastočne podporená grantom pre Jasona TC Tzena z Národnej univerzity Chung-Hsing (NCHU-102D604).

Poďakovanie: Autori ďakujú Tian-Shun Wengovi za zdieľanie jeho profesionálnych skúseností s používaním druhov Cistanche.

Konflikty záujmov: Všetci autori nevyhlasujú žiadne konflikty záujmov.

Referencie

1. Wang, T.; Zhang, X.; Xie, W. Cistanche deserticola YC Ma, "Desert ginseng": Prehľad. Am. J. Chin. Med. 2012,40, 1123–1141. [CrossRef] [PubMed]

2. Wang, T.; Chen, C.; Yang, M.; Deng, B.; Kirby, MG; Zhang, X. Etanolový extrakt Cistanche tubulosa sprostredkúva hladiny potkanieho pohlavného hormónu indukciou testikulárnych steroidogénnych enzýmov. Pharm. Biol. 2016, 54, 481–487. [CrossRef] [PubMed]

3. Lin, WY; Chun, Y.; Jack, C.; Kao, ST; Tsai, FJ; Liu, HP Molekulárne dráhy súvisiace s podporou dlhovekosti a kognitívnym zlepšením Cistanche tubulosa u Drosophila. Fytomedicína 2017, 26, 37–44. [CrossRef]

4. Wu, ČR; Lin, HC; Su, MH Reverzia pomocou vodných extraktov z Cistanche tubulosa z behaviorálnych deficitov v modeli potkanov podobných Alzheimerovej chorobe: Význam pre ukladanie amyloidu a funkciu centrálneho neurotransmitera. Doplnok BMC. Altern. Med. 2014, 14, 202. [CrossRef]

5. Xuan, GD; Liu, CQ Výskum účinku fenyletanoidných glykozidov (PEG) z Cistanche deserticola na anti-starnutie u starých myší vyvolané D-galaktózou. Zhong Yao Cai 2008, 31, 1385–1388. [PubMed]

6. Jiang, Y.; Tu, PF Analýza chemických zložiek v druhoch Cistanche. J. Chromatogr. 2009, 1216, 1970–1979. [CrossRef] [PubMed]

7. Gao, C.; Wang, C.; Wu, G. Cistanche celkové glykozidy na vplyv vaskulárnej demencie potkanov na učenie a pamäť a výskum mechanizmu. Brada. Herb. Med. 2005, 36, 1852–1855.

8. Li, F.; Yang, Y.; Zhu, P.; Chen, W.; Qi, D.; Shi, X.; Zhang, C.; Yang, Z.; Li, P. Echinakozid podporuje regeneráciu kostí zvýšením pomeru OPG/RANKL v bunkách MC3T3-E1. Fitoterapia 2012, 83, 1443–1450. [CrossRef]

9. Shimoda, H.; Tanaka, J.; Takahara, Y.; Takemoto, K.; Shan, SJ; Su, MH Hypocholesterolemické účinky extraktu Cistanche tubulosa, čínskeho tradičného surového lieku, u myší. Am. J. Chin. Med. 2009, 37, 1125–1138. [CrossRef]

10. Tang, F.; Hao, Y.; Zhang, X.; Qin, J. Účinok echinakozidu na fibrózu obličiek inhibíciou signálnej dráhy TGF- 1/Smads v modeli diabetickej nefropatie na myšiach DB/DB. Drug Des. Devel. Ther. 2017, 11,2813–2826. [CrossRef]

11. Xiong, WT; Gu, L.; Wang, C.; Slnko, HX; Liu, X. Antihyperglykemické a hypolipidemické účinky Cistanche tubulosa u diabetických DB/DB myší typu 2. J. Ethnopharmacol. 2013, 150, 935–945. [CrossRef] [PubMed]

12. Bao, XX; Ma, HH; Ding, H.; Li, WW; Zhu, M. Predbežná optimalizácia vzorca čínskej bylinnej medicíny na základe neuroprotektívnych účinkov na potkanom modeli Parkinsonovej choroby vyvolanej rotenónom. J. Integr. Med. 2018, 16, 290–296. [CrossRef] [PubMed]

13. Kojima, M.; Hosoda, H.; Dátum, Y.; Nakazato, M.; Matsuo, H.; Kanagawa, K. Ghrelin je acylovaný peptid uvoľňujúci rastový hormón zo žalúdka. Príroda 1999, 402, 656–660. [CrossRef] [PubMed]

14. Zigman, JM; Jones, JE; Lee, CE; Saper, CB; Elmquist, JK Expresia mRNA ghrelínového receptora v mozgu potkanov a myší. J. Comp. Neurol. 2006, 494, 528–548. [CrossRef] [PubMed]

15. Castaneda, TR; Tong, J.; Datta, R.; Culler, M.; Tschop, MH Ghrelin v regulácii telesnej hmotnosti a metabolizmu. Predné. Neuroendokrinol. 2010, 31, 44–60. [CrossRef] [PubMed]

16. Rudman, D.; Feller, AG; Nagraj, HS; Nemci, GA; Lalitha, PY; Goldberg, AF; Schlenker, RA; Cohn, L.; Rudman, IW; Mattson, DE Účinky ľudského rastového hormónu u mužov nad 60 rokov. N. Engl. J. Med. 1990, 323, 1–6. [CrossRef] [PubMed]

17. Liu, H.; Bravata, DM; Olkin, I.; Nayak, S.; Roberts, B.; Garber, AM; Hoffman, AR Systematický prehľad: Bezpečnosť a účinnosť rastového hormónu u zdravých starších ľudí. Ann. Stážista. Med. 2007, 146, 104–115. [CrossRef] [PubMed]

18. Giordano, R.; Bonelli, L.; Marinazzo, E.; Ghigo, E.; Arviat, E. Liečba rastovým hormónom v ľudskom starnutí: Výhody a riziká. Hormóny 2008, 7, 133–139. [CrossRef] [PubMed]

19. Sattler, FR Rastový hormón u starnúceho muža. Najlepšia prax. Res. Clin. Endocrinol. 2013, 27, 541–555. [CrossRef]

20. Lo, YH; Chen, YJ; Chang, CI; Lin, YW; Chen, CY; Lee, MR; Lee, VS; Tzen, JTC Teaghrelíny, unikátne acylované flavonoidové tetraglykozidy v čaji Chin-shin oolong, sú predpokladanými perorálnymi agonistami ghrelínového receptora.

J. Agric. Food Chem. 2014, 62, 5085–5091. [CrossRef]

21. Hsieh, SK; Lo, YH; Wu, CC; Chung, TY; Tzen, JTC Identifikácia biosyntetických medziproduktov teagrelínov a zlúčenín podobných teagrelínu v čajoch oolong a ich molekulárne pripojenie ku ghrelínovému receptoru.

J. Food Drug Anal. 2015, 23, 660–670. [CrossRef]

22. Hsieh, SK; Chung, TY; Li, YC; Lo, YH; Lin, NH; Kuo, PC; Chen, WY; Tzen, JTC Ginkgogrelíny, unikátne acylované flavonoidové glykozidy v Folium Ginkgo, stimulujú sekréciu rastového hormónu prostredníctvom aktivácie receptora grelínu. J. Ethnopharmacol. 2016, 193, 237–247. [CrossRef]

23. Han, L.; Mavis, BY; Liu, E.; Zhang, Y.; Li, W.; Pieseň, X.; Fu, F.; Gao, X. Štrukturálna charakterizácia a identifikácia fenyletanoidných glykozidov z Cistanches deserticola YC Ma pomocou UHPLC/ESI-QTOF-MS/MS. Phytochem. Anal. 2012, 23, 668–676. [CrossRef]

24. Lu, D.; Zhang, J.; Yang, Z.; Liu, H.; Li, S.; Wu, B.; Ma, Z. Kvantitatívna analýza Cistanches Herba pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie spojenej s detekciou diódového poľa a hmotnostnou spektrometriou s vysokým rozlíšením v kombinácii s chemometrickými metódami. J. Sep. Sci. 2013, 36, 1945–1952. [CrossRef]

25. Moon, M.; Kim, HG; Hwang, L.; Seo, JH; Kim, S.; Hwang, S.; Kim, S.; Lee, D.; Chung, H.; Oh, MS; a kol. Neuroprotektívny účinok ghrelínu v 1-metyl-4-fenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridínovom myšacom modeli Parkinsonovej choroby blokovaním mikrogliálnej aktivácie. Neurotox. Res. 2009, 15, 332–347. [CrossRef]

26. Lupien, SJ; Isabelle, OM; Hupbach, A.; Tu, MT; Buss, C.; Walker, D.; Pruessner, J.; Mcewen, BS Okrem konceptu stresu: Alostatická záťaž – vývojová biologická a kognitívna perspektíva. In Developmental Psychopathology: Volume Two: Developmental Neuroscience; John Wiley & Sons, Inc.: New York, NY, USA, 2015; s. 578–628.

27. Rizzo, M.; Rizvi, AA; Sudar, E.; Soskic, S.; Obradovič, M.; Montalto, G.; Boutjdir, M.; Michailidis, DP; Isenovic, ER Prehľad kardiovaskulárnych a antiaterogénnych účinkov ghrelínu. Curr. Pharm. Des. 2013, 19, 4953–4963. [CrossRef]

28. Holst, B.; Lang, M.; Brandt, E.; Bach, A.; Howard, A.; Frimurer, TM; Beck-Sickinger, A.; Schwartz, TW inverzné agonisty receptora ghrelínu: Identifikácia aktívneho peptidového jadra a jeho interakčných epitopov na receptore. Mol. Pharmacol. 2006, 70, 936-946. [CrossRef]

29. Yamazaki, M.; Nakamura, K.; Kobayashi, H.; Matsubara, M.; Hayashi, Y.; Kanagawa, K.; Sakai, T. Regulačný účinok ghrelínu na sekréciu rastového hormónu z perfundovaných buniek prednej hypofýzy potkana. J. Neuroendocrinol. 2002, 14, 156–162. [CrossRef]

30. Lo, YH; Chen, YJ; Chung, TY; Lin, NH; Chen, WY; Chen, CY; Lee, MR; Chou, CC; Tzen, JTC Emoghrelin, jedinečný derivát emodínu v Heshouwu, stimuluje sekréciu rastového hormónu prostredníctvom aktivácie receptora grelínu. J. Ethnopharmacol. 2015, 159, 1–8. [CrossRef]

31. Mouchametzianov, R.; Warne, T.; Edwards, PC; Serrano-Vega, MJ; Leslie, AG; Tate, CG; Schertler, GF Dve odlišné konformácie helixu 6 pozorované v antagonisticky viazaných štruktúrach beta1-adrenergného receptora. Proc. Natl. Akad. Sci. USA 2011, 108, 8228–8232. [CrossRef]

32. Rosenbaum, DM; Zhang, C.; Lyons, JA; Holl, R.; Aragao, D.; Arlow, DH; Rasmussen, SG; Choi, HJ; Devree, BT; Sunahara, RK; a kol. Štruktúra a funkcia ireverzibilného komplexu agonista-beta(2) adrenoceptor. Príroda 2011, 469, 236–240. [CrossRef]

33. Brooks, BR; Bruccoleri, RE; Olafson, BD; Štáty, DJ; Swaminathan, S.; Karplus, M. CHARMM – Program na výpočty makromolekulárnej energie, minimalizácie a dynamiky. J. Comput. Chem. 1983, 4, 187-217. [CrossRef]