Reno-ochranné účinky EphrinB2 (EphB2)

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Zhimin Huang, Simeng Liu, Anna Tang, Laith Al-Rabadi, Mark Henkemeyer, Patrice N. Mimche a Yufeng Huang

Úvod

Chronické ochorenie obličiek (CKD) je charakterizované pretrvávajúcim zápalom a postupným nárastom fibrózy vrátane glomerulosklerózy a tubulointersticiálnej fibrózy, čo v konečnom dôsledku vedie kkonečné štádium ochorenia obličiek(ESRD) bez ohľadu na základnú poruchu|1]. To poukazuje na konečnú spoločnú cestu pre ESRD. Lepšie pochopenie kľúčových mediátorov tejto spoločnej cesty bude potenciálne viesť k návrhu cielenejších terapií na prevenciu alebo zvrátenie progresie CKD.

Hepatocelulárne (Eph)receptorové tyrozínkinázy produkujúce erytropoetín a ich zodpovedajúce ligandy interagujúce s Eph receptorom (Ephrin) tvoria veľkú rodinu vysoko konzervovaných signálnych proteínov ukotvených v membráne, ktoré riadia rôzne interakcie bunka-bunka počas vývoja a v dospelosti [2]. Pri kontakte bunka-bunka vedú interakcie EphB-EphrinB najmä k dimérom, tetramérom a proteínovým zhlukom vyššieho rádu, čo vedie k aktivácii obojsmerných signálnych kaskád, ktoré sa šíria do bunky exprimujúcej receptor (dopredná signalizácia) a ligand- exprimujúca bunka (reverzná signalizácia)[3-5]. Vzhľadom na to, že sa predpokladá, že obojsmerná signalizácia Eph-Ephrin sa podieľa na širokom spektre interakcií bunka-bunka, migrácie a adhéznych udalostí počas embryonálneho vývoja aj počas fyziologickej opravy tkaniva 2,6-10], nie je prekvapujúce, že dysregulácia z týchto molekúl sa podieľa na fibróze tkaniva. Úloha signalizácie EphB-EphrinB v tkanivovej fibrogenéze bola skutočne odhalená na viacerých myších modeloch vaskulárnej [11], srdcovej [12], kože [13], pľúc [14] a pečeňovej fibrózy [15,16]. Avšak potenciálne funkcie týchto receptorov a ligandov vzhľadom na patofyziológiu obličiek sú do značnej miery neznáme.

V obličkových glomerulách dospelých je EphrinB1 lokalizovaný na štrbinovej membráne podocytu v glomeruloch [17], EphrinB2 je exprimovaný hlavne v glomerulárnych endotelových bunkách (EC) a v hladkom svalstve artérií [18], zatiaľ čo EphrinB3 je sotva detegovateľný19]. Glomerulárna expresia alebo distribúcia receptorov Eph je stále nejasná, hoci niekoľko štúdií ukázalo, že vzácna bunka exprimuje EphB4 v zrelých glomeruloch [18]. V renálnych tubuloch sa EphrinB1 deteguje v celom nefrone a môže ovplyvniť cytoarchitektúru tubulárnych epitelových buniek [19]. Okrem toho, že sa EphrinB2 exprimoval v bunkách hladkého svalstva tepien a EC, bol tiež hojne nájdený v spojovacích tubuloch a kortikálnych a medulárnych zberných kanáloch vyvíjajúcich sa a dospelých obličiek [18].EphrinB2 (EphB2Zistilo sa, že receptor je hojne exprimovaný v tubuloch vnútornej a vonkajšej drene, vrátane distálnych priamych tubulov a tenkého ramena Henleho kľučky, kde sa koncentruje v bazálnej strane buniek. Expresia EphB4 je obmedzená na kapiláry v dreni. EphB6 je prednostne exprimovaný v obličkových telieskach a tubuloch kôry aj vonkajšej drene, vrátane proximálnych a distálnych tubulov. Samotnému EphB6 však chýba katalytická aktivita a je nepravdepodobné, že bude pôsobiť ako nezávislý receptor, ale skôr signalizuje ako súčasť hetero-oligomérneho signálneho komplexu s inými receptormi EphB in vivo [20].

Už skôr bolo hlásené, že reverzná signalizácia EphrinB2 chránila pred kapilárnym riedením a fibrózou po poškodení obličiek vyvolanom jednostrannou obštrukciou močovodu (UUO) alebo ischemicko-reperfúznym (IR) poškodením, pretože myši, ktorým chýbala signalizácia závislá od EphrinB2-PDZ, mali závažnejšiu vaskulárne poškodenie a zvýšená fibróza po poškodení obličiek [21]. Je však tiež možné, že PDZ-mŕtvy proteín EphrinB2 pôsobí ako silnejší ligand na stimuláciu doprednej signalizácie EphB, čo môže byť príčinou nadmernej fibrózy obličiek pozorovanej vo vyššie uvedenej štúdii. Ďalej, vyššie uvedená štúdia neurčila, ktorý, ak vôbec nejaký, EphB receptor sa podieľa na patológii obličiek po poranení. Vzhľadom na dôležitú profibrotickú úlohu EphB2 (EphB2)signalizácia pozorovaná nedávno pri fibróze pečene [15,16] a najhojnejšej expresii EphB2 (EphB2)v tubulárnych bunkách obličiek[19] predpokladáme, že EphB2 (EphB2)je pravdepodobne zapojený doobličkovéfibróza. V tejto štúdii sme skúmali, či je zvýšený EphB2 (EphB2)sa tiež pozoruje pri rôznych ochoreniach obličiek a či expresia a signalizácia EphB2 (EphB2)sa podieľajú na vývojiobličkovéautobus EphB2 (EphB2)knockout (KO) a kontrolné myši z rovnakého vrhu dostávali jednostrannéobličkovéIR poranenie. Ukázali sme, že EphB2 (EphB2)expresia a signalizačná kapacita sú významne upregulované po IR poranení v myšom modeli a v obličkách z experimentálnych hypertenzných a diabetických myších modelov s CKD a pacientov trpiacich CKD. Okrem toho genetická strata EphB2 (EphB2)u KO myší silne chránili obličky pred IR poranenímobličkovéškodydysfunkcia a fibróza, čím sa identifikuje kľúčová úloha tohto receptora pri sprostredkovaní nepriaznivých bunkových udalostí, ktoré ovplyvňujú obličky počas progresie ochorenia.

cistanche mužské výhodypreobličky

Výsledky

EphB2 (EphB2)je upregulovaný a aktivovaný v obličkách po poranení

Transkripty pre všetky molekuly EphB a Ephrin-B v normálnej obličke dospelých myší sa hodnotili pomocou RT-PCR (doplnkový obrázok S1A), čo odhalilo, že najvýznamnejšími amplifikačnými produktmi boli EphB2 (EphB2)EphB4, EphrinB1 a EphrinB2. Ukázalo sa, že EphB4 sa exprimuje hlavne na vaskulárnych EC a je potrebný pre štrukturálnu integritu krvných ciev a nedeteguje sa v hlavných obličkových bunkách zapojených do fibrózy [21,26]. Okrem toho naše údaje odhalili, že tubulárne epiteliálne bunky obličiek a tubulárne fibroblasty exprimujú EphB2 (EphB2)receptor a príbuzné ligandy EphrinB1 a EphrinB2 (pozri doplnkový obrázok S1B). Potom sme skúmali potenciálne zmeny v expresii po IR poranení a zistili sme, že EphB2 (EphB2)Hladiny mRNA a proteínu boli významne up-regulované v obličkách poškodených IR WT v porovnaní s nepoškodenou kontrolnou obličkou (CTL) (obrázok 1A-C). V súlade s tým imunobloty s použitím fosfo-špecifickej protilátky pre EphB1/EphB2 (EphB2)ktorý poskytuje hodnotu pre tyrozínkinázový katalyticky aktívny receptor (p-EphB1/2) detegoval významné zvýšenie IR-poškodenej WT myšacej obličky (obrázok 1B, D). IF analýza tkanivových rezov s použitím anti-EphB2 (EphB2)protilátky potvrdili zvýšenie expresie receptorového proteínu vo WT IR-poškodenej obličke, najmä v tubulárnych epiteliálnych bunkách a tubulointersticiálnych bunkách (obrázok 1E). Dôležité je, že žiadny EphB2 (EphB2)signály boli detegované v imunoblotoch alebo IF v obličkách z EphB2 (EphB2)KO myši (EphB{0}}/) demonštrujúce špecifickosť protilátkových činidiel. Nakoniec, významné zvýšenie expresie proteínu EphrinB2 sa zistilo aj v obličkách poškodených IR od myší WT, aj keď je zaujímavé, že toto zvýšenie nebolo zistené v poškodených obličkách z EphB2 (EphB2)KO myši (obrázok 1B, F).

Obrázok 1.EphB2 (EphB2)expresia sa zvyšuje v obličkách myší po IR poranení počas 2 týždňov

(A) Hladiny mRNA receptora EphB2, EphrinB1, EphrinB2 sa analyzovali v obličkách myší pomocou RT-PCR v reálnom čase. Výsledky sú uvedené ako násobná zmena v porovnaní s kontralaterálnymi obličkami (CTL). Chybové úsečky predstavujú priemer ± SD, n=5 zvierat.

(B) Western bloty EphB2, fosfor-EphB2 (pEphB21594), EphrinB2 a GAPDH z obličiek myší EphB2 plus/plus (WT a EphB2-/(KO)). Molekulová hmotnosť bola označená vpravo.

V grafoch sú zhrnuté výsledky meraní hustoty pásu pre EphB2(C), p-EphB2(D) a EphrinB2 (F).*P<0.05 vs.ephb2+/+="">

(E) Zmrazené rezy obličiek z myší EphB2 plus/plus a EphB2-/- po IR poranení boli zafarbené EphB2 (červená) a DAPI/DNA (modrá). Zväčšenie, × 200. V imunoblotoch alebo farbení IF v obličkách myší EphB2 KO sa nezistil žiadny EphB2.

cistanche herbamôže liečiťobličkychorobazlepšiťfunkcie obličiek

Aby sa zistilo, či je upregulovaná expresia EphB2 (EphB2)a EphrinB gény bolo možné pozorovať aj na iných zvieracích modeloch ochorení obličiek, podrobili sme obličky od diabetických db/db myší typu 2 [27] a hypertenzných myší s infúziou deoxykortikosterónacetátu (DOCA) a angiotenzínu (Ang) II [22]. RT-PCR analýza. Údaje naznačujú, že EphB2 (EphB2), transkripty EphrinB1 a EphrinB2 boli všetky významne zvýšené v obličkách v oboch modeloch (doplnkový obrázok S2). Potom sme vykonali farbenie IF na EphB2 (EphB2)v biopsiách obličiek u pacientov s CKD s diagnózou lgA nefropatie (IgAN) s glomerulosklerózou, tubulárnou atrofiou a intersticiálnou fibrózou, ako bolo stanovené farbením PAS (obrázok 2A). V porovnaní s normálnymi subjektmi nápadný vzor zvýšeného EphB2 (EphB2)proteín a dopredná signalizácia (farbenie protilátkami p-EphB1/2) bola detegovaná nielen v chorých glomeruloch, ale aj v tubulárnej oblasti postihnutej ochorením v obličkách u týchto pacientov s IgAN (obrázok 2B, C). Imunohistochemické farbenie s použitím rovnakej protilátky anti-p-EphB2, ako sa používa na farbenie IF, ďalej odhalilo, že silné farbenie p-EphB2 bolo pozorované hlavne v tubulárnych bunkách a niektoré v tubulointersticiálnych bunkách u týchto pacientov s IgAN (obrázok 2D). Na rozdiel od toho len niekoľko tubulárnych buniek bolo zafarbených slabo na p-EphB2 v normálnej obličke (obrázok 2D). Polokvantifikované integrované úrovne hustoty pre EphB2 (EphB2)alebo farbenie p-EphB2 v renálnej tubulointersticiálnej oblasti určené pomocou ImageJ boli zobrazené vpravo. Tieto údaje naznačujú, že up-regulovaná expresia EphB2 a potenciálna aktivácia forwardovej signalizácie je prominentným znakomobličkovéfibróza.

Obrázok 2. EphB2 (EphB2)zvýšenie expresie v tkanive biopsie ľudskej obličkys CKD v porovnaní s normálnymi subjektmi Rezy biopsie obličiek z normálnej časti obličky (NC, n{0}}) a pacientov s lgAN (Oxfordov patologický typ T=1 [38]) (n=7) z Nanjing Medical University boli zafarbené PAS (A), EphB2 (červená) (B) a fosfor-EphB2 (p-EphB2) (červená) (C). Zväčšenie, x 200. DAPI-zafarbená DNA (modrá) slúžila ako kontrola farbenia jadier pre IF farbenie (IF farbenie bolo uskutočnené tak, ako je opísané pre myšacie tkanivo). Použitie ľudského materiálu schválila miestna rada pre etické hodnotenie. Zväčšenie × 200. Šípky indikovali fibrózu v glomeruloch a tubulointersticiálnej oblasti. (D) Imunochemické farbenie na p-EphB2 (zafarbené hnedou farbou) (použitím rovnakej protilátky anti-pEphB2 ako primárnej protilátky, aká sa používa na farbenie IF a peroxidázou konjugovanej anti-králičej lgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.) ako sekundárnej protilátka a pozitívne farbenie sa vyvinulo s použitím 3,3'-diaminobenzidínu) sa ďalej uskutočnilo na 3-μm rezoch týchto tkanív biopsie obličiek IgAN zaliatych v parafíne a kontrastne sa zafarbilo hematoxylínom. Ako negatívna kontrola bola primárna protilátka nahradená preimunitným IgG a nebolo zaznamenané žiadne špecifické farbenie. Zväčšenie × 400. Relatívna integrovaná hustota pixelov farbenia EphB2 alebo p-EphB2, najmä v renálnej tubulointersticiálnej oblasti, kvantifikovaná pomocou ImageJ, bola ukázaná napravo od každej fotografie farbenia.*P<0.05 vs.="" normal="" kidney="">

Obrázok 3.EphB2 (EphB2)-KO myši vykazujú zlepšenú funkciu obličiek a atrofiu a znížené tubulárne poškodenie a tubulointersticiálnu fibrózu po IR poranení (AC) Sérum BUN (A), hladiny Cr (B) a hmotnosť obličiek (C) (n=5/skupina).*P<0.05 vs.ephb2+/+="" mice.="" (d,="" e)representative="" microscopic="" images="" showing="" pas="" staining="" (d)="" and="" masson's="" trichrome="" staining="" (e)="" of="" the="" kidney="" sections="" were="" used="" to="" detect="" tubular="" injury,="" inflammation,="" and="" collagen="" deposition="" (stained="" blue).="" magnification,×200.(f,="" g).="" the="" graphs="" summarized="" the="" results="" of="" tubular="" injury="" (f="" and="" collagen="" deposition="" (g)="" quantified="" by="" imagej.(h,="" d)="" mrna="" expression="" of="" tubular="" injury="" markers,="" ngal(h)="" and="" kim-1="" ()="" in="" the="" kidney="" following="" ir=""><0.05 vs.ephb2+/="" contralateral="" kidney=""><0.05 vs.ephb2+/+="" ir-injured="">

EphB2 (EphB2)KO chráni obličku pred poškodením a fibrózou vyvolanou IR

V IR modeli poškodenia obličiek a fibrózy 35-min ischemický protokol u myší WT vyvolal typické závažné chronické jednostranné poškodenie obličiek po 2 týždňoch, vrátane zhoršenej funkcie obličiek, čo dokazujú zvýšené hladiny BUN a Cr v sére (obrázok 3A, B) (hoci sérové ​​hladiny BUN alebo Cr namerané tu len čiastočne odrážajú poškodenú funkciu IR-poškodenej obličky, hladiny BUN aj Cr v sére u myší WT s jednostrannýmpoškodenie obličiek IRboli významne zvýšené v porovnaní s normálnymi myšami WT bez akéhokoľvek zranenia (BUN vs. Normálna: 26,81±4,25 vs.17,3±0,37 mg/dl; Cr:0,3{{1{12} }}}1±{14}}.029 vs.0,158±0,064 mg/dl)) a atrofia obličiek, ako je zrejmé z indexu zníženej hmotnosti obličiek (pomer hmotnosti obličiek poškodených IR ku kontrole, hmotnosti nepoškodených obličiek) (obrázok 3C ). Histologicky IR-poškodená oblička u myší WT vykazovala typickú infiltráciu tubulointersticiálnych mononukleárnych buniek a ukladanie nahromadeného kolagénu, ako sa stanovilo farbením PAS a farbením Massonovým trichrómom (obrázok 3D-G). IR-poškodené EphB2-/-myši vykazovali silné zníženie hladín BUN a Cr v porovnaní s myšami zranenými WT a pozoruhodne nižšiu atrofiu obličiek, tubulárne poškodenie a tubulointersticiálnu fibrózu. Hodnotili sa aj renálne transkripty pre lipokalín spojený s neutrofilnou gelatinázou (NGAL) a mRNA molekuly poranenia obličiek-1(KIM{26}}), pretože obe sú validované ako skoré prediktívne markery renálneho tubulárneho poškodenia. Údaje ukázali, že zatiaľ čo NGAL a KIM-1 sa veľmi výrazne exprimovali v obličkách poškodených IR od myší WT, ich expresia sa výrazne znížila o 77,2 a 88,5 percent v poškodených obličkách z EphB{{33} }/ mutantné myši (obrázok 3H-I). To naznačuje, že tubulárne poškodenie po IR poranení bolo silne znížené u myší, ktorým chýbala expresia EphB2 (EphB2)receptor.

Obrázok 4.EphB2 (EphB2)-KO myši majú znížené tubulárne -SMA farbenie a hladiny renálnych proteínov fibrotických markerov po IR poranení

(A) Zmrazené rezy obličiek z myší EphB2 plus / plus t a EphB2-/- po IR poranení boli zafarbené pomocou -SMA (červená) a DAPI/DNA (modrá) a analyzované pomocou konfokálnej mikroskopie. Zväčšenie, × 200.

(B) Grafy zhrnuli výsledky depozície -SMA kvantifikované pomocou ImageJ.*P<0.05 vs.ephb2+/t="" contralateral="" kidney="">

(C) Western bloty FN, -SMA, N-kadherínu a GAPDH z CTL a IR-poškodených obličiek myší EphB2 plus/plus a EphB2-/7-. Molekulová hmotnosť bola označená vpravo. n=5 zvierat/skupina.

(DF) V grafoch sú zhrnuté výsledky meraní hustoty pásu pre FN (D), -SMA (E) a N-kadherín (F).*P<0.05 vs.="" ephb2+/+=""><0.05 vs.="" ephb2+/+="" ir-injured="">

výhody púštnej cistanchenaobličky

-SMA sa typicky zvyšuje počas diferenciácie tubulárnych buniek na fibroblasty alebo aktivácie fibroblastov na myofibroblasty alebo vaskulárnej remodelácie. Pomocou IF analýzy rezov obličiek sme zistili výrazné zvýšenie zafarbenia -SMA v tubulárnych bunkách v obličkách poškodených IR od myší WT, čo je odpoveď, ktorá bola dramaticky zrušená v EphB2. (EphB2)-/- myši (obrázok 4A, B). Toto pozorovanie bolo ďalej podporené imunoblotovými analýzami, ktoré ukazujú výrazné zníženie zvýšených hladín proteínov -SMA, ako aj mezenchymálneho/fibrotického fenotypu charakterizovaného expresiou N-kadherínu a FN v obličkách poškodených IR z EphB2 (EphB2)-/- myši v porovnaní s kontrolami WT (obrázok 4C-F). Ďalšia analýza ukázala, že zvýšené hladiny mRNA fibrotických markerov vrátane kolagénu typu Iol (Col-Io1), Col-II 1, Col-IVcl a FN v IR-poškodenej obličke boli tiež významne znížené v EphB2 (EphB2)-/-mutanti (obrázok 5). Tieto údaje naznačujú, že EphB2 (EphB2)KO chráni obličky pred IR-indukovanou tubulárnou EMT a fibrózou.

Obrázok 5. Kvantitatívna RT-PCR na analýzu génovej expresie profibrotických a zápalových markerov

Celková RNA bola pripravená z kontralaterálnych (CTL) alebo IR-poškodených obličiekEphB2plus plus aEphB2-/- myši. Údaje sú priemer ± SD, n=5 zvierat na skupinu.*P<0.05>EphB2plus / plus CTL, #P<0.05>EphB2plus / plus IR-poškodená oblička.

EphB2 (EphB2)KO zmierňuje silný zápal obličiek, oxidačný stres a proliferatívne reakcie po IR poranení

Ako kľúčové modulátory tkanivovej fibrózy zohrávajú dôležitú úlohu TGF 1, inhibítor aktivátora plazminogénu typu 1 (PAI-1), receptor rastového faktora odvodeného od krvných doštičiek (PDGFR) a tkanivový inhibítor metaloproteinázy (TIMP1).obličkovéfibróza. Ako sa očakávalo, hladiny renálnej mRNA TGF 1, PAI-1, PDGFR- a TIMP1 sa výrazne zvýšili v obličkách WT myší poškodených IR v porovnaní s ich vnútornými obličkami bez poranenia CTL (obrázok 5). Avšak expresia mRNA týchto profibrotických modulátorov bola silne otupená v IR-poškodených obličkách EphB2-7- myší. Tieto výsledky sú v súlade so zníženímobličkovéfibrózasme pozorovali u EphB2-7myší po poranení IR.

Na ďalšie overenie účinku EphB2 (EphB2)KO na súvisiacich bunkových signálnych dráhach downstream sme pozorovali, že renálne transkripty RNA pre NF-kB-p65, monocytový chemoatraktant proteín-1(MCP-1), interleukín (IL)-1B a Všetky Nox2 boli zvýšené v IR-poškodených obličkách WT myší (obrázok 5). Okrem toho produkcia renálneho proteínu NF-KB-p65, Nox2 a jeho kofaktora p47Phox bola oveľa väčšia v obličkách WT myší s poranením IR v porovnaní s obličkami CTL, čo naznačuje aktiváciu zápalovej dráhy sprostredkovanej NF-kB a Nox2 v IR- poranená oblička. Hladiny týchto mediátorov sa však zlepšili alebo zvrátili blízko normálnym hladinám u KO myší bez EphB2 (EphB2)expresia (obrázok 6A-D). Fosforylácia a signalizácia dráh serín/treonínkinázy (Akt) a MAPK/ERK sa zvýšila u IR-poškodených obličiek WT myší, ktoré boli dramaticky znížené, blížiace sa k normálnym hladinám, u EphB2-/-myší (obrázok 6A, E, F). Protilátka F4/80, o ktorej je známe, že označuje makrofágy, preukázala podstatné zvýšenie absolútneho počtu buniek F4/80 plus v tubulointersticiálnej oblasti v obličkách WT myší s poranením IR, zatiaľ čo bunky F4/80 plus boli v obličkových cievach riedke. CTL obličky, čo naznačuje akumuláciu makrofágov a zápal v poškodených obličkách. Počet buniek F4/80 plus bol však u myší EphB2-7- do značnej miery znížený a priblížil sa k normálnym hladinám pozorovaným v nepoškodených obličkách (obrázok 7A, B). Okrem toho sme testovali na Ki-67, jadrový proteín, ktorý slúži ako bunkový marker proliferácie. V súlade s aktiváciou Akt a ERK1/2 v IR-poškodenej obličke WT myší, farbenie IF detekovalo dramatický nárast počtu Ki-67-pozitívnych buniek v tubulointersticiálnej oblasti. Na rozdiel od toho EphB2-7-myši vykazovali oveľa nižší počet a menšiu intenzitu farbenia Ki-67 v obličkách poškodených IR, ktoré sa viac podobali na normálnu nepoškodenú obličku (obrázok 7C, D). Tieto údaje naznačujú, že delécia EphB2 (EphB2)inhibuje zápal sprostredkovaný NF-kB, tvorbu a aktiváciu oxidázy sprostredkovanú NADPH oxidázou a proliferáciu buniek sprostredkovanú Akt- a ERK1/2- v obličkách poškodených IR u myší. Teda EphB2 (EphB2)môže byť potrebné pre podstatnéobličkovézápalovéa proliferatívne reakcie, ktoré prispievajú k fibróze.

Obrázok 6. Hladiny renálnych proteínov zápalových, oxidačných stresových a proliferatívnych markerov

(A) Western bloty NF-kBp65, Nox2, p47phox, p-Akt, pERK1/2, t-ERK1/2 a GAPDH z kontralaterálnych (CTL) a IR-poškodených obličiekEphB2 (EphB2)/ aEphB2-/-myši. Molekulová hmotnosť bola označená vpravo. n=5 zvierat/skupina.

(BF) V grafoch sú zhrnuté výsledky meraní pásovej hustoty pre NF-kB-p65 (B), Nox2 (C), p47Phox(D), p-Akt (E), pERK1/2/t-ERK1/2 (F ), resp. *P<0.05 vs.="">EphB2plus / plus CTL.#P<0.05 vs.="">EphB2*/ plus IR-poškodená oblička.

Znížená apoptóza v obličkách EphB2 (EphB2)-/-myši po poranení IR

Obličky vystavené IR poraneniu sú tiež charakterizované rozsiahlou apoptózou renálnych tubulárnych epiteliálnych buniek. Farbenie TUNEL ukázalo významné zvýšenie apoptózy u IR-poškodených obličkových rezov WT myší v porovnaní s CTL obličkami (obrázok 8A, B), ktoré bolo dramaticky znížené u EphB{2}} myší. Tieto výsledky podporujú úlohu EphB2 (EphB2)KO pri potláčaní apoptózy a opravných mechanizmov pri poškodení obličiek. Takýto dodatočný účinok EphB2 (EphB2)môže tiež vysvetliť obmedzenú fibrózu, ktorá sa vyskytuje u myší EphB{0}} po chronickom poranení vyvolanom IR.

costanche na obličkách

EphB2 (EphB2)profibrotická dráha súvisiaca so signalizáciou

Medzi 760 génmi testovanými pomocou génovej expresie NanoString (zobrazené na obrázku 9A, tepelná mapa génovej expresie), existoval dôkaz o rozdielnej génovej expresii (upravený P<0.05)in the="" ir-injured="" kidney="" of="" wt="" mice="" relative="" to="" the="" wt="" ctl="" kidney="" (wt-ir="" vs.="" wt-ctl)="" for="" 506="" genes(356genes="" were="" up-regulated="" and="" 150="" genes="" were="" down-regulated)with="" an="" estimated="" false="" discovery="" rate="" of="" 5%.="" the="" up-regulated="" 356="" genes="" include="" all="" molecules="" that="" we="" have="" observed="" in="" their="" rna="" expression="" or="" protein="" production="" using="" real-time="" rt-pcr="" or="" western="" blot="" assay="" described="" above="" and="" these="" genes="" encode="" for="" fibrotic="" markers="" such="" as="" col-iol,="" col-iiol,="" col-ivαl,="" and="" fn;="" emt="" markers="" such="" as="" α-sma="" and="" vimentin;="" inflammatory="" factors="" and="" oxidative="" enzymes="" such="" as="" nf-kb,="" mcp-1,="" il-1β,="" and="" nox2;="" growth="" factors="" and="" proliferation="" markers="" such="" as="" tgfβ1,="" pai-1,="" pgdfrβ1,="" timp-1,="" mek="" kinase,="" akt-1="" and="" ki-67,="" and="" caspase-3,="" -4,="" and-12="" that="" regulate="" inflammation="" and="" apoptosis.="" however,="" all="" those="" increased="" markers="" that="" were="" significantly="" attenuated="" in="" the="" ir-injured="" kidney="" of=""> (EphB2)KO myši v porovnaní s myšami WT (KO-IR vs. WT-IR) stanovené pomocou RT-PCR alebo Western blot testu v reálnom čase opísaného vyššie sú tiež potvrdené testom génovej expresie NanoString. Medzi down-regulované gény patrí superoxiddismutáza 1 (SOD1)[28], hemoxygenáza 1(Hmox1)[29] a tioredoxín 1,2(Txn1,2)[30], ktoré zrejme patria do rodiny antioxidantov. Redukcia týchto génov je spojená so zvýšeným oxidačným stresom pozorovaným v IR-poškodenej obličke WT. Takéto zníženie SOD1 a Txn1, 2 sa však nevyskytlo v IR-poškodenom EphB2 (EphB2)KO oblička. Zdá sa, že test génovej expresie NanoString súčasne odhalil viacero kandidátskych génov, ktoré sa podieľajú na IR-indukovanomobličkovézraneniea fibrózy. Predovšetkým sa znížilo 230 z 356 upregulovaných génov (celkovo 64,6 percenta, s upraveným P<0.05)and 129="" of="" 150="" down-regulated="" genes="" were="" reversed="" to="" varying="" degrees（total="" 86%个,="" with="" adjusted=""><0.05）in the="" ir-injured="" kidney="" of="" ephb2-/-mice="" compared="" with="" wt="" mice(ko-ir="" vs.="" wt-ir).="" all="" those="" ameliorated="" molecules="" are="" involved="" in="" 50="" ameliorated="" annotated="" pathways="" (shown="" in="" figure="" 9b,="" a="" heatmap="" of="" pathway="" scores).="" among="" those,="" the="" common="" profibrotic="" pathways,="" shown="" in="" figure="" 9c,="" that="" will="" contribute="" to="" the="" development="" of="">obličkovéfibróza, ako je EMT a zápalové a proliferatívne dráhy, sú výrazne aktivované alebo upregulované v IR-poškodenej obličke, ale významne sa zlepšujú v IR-poškodenej EphB2 (EphB2)KO oblička. Táto analýza prekvapivo tiež odhalila, že energetický metabolizmus renálnych tubulárnych buniek, ako je de novo lipogenéza, glukoneogenéza, metabolizmus cholesterolu, signalizácia receptora aktivovaného peroxizómovým proliferátorom (PPAR) a najmä metabolizmus mastných kyselín, okrem zníženej expresie antioxidantov mRNA (ako napr. uvedená ako dráha oxidačného stresu v tepelnej mape, obrázok 9B), do značnej miery zničená v obličkách poškodených IR, dramaticky pretrvávala v EphB2 poškodenom IR (EphB2)KO oblička (ako je znázornené na obrázku 9D). Tieto výsledky ďalej naznačujú, že väčšina molekúl, ktoré sú zahrnuté vobličkovézraneniea fibróza sú regulované alebo súvisiace s EphB2 (EphB2)signalizácia. Najmä EphB2 (EphB2)signalizácia sa môže podieľať alebo sprostredkovať metabolizmus mitochondriálnej energie obličkových tubulárnych buniek, ako je oxidácia mitochondriálnych mastných kyselín a lipotoxicita pri ochoreniach obličiek.

Obrázok 7.EphB2 (EphB2)KO znižuje infiltráciu makrofágov a proliferáciu tubulárnych buniek v obličkách po IR poranení Rezy obličiek z myší EphB2 plus/plus a EphB2-7(n=5/každá) po IR poranení boli zafarbené F4/80 (červená)(A), Ki-67 (červená) (C) a DAPI/DNA (modrá) a analyzované pomocou konfokálnej mikroskopie. Zväčšenie, × 200. V grafoch sú zhrnuté výsledky F4/80 plus (B) a Ki-67 plus buniek (D) kvantifikované pomocou ImageJ.*P<0.05 vs.ephb2+/+="" contralateral="" kidney=""><0.05 vs.ephb2+/+="" ir-injured="">

Obrázok 8.EphB2 (EphB2)KO znižuje apoptózu tubulárnych buniek v obličkách po ischemicko-reperfúznom (IR) poškodení (A) Rezy obličiek z myší EphB2 plus/plus a EphB{1}} ((n=5/každý) po IR poranení boli zafarbené pomocou TUNEL (zelená) a DAPI/DNA (modrá) a analyzované pomocou konfokálna mikroskopia. Zväčšenie, × 200. (B) Grafy zhrnuli výsledky buniek TUNEL plus kvantifikované pomocou ImageJ.*P<0.05 vs.ephb2++="" contralateral="" kidney=""><0.05 vs.="" ephb2+="" ir-injured="">

KLIKNITE SEM PRE PARTNERSTVO Ⅰ Ⅱ