Časť 3: Odtok horčíka z buniek Drosophila Kenyon je rozhodujúci pre normálnu dlhodobú pamäť vylepšenú diétou

pre viac informácií:{0}}

Pls kliknite sem pre časť 2

Kliknite naVýhody a vedľajšie účinky Cistanche na pamäť

bol obmedzený na dospelé muchy, čo naznačuje, že UEX má trvalejšiu úlohu vo fyziológii neurónov. Naproti tomu zníženie expresie uex v abs alebo a{0}}b0 neurónoch nenarušilo LTM. Aktivita neurónov a0b0 je potrebná po tréningu na konsolidáciu apetitívneho LTM (Krashes a Waddell, 2008), zatiaľ čo výstup abc a abs KC, spolu a oddelene, je potrebné na jeho expresiu (Krashes a Waddell, 2008; Perisse et al., 2013). Preto pozorovanie normálneho výkonu LTM u múch so stratou funkcie uex v neurónoch abs a a0b0 argumentuje proti všeobecnému nedostatku funkcie neurónov ab pri manipulácii s uex.

Diétny Mg2 plus nemohol zvýšiť chybný výkon LTM u múch, ktoré boli konštitutívne uex mutantné alebo prechovávali ab KC-obmedzenú stratu funkcie uex. Avšak expresia uex v ab KC mutantných múch uex obnovila schopnosť Mg2 plus zvýšiť výkon. Preto sú ab KC bunkovým lokusom pre Mg2 plus-enhancedPamäťv muške.

Možno sa zdá byť kontraintuitívne, že v KC je potrebný odtok horčíka riadený UEX na podporuPamäť- zosilňujúce účinky Mg2 plus kŕmenie, keď diétny Mg2 plus zvyšuje KC [Mg2 plus ]i. V tejto fáze môžeme len špekulovať, prečo je to tak. Predpokladáme, že najmä mozog a ab KC sa musia vyváženým spôsobom prispôsobiť vyšším hladinám intracelulárneho a extracelulárneho Mg2 plus, ktoré sú výsledkom doplnkov stravy. Naše živé zobrazovanie KC [Mg2 plus ]i v mozgoch divokého typu a mutantných mozgoch uex naznačuje, že eflux riadený UEX je pravdepodobne základným faktorom aktívneho a možno stimulmi vyvolaného homeostatického udržiavania týchto zvýšených hladín.

Mnohé typy cicavčích buniek vytláčajú Mg2 plus spôsobom závislým od cAMP, niekoľko minút po vystavení b-adrenergnej stimulácii (Romani a Scarpa, 2000; Vormann a Gunther, 1987; Jakob a kol., 1989; Romani a Scarpa, 1990b; Romani a Scarpa, 1990a; Vormann a Gunther, 1987; Gunther a kol., 1990; Howarth a kol., 1994). Prítomnosť domény CNBH naznačuje, že UEX a CNNM by mohli byť priamo regulované cAMP. Testovali sme dôležitosť CNBH zavedením substitúcie aminokyseliny R622K, ktorá by mala blokovať väzbu cAMP v UEX CNBH. Táto jemná mutácia zrušila schopnosť transgénu uexR622K obnoviť výkon LTM u mušiek s mutantom uex. CRISPR sme tiež použili na mutáciu CNBH v natívnom lokuse uex. Hoci vymazanie CNBH z CNNM4 zrušilo aktivitu Mg2 plus eflux (Chen et al., 2018), muchy homozygotné pre léziu uexT626NRR boli životaschopné, čo dokazuje, že si zachovávajú dostatočnú úroveň funkcie UEX. Tieto muchy však vykazovali okamžité a dlhodobé zhoršeniePamäť. Okrem toho sa výkonnosť mušiek uexT626NRR nedala zvýšiť kŕmením Mg2 plus. Tieto údaje ukazujú, že neporušená CNBH je kritickým prvkomPamäť-príslušná funkcia UEX. Väzba klatrínových adaptérových proteínov na CNNM4 CNBH sa podieľa na bazolaterálnom zacielení (Hirata et al., 2014), čo naznačuje, že UEXT626NRR môže byť nevhodne lokalizovaný v KC. Okrem toho expresia KC mutantného variantu CNNM2 E122K, ktorý si zachováva zvyškovú funkciu

ale má poruchu obchodovania (Arjona et al., 2014), neobnovil poruchu uex LTM.

Aj keď bolo spochybnené, či domény CNNM2/3 CNBH viažu cyklické nukleotidy (Chen et al., 2018), zistili sme, že FSK vyvolalo zvýšenie ab KC [Mg2 plus]i, ktoré bolo citlivé na mutáciu uex, a že UEX: :HA bola chybne lokalizovaná v rut2080 adenylátcykláze (Han et al., 1992) a dnc1 fosfodiesteráze (Dudai et al., 1976), ktoré sa učia defektné mutantné muchy. Zatiaľ čo značka UEX::HA bola rovnomerne distribuovaná v g, abc a abs KC v muchách divokého typu, značka UEX::HA bola znížená v g a abs KC a bola silnejšia v abc neurónoch v mutantoch rut2080 a dnc1. Chronické manipulácie cAMP v mutantoch sú preto v súlade s cAMP ovplyvňujúcim lokalizáciu UEX, možno interakciou s CNBH. Okrem toho môže zmenená lokalizácia UEX prispieť kPamäťdefekty mušiek rut2080 a dnc1.

Naše fyziologické údaje s použitím horčíkovej zelene v kultúre cicavčích buniek a geneticky kódovaného MagIC reportéra v ab KC demonštrujú, že fly UEX uľahčuje Mg2 plus eflux. Stimulácia mozgu muchy pomocou FSK vyvolala väčší nárast ab KC [Mg2 plus ]i v uex mutantných mozgoch ako v kontrolách divokého typu, čo poskytuje prvý dôkaz, že UEX obmedzuje zvýšenie [Mg2 plus]i v Drosophila KCs. Naše nahrávky MagIC tiež odhalili pomalú osciláciu (so stredom okolo 0,015 Hz, približne raz za minútu) ab KC [Mg2 plus ]i, ktorá bola závislá od UEX. Zatiaľ nerozumieme fyziologickej funkcii tejto fluktuácie [Mg2 plus ]i, hoci pravdepodobne odráža vlastnosť buniek na úrovni homeostatických systémov. Biochemická oscilačná aktivita hrá kľúčovú úlohu v mnohých aspektoch bunkovej fyziológie (Nova´k a Tyson, 2008). Najpozoruhodnejšie je, že cirkadiánne načasované kolísanie [Mg2 plus]i spája dynamický bunkový energetický metabolizmus s hodinami riadenou transláciou prostredníctvom Mg2 plus senzitívnej dráhy mTOR (mechanistický cieľ rapamycínu) (Feeney et al., 2016). Je preto možné, že pomalé Mg2 plus oscilácie by mohli zjednotiť úlohy pre cAMP, UEX, energetický tok (Plac¸ais a kol., 2017) a transláciu závislú od mTOR, ktorá je základom synaptickej plasticity relevantnej pre LTM (Casadio a kol., 1999 Huber a kol., 2000; Beaumont a kol., 2001; Hou a Klann, 2004; Hoeffer a kol., 2008).

Kontakt pre zdieľanie reagencií a zdrojov

Úplný zoznam činidiel si môžete pozrieť v tabuľke kľúčových zdrojov.

Ďalšie informácie a žiadosti o zdroje a reagencie by mali byť adresované vedúcemu kontaktu Scottovi Waddellovi (scott.waddell@cncb.ox.ac.uk), ktorý ich splní.

Experimentálny model a detaily predmetu

Mušie kmene

Pokiaľ nie je uvedené inak, muchy boli chované na štandardnom krmive z kukuričnej múky v 12-hodinovom cykle svetlo-tma pri 60 percentnej vlhkosti a 25 °C. Testovacie a kontrolné muchy pre experimenty GAL80ts boli chované pri 18 °C. V experimentoch boli použité mušky so zmiešaným pohlavím staré 1 až 7- dni.

Canton-S bol kmeň divokého typu. Riadiace línie GAL4 použité v tejto štúdii sú c739-GAL4 (McGuire a kol., 2001), c305a-GAL4 (Krashes a kol., 2007), NP{10}}GAL4 (Tanaka a kol., 2004), 0770-GAL4 (Gohl a kol., 2011), MB247-GAL4 (Zars a kol., 2000), nSyb-GAL4 (Bloomington Drosophila Stock Centre, BDSC 51635), elav-GAL4 (BDSC, 8765) a uex-GAL4 (Kvon a kol., 2014); Vienna Drosophila Resource Center, VDRC, VT23256-GAL4). Línie UAS získané zo skladového centra sú UAS-CD8::GFP (BDSC, 5136), UAS-NmdarRNAi (BDSC, 25941) a UAS-uexRNAi (BDSC, 36116). Sú opísané rôzne mutantné a transgénne línie, uexMI01943 (Venken et al., 2011; BDSC, 32805), uexNC1 (BDSC, 7167), rut2080 (Han et al., 1992) a dnc1 (Dudai et al., 1976), 1976 tubP-GAL80ts (McGuire a kol., 2003) a PhsILMiT (BDSC, 24613). Minos excízne línie uexMI01943.ex1 a uexMI01943.ex2 boli vytvorené s použitím postupu opísaného v Arc et al., 1997. Podrobná schéma párenia je znázornená na obrázku 2 – dodatok k obrázku 2A. Potenciálne excízne línie boli vytvorené z jednotlivých múch vykazujúcich fenotyp žltej farby tela. Genómová DNA bola extrahovaná zo šiestich takýchto línií a DNA lemujúca uexMI01943 MiMIC bola amplifikovaná pomocou PCR a sekvenovaná. Línie uexMI01943.ex1 a uexMI01943.ex2 boli identifikované tak, aby obsahovali presné excízie, pričom sa obnovila genómová sekvencia divokého typu. Pozrite si tabuľku zdrojov pre PCR a sekvencie sekvenčných primérov. Schéma detailu sekvencie inzercie uexMI01943 MiMIC a excízie je znázornená na obrázku 2 – doplnok k obrázku 2B. Na konštrukciu transgénnych múch UAS-uex sa pomocou RT-PCR klonovala kódujúca sekvencia uex s plnou dĺžkou (CDS). Celková RNA bola izolovaná z múch divokého typu pomocou TRIZOL (Thermo Fisher, 15596018) a reverzne transkribovaná do cDNA s použitím systému syntézy prvého vlákna SuperScript III (Invitrogen, 18080400). Táto celková zmes cDNA sa použila ako templát na amplifikáciu uex CDS. Pozrite si tabuľku zdrojov pre sekvencie primérov. Produkt PCR sa štiepil SacII a Xhol a potom sa ligoval do komplementárnych miest pUAST (Brand a Perrimon, 1993). pUAST klonovaný uex CDS bol plne sekvenovaný a overený, že predstavuje 2505 bp divého typu uex cDNA čítacieho rámca (všimnite si, všetky štyri možné izoformy uex mRNA, FlyBase Release 6, kódujú rovnaký proteín s 834 aminokyselinami). Transgénne muchy UAS-uex sa generovali komerčne (Bestgene) transformáciou vektorom pUAST-uex. Mapovali sme inzerciu UAS-uex chromozómu 10 nezávislých transgénnych línií a behaviorálne testovali tri línie, označené UAS-uex3M, UAS-uex5M a UAS-uex8M, s inzertom na treťom chromozóme. Mušky UAS-uex3M boli tie, ktoré sa používali počas celej štúdie a v rukopise sa označujú ako UAS-uex.

Transgénne muchy UAS-uexR622K boli generované podobne ako muchy UAS-uex. Missense mutácia bola zavedená v kodóne 622 UEX v doméne CNBH, napodobňujúc to, čo bolo predtým skonštruované v cAMP-väzbovej doméne regulačnej podjednotky proteínkinázy A (Bubis et al., 1988). Mutácia mení CGT kodón kódujúci Arg na AAA kódujúci Lys. Mutácia bola zavedená do divokého typu uex CDS pomocou Gibson Assembly Master Mix (New England Biolabs, E2621S), ako je opísané v 'Vylepšené metódy pre miestne riadenú mutagenézu pomocou Gibson Assembly Master Mix' (poznámka NEB Application Note). Použité súbory primérov sú podrobne uvedené v tabuľke zdrojov. Produkt zostavy Gibson bol ďalej amplifikovaný pomocou PCR a výsledný produkt bol klonovaný do vektora pUAST a sekvenovaný. Transgénne inzercie boli mapované ako pre UAS-uex a jedna z dvoch inzercií mapovaná na tretí chromozóm bola použitá v experimentoch správania.

Transgénne línie múch UAS-CNNM2, UAS-CNNM2E122K, UAS-CNNM2E357K, UAS-CNNM2S269W a UAS-CNNM2T568I sa vytvorili transformáciou konštruktmi pUAST obsahujúcimi verzie myšieho CNNM2 cDNA značenej HA:2 divokého typu alebo bodovo mutované (mCNNM2: HA), opísané v Arjona et al., 2014. Divoký typ alebo mutované verzie CNNM2 boli amplifikované z pôvodných klonov mCNNM2::HA v pCiNEO_IRES_GFP plazmidoch (Arjona a kol., 2014). Priméry sú podrobne uvedené v tabuľke zdrojov. Produkty PCR boli štiepené Xhol a Xbal a ligované do komplementárnych miest v pUAST. Inzercie každého konštruktu na treťom chromozóme boli identifikované mapovaním, ako je opísané vyššie, a boli použité v experimentoch správania. Všimnite si, že všetky konštrukty kódujúce CNNM2 použité v štúdii sú označené HA, aj keď sa zápis často vynecháva kvôli stručnosti.

Transgénne línie múch UAS-MagFRET{1}} boli vytvorené transformáciou konštruktmi pJFRC-MUH obsahujúcimi MagFRET-1 CDS, ktorý bol subklonovaný z plazmidu pCMVMagFRET-1, opísaného v Lindenburg et al. , 2013. Priméry sú podrobne uvedené v tabuľke zdrojov. Produkty PCR boli štiepené Xhol a Xbal a ligované do komplementárnych miest v pJFRC-MUH. Vloženie konštruktu bolo sprostredkované miestne špecifickým transgenéznym systémom a miesto pristátia je attP2 (na treťom chromozóme).

Transgénne línie múch UAS-MagIC a UAS-MARIO boli vytvorené transformáciou s pTW konštruktmi obsahujúcimi MagIC/MARIO CDS, ktoré boli subklonované z plazmidov MagIC/pcDNA3 a MARIO/pcDNA3, láskavo poskytol T. Nagai: (Maeshima et al., 2018 a Koldenkova et al., 2015). MagIC/MARIO CDS sa najskôr amplifikovali PCR z MARIO/pcDNA3 a MagIC/pcDNA3 a klonovali sa do vektora pENTR/D-TOPO. Priméry sú podrobne uvedené v tabuľke zdrojov. Všimnite si, že MARIO sense primer bol navrhnutý tak, aby sa prekrýval so sekvenciou pcDNA3 v mieste inzercie MARIO. MagIC/MARIO CDS boli ďalej klonované do Gateway destinačného vektora pTW (Drosophila Gateway Vector Collection).

UexD lokus upravený CRISPR/Cas9 bol komerčne vytvorený spoločnosťou GenetiVision. Schéma úprav je znázornená na obrázku 2 – dodatok k obrázku 2C. Lokus uex sedí v obrátenej orientácii na chromozóme 2R a pokrýva oblasť 49 141 bp medzi pozíciou 3 900 285 a 3 949 425 (FlyBase, vydanie 6). Nasledujúci popis sa týka týchto súradníc v rámci lokusu uex. Na vytvorenie uexD sa skonštruovali dva plazmidy gRNA a jeden plazmid s donorom dvojvláknovej DNA (dsDNA) a vstrekli sa do embryí nos-Cas9 (BDSC, 54591). Ako je znázornené na obrázku 2 - doplnok k obrázku 2C a podrobne opísané v tabuľke zdrojov, upstream gRNA1 leží v exóne 6 a zameriava sa na sekvenciu 30 930 30 952. Zodpovedajúca downstream gRNA2 leží medzi exónom 7 a exónom 8 medzi 33 988 a 34 010. Obe gRNA boli jednotlivo klonované do pCFD3-dU63gRNA (Addgene, 49410). Miesto rezu gRNA1 by malo byť medzi 30 946 a 30 947, zatiaľ čo gRNA2 by malo viesť k rezu medzi 33 993 a 33 994. 795 bp upstream homológne rameno (30,152,30,946) a 977 bp downstream homológne rameno (33,994,34,970) boli klonované do donorového DNA plazmidu. Terminačný kodón (STOP, vo všetkých troch čítacích rámcoch) bol vložený medzi dve homologické ramená a nasledovala GFP kazeta riadená promótorom 3xP3. Základný reťazec DNA darcu bol vytvorený spoločnosťou GenetiVision a kompletná sekvencia darcu pre líniu uexD je k dispozícii na požiadanie. Úspešná úprava bola identifikovaná expresiou GFP v očiach muchy a potvrdená genómovou PCR a sekvenovaním. V muchách uexD bol 3047 bp fragment od 30 947 do 33 993 nahradený sekvenciou medzi dvoma homologickými ramenami v donorovom plazmide, hlavne STOP signálom a GFP kazetou. Alela uexD skracuje uex ORF. Priméry použité na overenie genómovej PCR sú podrobne uvedené v tabuľke zdrojov. Transgén nos-Cas9 (na X chromozóme) bol odstránený krížením.

Mušky uex::HA upravené CRISPR/Cas{0}} boli generované spoločnosťou WellGenetics pomocou systému ScarlessDsRed vyvinutého laboratóriom Kate O'Connor-Giles (nepublikované, pôvodný plazmid darovaný spoločnosti Addgene, #80822). Značka 6XHA bola fúzovaná v rámci ku karboxy-koncu UEX vložením sekvencie kódujúcej 6XHA bezprostredne pred natívny STOP kodón v lokuse uex (obrázok 3 - doplnok k obrázku 1A). Proces zahŕňal dva hlavné kroky. V kroku 1 sa značka 6XHA spolu s transpozónom pBAC obsahujúcim kazetu DsRed vložila do rámca so STOP kodónom uex pomocou úpravy genómu sprostredkovanej CRISPR/Cas{11}} pomocou homológne riadenej opravy (HDR) s použitím 1 gRNA a jeden donor plazmidu dsDNA. GRNA leží 50 bp od uex STOP kodónu a mala by riadiť rez medzi 48 587 a 48 588. GRNA sa klonovala do plazmidu pCFD3-dU63gRNA. 1200 bp upstream rameno (47,438,48,637) a 1,033 bp downstream rameno (48,641,49,673) boli klonované do donorového DNA plazmidu so základným reťazcom pUC57-Kan (2579 bp). Pozri tabuľku zdrojov pre sekvencie gRNA a primérov. Mutácia Protospacer Adjacent Motif (PAM) (TCC na TCG, 48 581 48 583) bola zavedená do darcu na podporu HDR. Značka 6XHA nasledovaná transpozónom pBAC obsahujúcim kazetu DsRed riadenú promótorom 3XP3 bola vložená medzi dve homologické ramená. Rozpoznávací motív pBAC TTAA je vložený do STOP kodónu 6XHA. Kompletné poradie darcov je k dispozícii na požiadanie. Donorové a gRNA plazmidy boli injikované do embryí nos-Cas9 (NIG-FLY, CAS0002). Úspešná úprava bola identifikovaná expresiou DsRed v očiach muchy a potvrdená genómovou PCR a sekvenovaním. Identifikovalo sa šesť nezávislých pozitívnych línií a štyri prešli validáciou PCR. Z týchto štyroch línií ešte jedna prešla sekvenčnou validáciou a je strednou líniou znázornenou na obrázku 3 – doplnok k obrázku 1A. Z tejto línie boli založené štyri izogenizované a vyvážené zásoby. V kroku 2 bol selekčný marker DsRed vyrezaný transpozíciou PiggyBac (PBac) s pomocnou líniou Tub-PBac (BDSC, 8285). Päť homozygotných životaschopných línií s úspešnou excíziou bolo validovaných genómovou PCR a sekvenovaním. Jeden označený uex::HA bol použitý v experimentoch v rukopise.

Na skonštruovanie mušiek uexT626NRR upravených CRISPR/Cas{{0}}} sme navrhli a naklonovali gRNA a navrhli a objednali (Sigma) jednovláknový oligo-deoxynukleotid (ssODN). Sekvencie gRNA a ssODN sú podrobne uvedené v tabuľke zdrojov. Keďže sme plánovali uskutočniť jednu substitúciu aminokyseliny R622K v doméne UEX CNBH, donor ssODN s veľkosťou 120 bp bol sústredený na kodón R622 a nesie zmenu kodónu CGT na AAA (na 31 179,31 181) zodpovedajúcu R622K. Očakávané miesto rezu gRNA (medzi 31 192 a 31 193) je vzdialené len 11 bp od očakávaného bodu mutácie. Na zvýšenie pravdepodobnosti HDR, ktorá je údajne nízka pri použití ssODN ako darcu, sme komerčne (GenetiVision) vstrekli editačný materiál do 250 embryí lig4 KO vasa-Cas (Zimmer et al., 2016). Z injikovaných embryí sme získali 37 životaschopných múch G0. Celkom 224 múch G1 bolo podrobených genómovej PCR s jednou muchou a sekvenovaniu na skríning očakávanej mutácie. Priméry podrobne uvedené v tabuľke zdrojov. Identifikovali sme 59 predpokladaných upravených línií z prvého kola skríningu a z nich 12 bolo potvrdených. Napriek použitiu lig4 KO vasa-Cas9 sme namiesto bodových mutácií sprostredkovaných HDR detegovali iba nehomologické udalosti spájania koncov (NHEJ). Z 12 upravených línií bolo šesť homozygotných smrteľných a ďalších šesť bolo životaschopných. V štyroch homozygotných životaschopných líniách sme našli náhradu G za T v polohe 31 192 spolu so 6 bp vložením ATCTTC do rámca medzi 31 192 a 31 193. Táto úprava NHEJ zodpovedá modelu T626! Zmena NRR v proteínovej sekvencii UEX (obrázok 5A). X chromozóm vasa-Cas9 bol odstránený z týchto línií krížením a jedna línia označená ako uexT626NRR bola použitá v experimentoch správania v rukopise.

Podrobnosti metódy

Behaviorálne experimenty

Na behaviorálne experimenty v T-bludisku sa použili 1–7-dňové mušky zmiešaného pohlavia. Vône boli 4-metylcyklohexanol (MCH) a 3-oktanol (OCT), zriedené ~1:103 (konkrétne 9 ml MCH alebo 7 ml OCT v 8 ml minerálneho oleja). Všetky experimenty sa uskutočňovali pri 23 °C a 55 – 65 percentách relatívnej vlhkosti.

Chuť do jedla okamžite a neskôrPamäťexperimenty sa uskutočnili v podstate tak, ako je opísané (Krashes a Waddell, 2008; Perisse et al., 2013). Dávky 100 – 120 múch boli vyhladované počas 21 – 23 hodín pred tréningom v 35 ml hladiacich liekovkách obsahujúcich ~2 ml 1% agaru (ako zdroj vody) a 2 cm 4 cm filtračný papier. Cukrové papiere (5 cm 7,5 cm) na tréning boli pripravené namáčaním so 4 ml 2 M sacharózy a sušením cez noc. Vodné papiere rovnakej veľkosti sa namočili vodou a nechali sa cez noc. Pre apetitívny tréning boli muchy prenesené z hladovej skúmavky do tréningovej skúmavky so suchým „vodným“ papierom a ihneď pripevnené k tréningovému ramenu T-bludiska a vystavené CS pachu na 2 minúty, po ktorých nasledovalo 30 s čistý vzduch. Muchy boli potom prenesené do inej tréningovej skúmavky so suchým cukrovým papierom, pripevnené k T-bludisku a vystavené CS plus vôni na 2 minúty. OkamžitýPamäťbol testovaný prepravou múch do bodu T-voľby a ponechaním 2 minút na výber medzi dvoma prúdmi zápachu. Na testovanie 24 hodPamäťmuchy boli odstránené z tréningovej skúmavky a prenesené do štandardných fľaštičiek s kukuričnou múkou na 1 hodinu, potom prenesené späť do hladových fľaštičiek na 23 hodín do testovania. Výkonnostný index sa vypočítal ako počet múch v ramene CS plus mínus počet v ramene CS vydelený celkovým počtom múch. MCH a OCT sa striedavo používali ako CS plus alebo CS a jedna vzorka alebo n predstavuje priemerný index výkonnosti z dvoch recipročne trénovaných skupín.

Na testy správania po kŕmení Mg2 plus boli 1 – 2- dňové muchy umiestnené v liekovkách s Mg2 plus doplnkom krmiva na 1 – 5 dní pred tým, ako boli vyhladované kvôli apetitívnemu tréningu a testovaniu, ako je opísané vyššie. Na prípravu 80 mM [Mg2 plus ] krmiva sa 40 ml 1 M roztoku MgCl2 pridalo do 460 ml normálneho tekutého krmiva pre muchy; Potrava 1 mM [Mg2 plus] sa pripravila zriedením 0,5 ml 1 M MgCl2 v 39,5 ml vody MilliQ a jej pridaním do 460 ml tekutej potravy. Potraviny boli rozdelené na alikvóty a ochladené, aby stuhli. Potrava doplnená MgS04 a CaCl2 bola pripravená rovnakým spôsobom.

Averzívna okamžitá a 24 hodPamäťexperimenty sa uskutočnili tak, ako už bolo opísané (Hirano a kol., 2013; Perisse a kol., 2016; Tully a Quinn, 1985). Skupiny 100 až 120 múch boli trénované buď jedným cyklom averzívneho tréningu, alebo piatimi cyklami rozmiestnenými po 15-minútových intervaloch medzi pokusmi (rozložený tréning). Pre averzívne okamžitéPamäť, muchy boli testované po jednocyklovom tréningu. Averzívne 24 hodPamäťbol testovaný pomocou dvoch rôznych protokolov. V protokole uľahčenom hladovaním boli muchy vyhladované 16 hodín pred jednocyklovým tréningom (Hirano et al., 2013). Pri tréningu s rozstupom sa muchy pred tréningom nehladovali. Muchy boli kŕmené bežnou potravou pre muchy počas 24 hodín po tréningu uľahčenom pôstom a rozmiestnenom tréningu a potom boli testované naPamäťvýkon. Počas každého averzívneho tréningového cyklu boli muchy vystavené na 1 minútu prvému zápachu (CS plus) spárovanému s dvanástimi 90 V elektrickými výbojmi v 5-sekundových intervaloch. Po 45 sekundách čistého vzduchu bol prítomný druhý zápach (CS ) počas 1 minúty bez šoku. Výkonnostný index sa vypočítal ako počet múch v ramene CS mínus počet v ramene CS plus

rameno, vydelené celkovým počtom múch. MCH a OCT sa striedavo používali ako CS plus alebo CS a jedna vzorka alebo n predstavuje priemerný index výkonnosti z dvoch recipročne trénovaných skupín.

Testy senzorickej ostrosti (obrázok 2 – zdrojové údaje 1) sa uskutočnili podľa popisu (Keene a kol., 2004; Keene a kol., 2006; Schwaerzel a kol., 2003) s modifikáciami. Na testovanie čuchovej ostrosti dostali netrénované muchy 2 minúty na výber medzi zriedeným zápachom, ktorý sa používa pri kondicionovaní, a vzduchom prebublávaným cez minerálny olej v T bludisku. Index vyhýbania sa bol vypočítaný ako počet múch vo vzduchovom ramene mínus počet v pachovom ramene, delený celkovým počtom múch. Zabránenie úrazu elektrickým prúdom sa vykonalo a vypočítalo podobne. Netrénované muchy si 1 minútu vyberali medzi dvoma trubicami obsahujúcimi elektrické siete, ale iba jedna bola pripojená k zdroju energie. Index vyhýbania sa vypočítal ako počet múch v neelektrifikovanom ramene mínus počet v elektrifikovanom ramene, delený celkovým počtom múch. Na posúdenie ostrosti cukru dostali vyhladované muchy 2 minúty na výber medzi ramenom T-bludiska obsahujúceho sušený cukrový papier a druhým obsahujúcim sušený „vodný“ filtračný papier. Oba papiere boli pripravené ako v apetíciiPamäťtesty. Index preferencií sa vypočítal ako počet múch v cukrovom ramene mínus počet múch v druhom ramene vydelený celkovým počtom múch. Zistili sme, že udržiavanie svetla v behaviorálnej miestnosti a prúdenie vzduchu cez testovacie skúmavky výrazne zvýšilo preferenčný index u múch divokého typu, a preto sme tieto podmienky použili na všetky testy preferencie cukru.

Anti-UEX protilátka a Western blot

Polyklonálna protilátka UEX bola vyvinutá komerčne spoločnosťou Eurogentec. Dva peptidy boli syntetizované ako antigény: Peptid 1H-CLPKLDDKFESKQSKP-OH (16aa) a Peptid 2H-CVDNRTK TRRNRYKKA-NH2 (16aa) a injikované králikom. Iba Peptid 2 vyvolal silnú imunitnú odpoveď a bol ďalej spracovaný. Konečné sérum sa purifikovalo proti Peptidu 2 a použilo sa na analýzu Western blot ako riedenie 1:2000.

Pre každú vzorku vo western blote boli proteíny extrahované z 20 hlavičiek muchy dôkladnou homogenizáciou v 120 ml pufra na vzorky proteínov obsahujúceho zmes 30 ml 2-merkaptoetanolu (Bio-Rad), 270 ml 4 Laemmliho vzorkový pufor (BioRad) a 900 ml vody bez nukleázy (Invitrogen). Vzorky sa potom varili na 100 °C tepelnom bloku počas 3 minút a pred nanesením sa centrifugovali 10 minút. Objem vzorky ekvivalentný štyrom hlavám sa vložil do každej dráhy gélu SDS-PAGE. Proteíny boli prenesené na PVDF membránu a blokované v 5 percentnom odstredenom mlieku počas 1 hodiny pri 25 °C s 35 ot./min. Membrána sa potom inkubovala v roztoku anti-UEX (1:2000 králičie anti-UEX v 5 percentnom odstredenom mlieku) cez noc pri 4 °C s miešaním pri 35 otáčkach za minútu. Membrána sa rýchlo trikrát premyla, nasledovalo 3 10 minútové premytie v roztoku TBST (100 ml roztoku TBS 10, BioRad, zriedeného v 900 ml vody MilliQ, s 0,1 % Tween 20) a potom sa inkubovala s HRP-konjugovaným roztok sekundárnej protilátky (1:5000 kozej anti-králičej protilátky v 5% odstredenom mlieku) počas 1-2 hodín pri 25 °C s 35 otáčkami za minútu. Membrána sa znova rýchlo trikrát premyla, po čom nasledovalo 3 10 minútové premytie v TBST. Proteínové pásy sa vizualizovali pomocou substrátu Pierce ECL western blotting (Life technologies, 32134). Membrána sa potom stripovala s použitím jemného roztoku Millipore ReBlot Plus (Merck, 2502), znova sa blokovala v 5-percentnom odstredenom mlieku a sondovala sa myšou anti-tubulínovou primárnou protilátkou (1:2000, Sigma, T6199) a zodpovedajúcou HRP konjugovanou kozou anti- myšia sekundárna protilátka (1:5000) podľa protokolu podrobne opísaného vyššie.

Imunofarbenie

Imunofarbenie sa uskutočnilo podľa popisu (Wu a Luo, 2006). Mozgy od 1- do 5-dňových dospelých múch boli pitvané v PBS a fixované 20 min v PBS so 4 percentami paraformaldehydu pri izbovej teplote. Potom sa dvakrát krátko premyli v 0,5% PBT (2,5 ml Triton-X100 v 497,5 ml PBS) a trikrát sa premyli po 20 minútach. Mozgy sa potom blokovali na 30 minút pri teplote miestnosti v PBT obsahujúcom 5 percent normálneho kozieho séra a potom sa inkubovali s primárnymi a sekundárnymi protilátkami s miernou rotáciou (35 otáčok za minútu) pri 4 °C počas 1 alebo 2 dní. Primárne protilátky boli králičie anti-GFP (1:250; Invitrogen A11122) a králičie anti-HA (1:250, NEB 3724T). Alexa 488 – konjugovaná kozia anti-králičia protilátka (1:250; Invitrogen, A11034) bola sekundárna protilátka. Pred a po inkubácii sekundárnej protilátky sa mozgy podrobili dvom rýchlym premytiam, po ktorých nasledovali tri 20-minútové premytia v 0,5 percentnom PBT. Zafarbené mozgy boli pripevnené na sklenené sklíčka vo Vectashield (Vector Labs H1000) a zobrazené pomocou konfokálneho mikroskopu Leica TCS SP5 pri 40-násobnom zväčšení (HCX PL APO 40, 1,3 CS olejový imerzný objektív, Leica). Zásobníky obrázkov sa zozbierali v rozlíšení 1024 1024 s krokmi po 1 mm a spracovali sa pomocou Fidži (Schindelin et al., 2012). Na kvantifikáciu na obrázku 3G a H boli pravouhlé oblasti záujmu približne 40 25 mm pre zemeguľu alebo okrúhle oblasti záujmu s priemerom 15 mm pre ab, a'b' a EB manuálne nakreslené na jeden rez z-stack skenu mozgu muchy. Zodpovedajúce oblasti záujmu sa tiež nakreslili na horný mediálny protocerebrum (SMP) ako kontrolná oblasť pozadia a priemerná fluorescencia sa vypočítala pomocou ImageJ. Intenzita ROI lalokov MB a EB bola normalizovaná na intenzitu príslušnej intenzity SMP. Pre jeden dátový bod sa použil priemer medzi ľavým a pravým mozgom. Pre kvantifikáciu na obrázkoch 7C a D sú oblasti záujmu uvedené na obrázkoch a intenzita oblasti záujmu sa vypočítala podobne ako výsledky na obrázku 3H. Na obrázku 7C bola nakreslená čiara cez najširšiu časť špičky laloku a. Profil intenzity tejto línie sa získal pomocou ImageJ. Pre každý profil čiary bolo extrahovaných 30 údajových bodov v strede takého profilu, ktoré preklenulo asi 15 mm čiaru. Profil sa ďalej normalizoval na strednú hodnotu prvých piatich údajových bodov (FO) a vypočítal sa ako (Fo)/F0. Priemerné hodnoty týchto normalizovaných profilov z rôznych mozgov boli vynesené do grafu (obrázok 7C, stredný panel). Vypočítali sa ľavý a pravý profil mozgu a sú zobrazené samostatne. Na obrázku 7D sú relatívne intenzity z rôznych oblastí záujmu reprezentujúce rôzne oblasti sčítané, aby sa vytvorila miera celkovej intenzity pre MB.

Ľudský CNNM4 cDNA expresný konštrukt používaný na skúmanie Mg2 plus efluxu v bunkovej kultúre je opísaný skôr (Yamazaki et al., 2013). Konštrukt exprimujúci Drosophila uex sa vytvoril vložením značky FLAG pred STOP kodón uex CDS. CNNM4 a uex cDNA označené FLAG sa následne vložili do pCMV tag-4A (Agilent) na expresiu v bunkách HEK293. Bunky HEK293 sa kultivovali v Dulbeccovom modifikovanom Eagle médiu (Nissui) doplnenom 10 percentným fetálnym bovinným sérom (FBS) a antibiotikami. Expresné plazmidy boli transfekované Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

Na imunofarbenie boli bunky fixované 3,7 percentným formaldehydom v PBS počas 2 0 minút a potom permeabilizované 0,2 percentami Triton X-100 v PBS počas 5 minút, obe pri teplote miestnosti. Potom boli blokované PBS obsahujúcim 3 percentá FBS a 10 percent hovädzieho sérového albumínu (blokovací pufor) počas 1 hodiny pri teplote miestnosti. Bunky sa potom inkubovali cez noc pri 4 °C s králičou anti-FLAG protilátkou (F7425, Sigma-Aldrich) zriedenou v blokovacom pufri, premyli sa 3 x PBS a inkubovali sa 1 hodinu pri teplote miestnosti s Alexa 488-konjugovanou anti- králičie IgG (Invitrogen) a rodamín-faloidín (na vizualizáciu F-aktínu, Invitrogen) zriedené v blokovacom pufri. Po troch premytiach PBS sa krycie sklíčka pripevnili na sklíčka a zobrazili sa konfokálnym mikroskopom (FluoView FV1000; Olympus).

Zobrazovanie Mg2 plus pomocou magnéziovej zelene sa uskutočnilo tak, ako je opísané (Yamazaki et al., 20}13), s malými modifikáciami. Aby sa zabránilo potenciálnemu zníženiu [Mg2 plus]i s exprimovanými proteínmi, transfekované bunky HEK293 sa kultivovali v rastovom médiu doplnenom 40 mM MgCl2 až do zobrazenia. Bunky sa potom inkubovali s Mg2 plus nanášacím tlmivým roztokom (78,1 mM NaCl, 5,4 mM KCI, 1,8 mM CaCl2, 40 mM MgCl2, 5,5 mM glukózy a 5,5 mM HEPES-KOH [pH 7,4]), vrátane magnéziovej zelenej 2 m (Invitrogen), počas 30 minút pri 37 °C. Bunky sa potom raz prepláchli zavádzacím pufrom a prezreli sa mikroskopom Olympus IX81 vybaveným fotoaparátom ORCA-Flash 4.0 CMOS (Hamamatsu) a ortuťovou výbojkou SHI{33}}L (Olympus). Fluorescencia sa merala každých 20 s (excitácia pri 470–490 nm a emisia pri 505–545 nm) pod kontrolou softvéru Metamorph (Molecular Devices). Pufer sa potom vymenil za Mg2 plus voľný pufor (MgCl2 v nanášacom pufri bol nahradený 60 mM NaCl). Dáta sú prezentované ako čiarové grafy (priemer 10 buniek). Po zobrazení boli bunky fixované PBS obsahujúcim 3,7 percenta formaldehydu a podrobené imunofluorescenčnej mikroskopii na potvrdenie expresie proteínu.

Merania koncentrácie Mg2 plus na báze FRET v mozgoch fixovaných múch

jedno- až dvojdňové muchy s genotypom c739; UAS-MagFRET-1 boli umiestnené vo fľaštičkách s 1 mM alebo 80 mM [Mg2 plus ] potravou počas 4 dní pred odberom. Mozgy muchy sa vypreparovali v PBS a fixovali sa 2 0 minúty v PBS so 4 percentami paraformaldehydu pri teplote miestnosti. Potom sa dvakrát krátko premyli v 0,5 percentnom PBT (2,5 ml Triton-X100 v 497,5 ml PBS) a trikrát 10 minút. Mozgy sa potom umiestnili na sklenené podložné sklíčka vo Vectashield (Vector Labs H1000) a zobrazili sa pomocou širokouhlého mikroskopu Scientifica Slicescope s vodným ponorným objektívom 40 , 0,8 NA a kamerou Andor Zyla sCMOS so softvérom Andor Solis (v4.27). Aby sa získal pomer FRET, ktorý udáva koncentráciu Mg2 plus ab neurónu, získali sa časové rady striedavo medzi blankytným kanálom a kanálom citrínu pri 3 Hz s 512 512 pixelmi a 16 bitmi. Excitačná vlnová dĺžka pre oba kanály je 436 nm, zatiaľ čo emisný filter pre cerulean je 460–500 nm a pre citrín je 520–550 nm. Sériové získavanie začína od blankytného kanála a trvá 5 s, potom sa prepne na citrínový kanál a trvá ďalších 5 s a tento cyklus sa opakuje ešte dvakrát. Pre každý mozog sa teda získalo celkom 30 s (90 snímok). Zásobníky obrázkov boli následne analyzované pomocou ImageJ a vlastných skriptov Matlab. Stručne povedané, obdĺžnikové oblasti záujmu (obrázok 1E, ľavý panel) boli manuálne nakreslené na lalokoch ab (jeden na laloku a jeden na laloku b pre každú hemisféru) a mimo lalokov ab (jeden pre každú hemisféru) ako kontrola pozadia. Intenzita fluorescencie z blankytného kanála sa vypočítala vydelením každej oblasti záujmu vertikálneho alebo horizontálneho laloku oblasťou záujmu pozadia a spriemerovala sa medzi dvoma hemisférami pre každý lalok a spriemerovala sa za 15 snímok pre každý cyklus. To z citrínového kanála sa získalo podobne. Z vyššie uvedených intenzít sa získal pomer FRET, ďalej spriemerovaný medzi tromi cyklami získavania, znázornený ako jeden údajový bod na obrázku 1E (pravý panel).

Konfokálne zobrazenie Mg2 plus v mozgu explantátu muchy

Explantátové mozgy exprimujúce c739-GAL4 riadený UAS-MagIC sa umiestnili na dno 35 mm mikrojamkovej misky so skleneným dnom (diel č. P35G-1.5–14 C, MatTek Corporation), pod extracelulárne fyziologický tlmivý roztok (103 mM NaCl, 3 mM KCl, 5 mM N-Tris, 10 mM trehalóza, 10 mM glukóza, 7 mM sacharóza, 26 mM NaHC03, 1 mM NaH2P04, 1,5 mM CaCl2, MgCl2m2, osmomm pH 7,3]) po disekcii v pufri bez vápnika (Barnstedt et al., 2016). Na stanovenie Mg2 plus citlivosti UAS-MagIC, ako aj odozvy UAS-MagIC na iné chemikálie, ako sú EDTA, EGTA a CaCl2 (obrázok 8B), sa mozgy inkubovali vo fyziologickom tlmivom roztoku s 20 mg/ml digitonínom. 6 min pred snímkovaním (Koldenkova et al., 2015). Na vyšetrenie fluktuácie Mg2 plus v reakcii na aplikáciu Forskolin (FSK) (obrázok 8C–I) sa mozgy vložili do fyziologického roztoku pufra bez digitonínu alebo inkubácie. V oboch situáciách sa fyziologický roztok vzťahuje na tlmivý roztok (buď s digitonínom alebo bez neho), v ktorom je mozog ponorený.

Zobrazovanie sa uskutočnilo v konfokálnom mikroskope LSM780 (Zeiss) s objektívom 20 vzduchu pomocou softvéru ZEN 2011. Venušina časť MagIC bola excitovaná 488 nm laserom a jeho emisia bola zhromaždená v rozsahu 520–560 nm. mCherry bol excitovaný 561 nm laserom a jeho emisia bola zhromaždená v rozsahu 600-640 nm. Časové rady boli získané pri 0,5 Hz s 512 512 pixelmi a 16 bitmi. Po 60 sekundách základného merania Venus/mCherry sa do misky pridalo 2–20 ml fyziologického roztoku alebo iného relevantného chemického roztoku pomocou mikropipety s konštantným snímaním obrazu. Účinky aplikovaných činidiel na emisiu Venuša/mCherry sa potom zaznamenávali 15–20 minút.

Zásobníky obrázkov boli následne analyzované pomocou ImageJ a vlastných skriptov Python. Stručne povedané, obdĺžnikové oblasti záujmu boli manuálne nakreslené na neurónoch ab (jedna pre každú hemisféru, obrázok 8A) a ďalšia oblasť záujmu rovnakej veľkosti bola nakreslená v strede, ale mimo MB ako kontrola pozadia. Intenzita fluorescencie z kanála Venuše (alebo mCherry) sa vypočítala odčítaním oblasti záujmu pozadia od oblastí záujmu kalicha a spriemerovala sa medzi dvoma hemisférami. Toto sa označuje ako „Rel. Intenzita (au)' na obrázku 8D a E. Pomer medzi intenzitou Venuše a mCherry bol vypočítaný ako 'MagIC Ratio' na obrázku 8B a C a obrázku 8F a G. Pre obrázok 8H bola intenzita pre dva kanály vypočítaná oddelene. V tomto prípade „Rel. Intenzita (DF/F0)“ označuje relatívnu intenzitu fluorescencie normalizovanú na priemernú intenzitu zo základného obdobia F0, vypočítanú ako (FF0)/F{{9} }. Relatívna intenzita DF/F0 Venuše sa použila na výpočet PSD (obrázok 8I) prostredníctvom funkcie python psd (pod matplotlib.pyplot), ktorá prevzala Welchovu metódu priemerného periodogramu (Bendat et al., 2000).

Reverzná transkripcia a kvantitatívna PCR v reálnom čase

Pre každú vzorku bolo 120 múch zmrazených v tekutom dusíku a ich hlavy boli úplne homogenizované v TRIzolovom činidle (Invitrogen). Celková RNA sa extrahovala pomocou súpravy Direct-zol RNA MiniPrep (R2050) podľa pokynov výrobcu. cDNA sa syntetizovala použitím systému syntézy prvého reťazca SuperScript III (Invitrogen). Pre každé odlišné ošetrenie alebo genotyp sa pripravilo päť nezávislých vzoriek. Kvantitatívna PCR sa uskutočnila trojmo pre každú vzorku cDNA na zariadení LightCycler 480 (Roche) s použitím SYBR Green I Master Mix (Roche). Krivky topenia sa analyzovali po amplifikácii a amplikóny sa vizualizovali elektroforézou na agarózovom géli, aby sa potvrdila špecificita primeru. Relatívne hladiny transkriptov sa vypočítali 2-metódou DDCt (Livak a Schmittgen, 2001) a na normalizáciu sa použil geometrický priemer hodnôt Ct troch referenčných génov (Gapdh, Tbp a Ef1a 100E). Priméry sú podrobne uvedené v tabuľke zdrojov.

Inverzná PCR

Inverzná PCR sa použila na mapovanie polohy inzercie MiMIC v muchách uexMI01943. Genómová DNA bola pripravená z 15 dospelých múch. DNA ekvivalentná dvom muchám sa potom štiepila v 25 ml reštrikčnej reakcii s Mbol a 10 ml produktu sa ligovalo cez noc pri 4 °C, aby sa fragmenty cirkulovali; 5 ml produktu ligácie sa použilo na inverznú PCR. PCR produkt bol purifikovaný použitím Exo/SAP reakcie (Thermo Fisher, 78201) pred sekvenovaním. Sekvencia sa porovnala s genómom D. melanogaster (FlyBase, vydanie 6) pomocou BLAST a jednotne sa zhodovala s oblasťou 3 882 886, 3 882 641 na 2R, v súlade s ohlásenou inzerciou uexMI01943 na FlyBase. Priméry sú podrobne uvedené v tabuľke zdrojov.

Predikcia a zarovnanie proteínových domén

Zarovnanie proteínovej sekvencie sa uskutočnilo s použitím Geneious R10.2.2. Predikcia proteínovej domény sa uskutočnila pomocou InterPro (Finn a kol., 2017; Jones a kol., 2014) a Phyre2 (Kelley a kol., 2015). Zarovnanie proteínovej domény a štruktúry sa uskutočnilo pomocou TM-align (Zhang a Skolnick, 2005). Vizualizácia proteínovej štruktúry bola poskytnutá v Chimera 1.11.2 (Pettersen et al., 2004).

Kvantifikácia a štatistické analýzy

Údaje o správaní sa analyzovali pomocou Excelu a Prism 6. Zobrazovacie údaje sa analyzovali pomocou ImageJ a vlastných skriptov MATLAB alebo Python. Na porovnanie dvoch skupín sa použili nepárové dvojstranné t-testy a na porovnanie viacerých skupín sa použila jednosmerná ANOVA nasledovaná Tukeyho post-hoc testom. Prah štatistickej významnosti bol stanovený na p<>

Poďakovanie

Ďakujeme FJ Arjona a JGJ Hoenderop za myšacie klony CNNM2 a komentáre k rukopisu. Sme vďační T Nagai za klony MagIC a MARIO a Bloomington Stock Center a VDRC za muchy. Ďakujeme P Cognignimu, Y Huangovi, R Brainovi, R Szoke-Kovacsovi a M Goodwinovi za technickú podporu a ostatným členom Waddellovej skupiny za diskusiu. Oceňujeme N Halidi, C Monico a Micron Advanced Bioimaging Unit (podporované Wellcome Strategic Awards 091911/B/10/Z a 107457/Z/15/Z) za ich podporu a pomoc pri tejto práci. EM bol financovaný z dlhodobého štipendia EMBO (ALTF 184-2109). KDJ uznáva podporu od Rhodes Trust. SW bol financovaný z Wellcome Principal Research Fellowship (200846/ Z/16/Z) a ERC Advanced Grant (789274).