PRVÁ ČASŤ Echinakozid zvyšuje množstvo spermií u potkanov zacielením na hypotalamický androgénny receptor

Ako echinakozid stimuluje estrogén a zvyšuje počet spermií?

Zhihui Jiang1,2, Bo Zhou2, Xinping Li2, Gordon M. Kirby3 & Xiaoying Zhang1,2

Mužská neplodnosť je hlavným zdravotným problémom s odhadovanou prevalenciou 4,2 percenta mužskej neplodnosti na celom svete. Naša skorá práca ukázala, že extrakty z Cistanche chránia pred poškodením spermií u myší a toechinakozid(ECH) je jednou z hlavných aktívnych zložiek. Tu uvádzame zásadnú úlohu preECH, prírodný produkt, ktorý obracia alebo chráni pred oligo, ako je aspermia u potkanov.ECHbol testovaný pomocou HPLC, bolo hodnotené množstvo a kvalita spermií a hladiny hormónov boli stanovené rádioimunosorbentovým testom. ECH znížila hladiny androgénneho receptora (AR) a kľúčagény súvisiace so steroidogénmi, ako sa určilo analýzou Western blot a qPCR. Interakcia medziECHa AR bola hodnotená nepriamou ELISA a molekulárnym dokovaním. Výsledky ukazujú, že ECH v kombinácii s hypotalamickou AR vo vrecku Met{0}} a Val-713 inhibuje prenos AR zcytoplazmy do jadier v hypotalame. Zatiaľ čo negatívna spätná väzba regulácie pohlavných hormónov bola inhibovaná, pozitívna spätná väzba bola stimulovaná na zvýšenie sekrécie luteinizačného hormónu a testosterónu, čím sa následne zvýšilo množstvo spermií. Tieto údaje spolu ukazujúžeECHblokuje aktivitu AR v hypotalame na zvýšenie množstva spermií a ochranu pred oligo aspermiou u potkanov.

Pre viac informácií kontaktujte:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola má mnoho účinkov, kliknite sem a dozviete sa viac

Produkcia testosterónu v testikulárnych bunkách je silne regulovaná osou hypotalamus-hypofýza-gonáda (HPG) vytvorením homeostatickej spätnoväzbovej slučky1. Hormón uvoľňujúci gonadotropín (GnRH), vylučovaný hypotalamom, môže stimulovať sekréciu luteinizačného hormónu (LH) z hypofýzy, čo ďalej stimuluje produkciu testosterónu v testikulárnych Leydigových bunkách. Testosterón je biosyntetizovaný radom steroidogénnych enzýmov. Ako jedna z hlavných ciest môže steroidogénny akútny regulačný proteín (StAR) transportovať cholesterol z vnútrobunkových zdrojov do mitochondrií2, kde je vystavený enzýmu štiepiacemu bočný reťazec cholesterolu (CYP11A1), 3 -hydroxysteroid dehydrogenáze (HSD3), { {10}}hydroxyláza (CYP17A1) a 17-hydroxysteroid dehydrogenáza (HSD 17 ), ktoré katalyzujú premenu cholesterolu na testosterón3,4. Testosterón sa potom negatívne vracia späť do prvku HPG, aby znížil ďalšiu sekréciu LH spôsobom závislým od dávky.

Účinok testosterónu na slučku spätnej väzby osi HPG nastáva väzbou na androgénny receptor (AR), ktorý sa nachádza v hypotalame aj hypofýze5. U myší ablácia AR a minimálna produkcia testosterónu spôsobuje zvýšenie hladín LH a folikuly stimulujúceho hormónu (FSH), čo naznačuje, že AR sa podieľa na regulácii negatívnej kŕmnej slučky. Klasický genómový mechanizmus testosterónovej signalizácie nastáva, keď testosterón difunduje do bunky a viaže sa na AR. Tento komplex ligand-receptor sa potom premiestni do jadra, kde sa viaže na elementy reakcie na androgén (ARE) v regulačných oblastiach génov reagujúcich na testosterón, aby sa modifikovala ich translokácia. Testosterón tiež indukuje neklasickú dráhu účinku steroidných hormónov, charakterizovanú rýchlymi udalosťami, ktoré vedú k aktivácii cytosolických signálnych kaskád, ktoré sú normálne spúšťané rastovými faktormi7,8. Klasické aj neklasické dráhy testosterónu prispievajú k udržaniu spermatogenézy a plodnosti. Funkcia AR je však dôležitejšia v klasickej dráhe, pretože testosterón pôsobí na zvýšenie kvality spermií.

Echinakozid(ECH) je jednou z bioaktívnych zložiek odvodených z liečivých rastlín Echinacea9 a Cistanche10. So širokým spektrom farmakologických aktivít sú extrakty z Echinacey jedným z najobľúbenejších bylinných doplnkov v Európe a USA najmä vďaka svojim antioxidačným vlastnostiam11 a schopnosti predchádzať bežnému nachladnutiu12. zaujimave,Cistancheextrakty aECHsa v tradičnej čínskej medicíne tradične používajú ako tonizujúce činidlo na liečbu reprodukčnej dysfunkcie a na zvýšenie mužskej sexuálnej aktivity10. Niektoré OTC produkty extrakcie Cistanche boli vyvinuté ako výživové doplnky a získavajú na popularite na trhoch so zdravou výživou v Číne a niektorých ďalších ázijských krajinách (China Food and Drug Administration)13. Avšak základné mechanizmyECHopatrenia zostávajú nejasné. Mužská neplodnosť je hlavným zdravotným problémom s odhadovanou prevalenciou 4,2 percenta mužskej neplodnosti na celom svete14. Diagnóza mužskej neplodnosti je v súčasnosti založená na štúdiu kvality spermií vrátane analýzy semenných parametrov, ako je koncentrácia spermií, motilita a morfológia15. Bisfenol A (BPA) napodobňujúci estrogén je rozšírený environmentálny kontaminant, ktorý bol študovaný z hľadiska jeho vplyvu na mužskú plodnosť u niekoľkých druhov zvierat a ľudí16. BPA narúša os hypotalamus-hypofýza-gonáda, inhibuje expresiu testikulárnych steroidogénnych enzýmov a syntézu testosterónu u mláďat samcov17, čo spôsobuje stav hypogonadotropného hypogonadizmu18. V tejto štúdii skúmame účinkyECHna kvalitu spermií a hladinu hormónov. Okrem toho bol BPA vybraný ako modelové činidlo poranenia spermií na ďalšie štúdium ochranného účinkuECHproti zlej kvalite spermií.

Výsledky ECH zvyšuje množstvo spermií. Počty spermií v cauda nadsemenníku, životaschopnosť spermií a pohyblivosť spermií sú uvedené v tabuľke 1. Liečba 80 mg/kg ECH a 15 mg/kg testosterón propionátu (TP) významne zvýšila počet nadsemenníkov. Nezistil sa však žiadny významný rozdiel v životaschopnosti spermií a pohyblivosti spermií.

ECH zvyšuje hladiny testosterónu a LH v sére, encefalóne plus hypofýze a semenníkoch. Liečba ECH výrazne zvýšila hladiny LH v sére, encefalóne plus hypofýze a semenníkoch (obr. 1A). V skupine ECH(H) sa hladiny LH výrazne zvýšili 1.1-násobne v sére, 1.4-násobne v mozgu a hypofýze a 1.2-násobne v semenníkoch. Testosterón sa po liečbe ECH(H) významne zvýšil 1,5 a 1{10}}násobne v encefalóne plus hypofýze a semenníkoch, ale nie v sére. Po liečbe TP sa hladiny testosterónu významne zvýšili 1,6, 1,8 a 1,{16}}násobne v sére, encefalóne plus hypofýze a semenníkoch.

ECH increased steroidogenic enzyme gene expression. ECH significantly increased the expressions of key steroidogenic enzymes in the testis (Fig. 1B). The mRNA levels of CYP11A1, CYP17A1, HSD3β1/2, and HSD17β in the ECH(H) group were increased more than 3-fold, while the levels of StAR mRNA showed no significant differences with all ECH treatments (p>0.05). TP významne nezmenil expresiu CYP11A1, CYP17A1, HSD3 1/2 a HSD17. To sa odráža v komplexnej analýze teplotnej mapy účinku ECH na expresiu steroidogénnych enzýmov, čo naznačuje, že ECH významne zvýšilo hladiny mRNA CYP11A1, CYP17A1, HSD3 1/2 a HSD17, a najmä HSD3 1/ 2 (obr. 1C).

ECH môže prechádzať cez hematoencefalickú bariéru a v menšej miere cez hematoencefalickú bariéru. Na vyhodnotenie androgénnej spätnoväzbovej slučky na HPG-osi sa v sérii PK štúdií hodnotila schopnosť ECH vstúpiť do hypotalamu. Koncentrácie ECH boli detegované v hypotalame po 12-hodinovom jednorazovom perorálnom podaní 30mg/kg ECH a ECH vykazovala výraznú penetráciu hypotalamu s priemerným pomerom hypotalamus/plazma 33,92 percent (obr. 2A). Hodnoty Te T1/2 boli 2,61±0,42 h a 1,88±0,22 h v plazme a hypotalame, v tomto poradí (obr. 2B). Pomocou HPLC sa však zistil veľmi obmedzený prístup ECH do semenníkov. Koncentrácie ECH v semenníkoch boli 0.083 ug/ml, 0,043 ug/ml a 0,028 ug/ml po 0,5 h, 1 h a 1,5 h po liečbe .

ECH znižuje translokáciu AR hypotalamu do jadra. Na testovanie účinku ECH na translokáciu AR sa stanovila expresia AR v cytoplazme a jadre semenníkov a hypotalamu pomocou analýzy western blot. Ako je znázornené na obr. 3A, ECH znížila AR proteín v hypotalamických jadrách päťnásobne v porovnaní s kontrolnou skupinou. Liečba enzalutamidom, inhibítorom AR, znížila hladiny proteínu AR v hypotalamických jadrách 4.8--krát. Je pozoruhodné, že cytoplazmatická AR bola vyššia pri liečbe ECH a liečbe enzalutamidom ako kontroly, čo naznačuje, že ECH blokuje transport AR z cytoplazmy do jadra v hypotalame. Ako sa očakávalo, ECH neinhibuje transport AR z cytoplazmy do jadra v semenníkoch (obr. 3B).

ECH zvýšila expresiu génov súvisiacich s HPG osou. ECH signifikantne zvýšilo expresiu LH, LHR, GnRH1 a Gnrhr v zmesiach encefalónu a hypofýzy, avšak po liečbe TP nebol žiadny významný rozdiel v hladinách GnRH1. Analýza teplotnej mapy ukazuje, že expresie GnRH 1 a LH boli najvyššie medzi génmi súvisiacimi s osou HPG.

AR je cieľom ECH. Na potvrdenie vzťahov medzi ECH a AR bol úspešne syntetizovaný ECH-ovalbumín (ECH-OVA) (obr. 5A, B). Molekulová hmotnosť ECH-OVA je väčšia ako OVA, takže majú rôznu mieru mobility (obr. 5A) a vrchol absorbancie ECH-OVA je medzi ECH a OVA (obr. 5B),

čo naznačuje, že ECH bol úspešne konjugovaný s OVA. Nepriame výsledky ELISA (obr. 5C) ukazujú, že anti-AR protilátka je schopná detegovať AR proteín prítomný v jamkách obsahujúcich ECH-OVA (indikované anti-OVA protilátkou), čo naznačuje, že ECH sa môže viazať na AR proteín. ECH sa kombinuje s AR pocket of Met-894 a Val-713. Zlúčenina ECH bola pripojená k miestu AF2 na povrchu ľudského AR a teoretický väzbový režim ECH a AR bol znázornený na obr. 5D. Zlúčenina ECH prijala kompaktnú konformačnú väzbu vo vrecku ľudského AR. Tieto dve fenylové skupiny ECH sa viažu na hydrofóbnu doménu vrecka AR a udržiavajú tesné hydrofóbne kontakty so zvyškami Leu-712, Val-716, Met{10}}, Ile-737 , Met-894 a Ile{13}}, zatiaľ čo ostatné dve strany ECH boli umiestnené pri vchode do vrecka a nadviazali len niekoľko kontaktov. Podrobná analýza ukázala, že Met{14}} (dĺžka väzby: 2,4 Á) aj Val{17}} (dĺžka väzby: 2,7 Á) vytvorili vodíkové väzby s hydroxy1 skupinami ECH, čo bola hlavná interakcia medzi ECH a ľudský AR. ECH zmierňuje BPA-indukované reprodukčné poškodenie. Na skúmanie účinku ECH na reprodukčné poškodenie sa skúmala kvalita spermií a hladiny pohlavných hormónov a steroidogénnych enzýmov u myší indukovaných BPA. Ako je znázornené na obr. 6, liečba BPA významne znížila počet spermií o 26,5 percent a pohyblivosť spermií o 39,2 percent. Podávanie ECH zabránilo zníženiu počtu spermií o 35,5 percenta a pohyblivosti spermií o 30,1 percenta. Podávanie BPA tiež viedlo k významnému zníženiu sekrécie LH a T a ECH značne zvýšilo hladiny LH a T o 24,1 percenta a 18,3 percenta v porovnaní s liečbou samotným BPA (obr. 6A, B). Hladiny mRNA StAR, CYP17A1, 3 -HSD a 17 -HSD pri liečbe BPA-ECH boli významne zvýšené v porovnaní s liečbou BPA (obr. 6C, D).