Časť Ⅰ Adjuvantná hodnota Herba Cistanches pri použití v kombinácii so statínom u myších modelov

Elaine Wat, Chun Fai Ng, Chi Man Koon, Cheng Zhang, Si Gao, Brian Tomlinson & Clara Bik San Lau

1 Inštitút čínskej medicíny, Čínska univerzita v Hong Kongu, Shatin, New Territories, Hong Kong.

2 Štátne kľúčové laboratórium fytochémie a rastlinných zdrojov v západnej Číne, Čínska univerzita v Hong Kongu, Shatin, New Territories, Hong Kong.

3 Divízia klinickej farmakológie, Katedra medicíny a terapie, Čínska univerzita v Hong Kongu, Shatin, New Territories, Hong Kong. Elaine Wat a Chun Fai Ng prispeli k tejto práci rovnakým dielom. Korešpondenciu a žiadosti o materiály je potrebné adresovať spoločnosti CBSL (e-mail: claralau@cuhk.edu.hk)

Ďalšie informácie: emily.li@wecistanche.com

Kliknutím sem získate viac informácií o Cistanche

Abstraktné

Statíny sú dobre známe tým, že majú problémy s toxicitou svalov.HerbaCistanches(HC) je čínska bylina tradične používaná pri bolestiach bedier a kolien. Naša predchádzajúca štúdia in vitro naznačila, že by mohla chrániť pred svalovou toxicitou vyvolanou statínmi. Jeho ochranný účinok in vivo sa však nikdy neskúmal. Cieľom tejto štúdie bolo zistiť, či vodný extrakt zHerbaCistanche(HCE) by mohla zabrániť svalovej toxicite vyvolanej simvastatínom u potkanov a či by Herba Cistanche E mohla mať priaznivé účinky aj na zníženie hypercholesterolémie vyvolanej stravou s vysokým obsahom tukov a zvýšeného cholesterolu v pečeni, čím by sa znížila dávka simvastatínu pri použití v kombinovanej liečbe. Z našich výsledkov Herba Cistanche E významne obnovila simvastatínom indukovanú redukciu svalovej hmotnosti a znížila zvýšenú plazmatickú kreatínkinázu u potkanov.HerbaCistancheE tiež zlepšila simvastatínom indukované zníženie hladín svalového glutatiónu, potenciál svalovej mitochondriálnej membrány a znížilo simvastatínom indukovaný svalový zápal. Okrem toho by HCE mohla spôsobiť zníženie hmotnosti pečene, celkových hladín pečeňových lipidov a hladín lipidov v plazme u myší s vysokým obsahom tuku. Na záver, naša štúdia poskytla dôkaz in vivoHerba CistancheE má potenciálne ochranné účinky na toxicitu vo svaloch vyvolanú simvastatínom a tiež priaznivé účinky na nealkoholické stukovatenie pečene vyvolané diétou a hyperlipidémiu, keď sa používa samostatne alebo v kombinácii so simvastatínom v zníženej dávke.

Inhibítory HMG-CoA reduktázy, tiež známe ako statíny, sú dobre zdokumentované ako prospešné pre hypercholesterolemických pacientov so stredným a vysokým rizikom kardiovaskulárnych ochorení1. Statíny, jedna z najpredávanejších tried liekov na predpis na svete, pôsobia prostredníctvom inhibície redukcie HMG-CoA na kyselinu mevalónovú počas skorého štádia mevalonátovej dráhy, čím znižujú endogénnu syntézu cholesterolu2, 3. Hoci statíny sú zvyčajne dobre tolerované , jedným z najdôležitejších a najznámejších klinických nežiaducich účinkov sú abnormality kostrového svalstva, ktoré sa môžu pohybovať od benígnej myalgie po ťažkú ​​myopatiu4, 5. Vo veľkom prieskume na 10 409 francúzskych subjektoch uskutočnenom prostredníctvom telefonického rozhovoru 10 percent pacientov dostávajúcich liečba statínmi hlásila svalové symptómy, z ktorých 30 percent týchto symptomatických pacientov viedlo k prerušeniu liečby6. Národná tímová skupina pre bezpečnosť statínov pre lipidovú asociáciu poskytla odporúčania na zvládanie svalových symptómov u pacientov podstupujúcich liečbu statínmi. Vo všeobecnosti sa odporúča, aby sa u pacientov so závažnými príznakmi, ako je zvýšená kreatínkináza (CK) viac ako 5-násobok ULN, podávanie statínov nevykonávalo, kým sa hladina CK opäť nenormalizuje5. V dôsledku výskytu týchto vedľajších účinkov a toho, že neexistuje žiadna účinná liečba svalovej toxicity vyvolanej statínmi, existuje potreba hľadať nové terapie na zvládnutie svalových problémov vyvolaných statínmi.

Zatiaľ čo sa navrhuje zmes mechanizmov, ktoré by mohli byť zodpovedné za nepriaznivé účinky statínu, predpokladá sa, že mitochondriálne mechanizmy sa podieľajú na nežiaducich účinkoch statínu na svalovú toxicitu1. Mevalonát nie je len prekurzorom cholesterolu, ale je aj prekurzorom dôležitých zlúčenín, ako sú selenoproteíny, dolichol a ubichinón7, 8. Statín môže znižovať hladinu selenoproteínu, ako je glutatiónperoxidáza (GPx), čím ohrozuje hustotu antioxidantov a prispieva k jeho nepriaznivým účinkom. účinky4. Statíny môžu tiež viesť k deplécii ubichinónu, čo spôsobuje zníženú spotrebu kyslíka a syntézu ATP9. Okrem toho zvyšujúce sa štúdie in vitro a in vivo ukázali, že statín môže tiež pôsobiť priamo na tkanivové mitochondrie, čo spôsobuje zvýšené reaktívne formy kyslíka (ROS) a mitochondriálny oxidačný stres, čo vedie k bunkovej smrti, a teda prispieva k poškodeniu pečene a svalov10, 11.

HerbaCistanches, celá sušená rastlina zCistanchedeserticolaYC Ma (čeľaď Orobanchaceae) sú parazitické rastliny, ktoré rastú prevažne v púštnych oblastiach severnej a severovýchodnej Číny12. Podľa teórie čínskej medicíny má Herba Cistanches chuť sladkú, teplú a slanú13. Ide o Yang povzbudzujúcu čínsku tonizujúcu bylinu, ktorá sa primárne používa na liečbu nedostatku obličiek s príznakmi ako impotencia, neplodnosť, predčasná ejakulácia. Je to tiež čínska bylina, ktorá sa tradične predpisuje pacientom proti bolestiam v bedrách a kolenách a bežne sa používa v čínskych prípravkoch na liečbu svalových problémov12, 14. Je zaujímavé, že je to v súlade aj s modernými vedeckými štúdiami, ktoré preukázali anti -únavové aktivity extraktu Herba Cistanches bohatého na polysacharidy a fenyletanoidy u potkanov po cvičení znížením poškodenia svalov a zlepšením ukladania ATP15. Okrem toho nedávna práca ukázala, že metanolový extrakt z Herba Cistanches by mohol zvýšiť mitochondriálnu tvorbu ATP16.HerbaCistanchessa tiež dokázalo, že je silným antioxidantom a lapačom voľných radikálov v rôznych orgánoch, znižuje oxidačný stres a aktivity ROS in vivo štúdie17, 18. V nedávnej štúdii vykonanej naším laboratóriom sme preukázali, žeHerbaCistanchesvodný extrakt významne zabránil toxicite vyvolanej simvastatínom v bunkách kostrového svalstva L6, ako aj v závislosti od dávky obnovenej redukcii produkcie ATP v bunkách L6 vyvolanej simvastatínom, čo naznačuje potenciálHerbaCistanchesvodný extrakt na ochranu proti svalovej toxicite vyvolanej statínmi19. Dôkazy in vivo však chýbajú.

Preto sme to predpokladaliHerbaCistanchesvodný extrakt (HCE) by mohol mať priaznivé účinky na svalovú toxicitu vyvolanú simvastatínom. Cieľom tejto štúdie bolo teda zistiť, či by použitie HCE mohlo znížiť svalovú toxicitu vyvolanú simvastatínom pomocou in vivo zvieracieho modelu a okrem toho, či by HCE mohla mať priaznivé účinky aj na zníženie hypercholesterolémie vyvolanej stravou s vysokým obsahom tukov a zvýšeného cholesterolu v pečeni. , čím sa zníži použitá dávka simvastatínu.

Materiály a metódy

Autentifikácia a extrakcia rastlinných materiálov.

Surový rastlinný materiál zHerbaCistanches(Cistanche deserticola, pochádza z Vnútorného Mongolska) bola zakúpená od Zi Xin, renomovaného dodávateľa v Guangzhou, Čína. Herba Cistanches bola chemicky overená pomocou chromatografie na tenkej vrstve a ultravýkonnej kvapalinovej chromatografie v súlade s Čínskym liekopisom 201013, ako už bolo opísané19, sverbaskozidaechinakozid(zakúpené od Národného inštitútu pre kontrolu farmaceutických a biologických produktov, Čína) ako chemické markery. Po chemickom overení, vzor herbárového poukazu zHerbaCistanchesbol uložený v Múzeu Inštitútu čínskej medicíny na Čínskej univerzite v Hongkongu so vzorovým kupónom číslo 2014-3434.

HerbaCistanchesvodný extrakt sa pripravil tak, ako bolo opísané vyššie19. Stručne, 1 kg surovej byliny sa namáčal počas 1 hodiny, nasledovala dvakrát extrakcia zahrievaním počas 1 hodiny pod spätným chladičom pri 100 stupňoch s použitím 10x destilovanej vody. Vodné extrakty (HCE) sa potom spojili a prefiltrovali a filtrát sa skoncentroval za zníženého tlaku pri 60 °C. Koncentrovaný extrakt sa lyofilizoval do sucha. Percento výťažku bolo 50,1 % hmotn. Všetok extrahovaný prášok bol vákuovo zabalený a skladovaný až do použitia.

Pokusné zvieratá.

Simvastatín bol zakúpený od SR Pharmasolutions Ltd. Samce potkanov Sprague Dawley (180–200 g) a samce myší C57Bl/6J (staré 8-týždeň) dodalo Centrum služieb laboratórnym zvieratám, Čínska univerzita v Hong Kongu. Pokusy na zvieratách boli schválené Etickou komisiou pre pokusy na zvieratách Čínskej univerzity v Hong Kongu (ref. č. 12/074/MIS). Všetky experimentálne metódy sa uskutočňovali podľa schválených smerníc špecifikovaných Etickou komisiou pre pokusy na zvieratách Čínskej univerzity v Hong Kongu. Všetky potkany (3 zvieratá na klietku) a myši (5 zvierat na klietku) boli umiestnené v normálnych štandardných klietkach pri konštantnej teplote 21 stupňov s 12-hodinovým cyklom svetlo-tma. Každá štandardná klietka obsahovala osiku ako materiál podstielky. Všetkým zvieratám bol umožnený ad libitum prístup k potrave a vode.

Štúdia svalovej toxicity vyvolanej statínom u potkanov.

Všetky potkany boli náhodne rozdelené do 5 skupín (n=5–10). Všetky zvieratá boli na normálnej strave. Tiež im bola denne podávaná destilovaná voda alebo simvastatín a intragastricky s liečbou HCE alebo bez nej. Zvieratám, u ktorých sa vyžaduje podávanie simvastatínu aj HCE, sa HCE podával 3 hodiny po podaní simvastatínu, aby sa zabránilo akejkoľvek priamej chemickej interakcii bylina-liek. Bylinný extrakt alebo simvastatín bol rozpustený v 0,5 percenta metylcelulózy v destilovanej vode v známej koncentrácii. Každému zvieraťu sa intragastricky podal vopred vypočítaný objem podľa hmotnosti jedinca tak, aby vypočítaný objem obsahoval množstvo navrhovanej požadovanej dávky. Podrobnosti o týchto skupinách sú nasledovné:

Skupina a) Normálna strava plus destilovaná voda (normálna kontrolná skupina)

Skupina b) Normálna strava plus simvastatín (640 mg/kg)

Skupina c) Normálna strava plus simvastatín (640 mg/kg) plus nízka dávka HCE (1,1 g/kg zvieraťa)

Skupina d) Normálna strava plus simvastatín (640 mg/kg) plus vysoká dávka HCE (2,2 g/kg zvieraťa)

Skupina e) Normálna strava plus vysoká dávka HCE (2,2 g/kg zvieraťa)

Príjem potravy sa zaznamenával denne a telesná hmotnosť sa merala dvakrát týždenne. Liečba sa podávala 4 týždne. Potom sa zvieratá anestetizovali pomocou zmesi ketamínu (100 mg/kg) a xylazínu (10 mg/kg) intraperitoneálne. Krv sa odobrala srdcovou punkciou a nechala sa zraziť. Plazma sa potom oddelila centrifugáciou (3, 000 otáčky za minútu počas 10 minút). Rôzne svaly (quadriceps, gastrocnemius, soleus, tibialis anterior a extensor digitorumlongus) boli vyrezané a uložené pri -80 stupňoch až do analýzy.

Meranie plazmatickej kreatínkinázy. Plazmatická kreatínkinázová (CK) aktivita bola stanovená pomocou súpravy Stanbio CK Liqui-UV® (2910-430, Stanbio Laboratory, USA) podľa pokynov výrobcu.

Meranie svalovej glutatiónperoxidázy. Svalová glutatiónperoxidáza (GPx) sa merala pomocou komerčne dostupnej súpravy (703102, Cayman Chemical, USA) podľa pokynov výrobcu. Stručne povedané, svalové tkanivá sa opláchli PBS pri pH 7,4, aby sa odstránili všetky červené krvinky, a homogenizovali sa v 5–10 ml studeného lyzačného pufra, potom sa homogenát centrifugoval pri 10,000 g počas 15 minút pri 4 stupňoch. Supernatant sa potom odstránil a testoval sa na aktivitu GPx pomocou komerčnej súpravy.

Príprava svalových mitochondriálnych a cytosolických frakcií. Mitochondriálne a cytosolové frakcie zo svalových vzoriek sa pripravili pomocou súpravy na izoláciu mitochondrií (MITOISO, Sigma-Aldrich Corporation, USA) podľa pokynov výrobcu. Stručne povedané, vzorky čerstvej svaloviny boli vopred ošetrené extrakčným maslom, nakrájané na malé kúsky a homogenizované v extrakčnom pufri. Tkanivové homogenáty sa potom odstredili. Supernatant bol odobratý a rezervovaný na analýzu cytosolickej frakcie. Mitochondriálne pelety sa potom premyli a znova odstredili a použili na analýzu mitochondriálnej frakcie.

Meranie svalových mitochondriálnych reaktívnych druhov kyslíka (ROS). ROS sa meralo protokolom upraveným z predchádzajúcej literatúry20. Stručne, ROS sa meral z mitochondriálnej frakcie (50 ug proteínu/ml) s použitím roztoku DCFDA (C6827, Invitrogen, USA). Zmes sa inkubovala pri 37 stupňoch počas 10 minút v tme, potom sa inkubovala so substrátovým roztokom (10 mM pyruvát, 15 mM malát) na fotoaktiváciu. Intenzita fluorescencie sa merala každých 5 minút počas 60 minút pomocou BioRad Fluostar Optima 413-101 BMG Fluorescent Microplate Reader pri excitácii 485 nm a emisii 520 nm. Na meranie tvorby ROS sa vypočítali intenzity fluorescencie.

Svalový mitochondriálny membránový potenciál. Mitochondriálny membránový potenciál mitochondriálnej frakcie zo svalových vzoriek bol stanovený podľa protokolu výrobcu (MITOISO, Sigma-Aldrich Corporation, USA). Tento postup je test s pevným bodom, ktorý meria vychytávanie JC-1 s tvorbou J-agregátov. V stručnosti, mitochondriálna suspenzia sa zriedila tak, aby obsahovala 20 ug proteínu a inkubovala sa s JC-1 farbením počas 7 minút pri teplote miestnosti. Táto 7-minúta je čas optimalizovaný a overený výrobcom s použitím rôznych zlúčenín (ako je uvedené v protokole výrobcu), pretože pozorovaná fluorescencia roztoku stúpne na plató po 5 až 10 minútach, po čom nasleduje drastický pokles fluorescenciu JC{10}} v dôsledku vyrovnania koncentrácií JC{11}} vo vnútri a mimo mitochondriálnej matrice. Intenzita fluorescencie sa merala pomocou BioRad Fluostar Optima 413-101 BMG Fluorescent Microplate Reader pri excitácii 490 nm a emisii 590 nm. Na meranie potenciálnych gradientov sa vypočítali intenzity fluorescencie.

Svalová histológia a hodnotenie zápalu. Imunohistochémia zápalových buniek vo svaloch sa hodnotila farbením CD68 a CD163, ako už bolo opísané 21–23. Parafn rezy s hrúbkou 5 μm boli narezané, prilepené na sklíčka Superfrost™ Plus (Menzel-Gläser, Nemecko). Primárne myšie anti-potkanie CD68, ED1 a CD163 protilátky, ED2, (Bio-Rad, USA) sa aplikovali na rezy v riedení 1:100. Špecifické farbenie bolo detegované systémom EnVision™ Systems (Dako, Dánsko) s použitím sekundárnej protilátky, EnVision-HRP polymérom konjugovaného anti-myšieho IgG v riedení 1:200, a detegované použitím roztoku DAB (Dako, Dánsko). kontrastným farbením hematoxylínom. Rezy sa potom umiestnili do dibutylftalátu v históne (DPX). Prítomnosť neutrofilov vo svaloch bola detegovaná kvantitatívnou imunohistochémiou pomocou softvéru ImageJ.

Analýza expresie svalových génov. PCR test, ktorý profiluje gény súvisiace s oxidačným stresom, bol vykonaný pomocou potkaních polí na oxidačný stres a antioxidačnú obranu (PARN-065Z, SABiosciences, Frederick, USA). PCR čip sa uskutočnil podľa pokynov výrobcu. Stručne, celková RNA sa izolovala selektívnou väzbou na membránu na báze silikagélu po lýze a homogenizácii svalových vzoriek v denaturačnom guanidíntiokyanátovom pufri (RNeasy kit, Qiagen). RNA bola reverzne transkribovaná do cDNA pomocou súpravy RT2 First Strand Kit (SABiosciences, Frederick, USA). Táto cDNA sa potom pridala do RT2 SYBR Green qPCR Master Mix (SABiosciences, Frederick, USA). Ďalej bola každá vzorka rozdelená na alikvóty na potkaních poliach s oxidačným stresom a antioxidačnou obranou (SABiosciences, Frederick, USA). Všetky kroky boli uskutočnené podľa protokolu výrobcu.

Štúdia hyperlipidémie vyvolanej stravou s vysokým obsahom tukov a steatózy pečene u myší.

Všetky myši boli náhodne rozdelené do 5 skupín (n=8–10) a dostali nasledovné: Skupina a) Normálna strava (tabuľka 1); Skupiny b až e) Diéta s vysokým obsahom tukov (obsahuje 21 percent tuku a 0,15 percent cholesterolu) (tabuľka 2). Po dobu 8 týždňov sa zvieratám podávali diéty na vyvolanie obezity. Po 8 týždňoch sa všetkým skupinám s vysokým obsahom tuku podávala destilovaná voda alebo simvastatín denne a alebo liečba HCE intragastricky, 3 hodiny po podaní simvastatínu. Bylinný extrakt alebo simvastatín sa rozpustil v 0,5 percentnej metylcelulóze (Sigma-Aldrich Corporation, USA) v destilovanej vode v známej koncentrácii. Každému zvieraťu sa intragastricky podal vopred vypočítaný objem podľa hmotnosti jedinca tak, aby vypočítaný objem obsahoval množstvo navrhovanej požadovanej dávky. Podrobnosti o týchto skupinách sú nasledovné:

Skupina a) Normálna strava plus destilovaná voda

Skupina b) Diéta s vysokým obsahom tukov plus destilovaná voda

Skupina c) Diéta s vysokým obsahom tukov plus simvastatín (50 mg/kg)

Skupina d) Diéta s vysokým obsahom tukov plus HCE (4,4 g/kg)

Skupina e) Diéta s vysokým obsahom tukov plus simvastatín (25 mg/kg) plus HCE (4,4 g/kg)

Príjem potravy sa zaznamenával denne a telesná hmotnosť sa merala dvakrát týždenne. Na konci 16-týždňovej štúdie boli všetky myši usmrtené po 16-hodinovom nočnom hladovaní. Zvieratá boli anestetizované zmesou ketamínu (100 mg/kg) a xylazínu (10 mg/kg) intraperitoneálne. Krv sa odobrala srdcovou punkciou a nechala sa zraziť. Plazma bola oddelená centrifugáciou (3, 000 rpm počas 10 minút). Pečene boli vyrezané a skladované pri -80 stupňoch až do analýzy.

Meranie lipidov v plazme a pečeni.

Koncentrácie plazmatických triglyceridov, cholesterolu (11488872216 a 11489232216, Roche Diagnostics, Švajčiarsko), lipoproteínového cholesterolu s vysokou a nízkou hustotou (HDL-C typu L a LDL-C typu L, Wako Pure Chemicals Industries, Japonsko) boli merané enzymatické metódy s použitím komerčne dostupnej súpravy podľa pokynov výrobcu. Plazmatická kreatínkinázová (CK) aktivita bola stanovená pomocou súpravy Stanbio CK Liqui-UV® (2910-430, Stanbio Laboratory, USA). Celkové pečeňové lipidy boli stanovené gravimetricky po extrakcii metódou Bligha a Dyera24. Jednotlivé pečeňové lipidy sa kvantifikovali enzymaticky (ako je opísané vyššie) po solubilizácii v izopropanole (Sigma-Aldrich, USA)25.

Histopatológia pečene a hodnotenie zápalu. Farbenie hematoxylínom a eozínom (H&E farbenie). Rezy kliešťov (5 μm) tkaniva zaliateho parafínom boli narezané pomocou mikrotómu a umiestnené na mikroskopické sklíčka SuperFrost Plus® (Thermo Scientific, USA). Rezy sa podrobili farbeniu H&E podľa metódy Harris et al. 26 a pripevnený dibutylftalátom v históne (DPX) (Sigma-Aldrich, USA)25.

Mac{0}} farbenie a kvantifikácia. Hrubé rezy (5 μm) tkaniva zaliateho parafínom boli narezané pomocou mikrotómu a umiestnené na mikroskopické sklíčka SuperFrost Plus® (Thermo Scientific, USA). Uskutočnilo sa vyhľadávanie antigénu, po ktorom nasledovalo blokovanie pomocou Peroxidase Block (Dako Cytomation, Dánsko). Primárne purifikovaná anti-myšia Mac-3 protilátka (BD Pharmingen, USA) bola aplikovaná na rezy v riedení 1:50. Špecifické farbenie sa detegovalo pomocou EnVision™ Systems (Dako, Dánsko). Sklíčka boli inkubované so sekundárnou protilátkou, EnVision-HRP polymérom konjugovaným anti-králičím IgG v riedení 1:200. Mac-3 bol detegovaný pomocou roztoku DAB (Dako, Dánsko) a kontrastne zafarbený hematoxylínom. Sekcie boli potom namontované v DPX. Prítomnosť makrofágov v pečeni bola detegovaná kvantitatívnou imunohistochémiou pomocou softvéru ImageJ.

Štatistická analýza. Rozdiely medzi liečenými a kontrolnými skupinami boli testované pomocou jednosmernej analýzy rozptylu (ANOVA), po ktorej nasledoval posthoc Bonferroniho viacnásobný porovnávací test. Všetky štatistické analýzy boli vykonané pomocou GraphPad Prism Version 6.0 (GraphPad, USA). Pravdepodobnosť p<0.05 would="" be="" considered="" statistically="">

Výsledky

ÚčinokHerbaCistancheE na svalovú toxicitu vyvolanú simvastatínom u potkanov. Meranie svalovej hmotnosti a plazmatickej kreatínkinázy. Zo všetkých liečených potkanov sa izolovalo päť rôznych typov svalov (kvadriceps, gastrocnemius, soleus, tibialis anterior a extensor digitorum longus). Účinky rôznych liečebných postupov na svalovú hmotnosť sú znázornené na obr. 1a. Simvastatín (640 mg/kg) vyvolal signifikantné zníženie hmotnosti štvorhlavého svalu, lýtkového svalu a predného holenného svalu u potkanov, pričom tieto zníženia významne obnovila HCE v kvadricepsoch a svaloch gastrocnemia v závislosti od dávky. HociHerbaCistancheU potkanov liečených simvastatínom E prejavil trend obnovy hmotnosti predného holenného svalu, žiadna z týchto liečebných skupín nedosiahla štatistickú významnosť. V porovnaní s kontrolnými potkanmi nebol pozorovaný žiadny významný účinok liečby samotným HCE na svalovú hmotnosť (obr. la).

Obrázok 1b ukazuje účinky rôznych ošetrení na hladiny plazmatickej kreatínkinázy (CK) u potkanov. Simvastatín indukoval významné zvýšenie aktivity kreatínkinázy u potkanov, ktoré bolo významne znížené súbežnou liečbou HCE pri oboch dávkach. V porovnaní s kontrolnou skupinou sa tiež nezistil žiadny významný účinok liečby samotnou HCE na hladiny CK. Keďže sa gastrocnemius javil ako citlivý na liečbu simvastatínom a je to najväčší sval izolovaný podľa hmotnosti, vybrali sme tento sval na ďalšiu analýzu vrátane merania svalovej glutatiónperoxidázy (GPx), merania mitochondriálnych MMP a ROS a svalovej histológie a hodnotenia zápalu .

Meranie svalovej glutatiónperoxidázy (GPx). Boli merané hladiny svalovej glutatiónperoxidázy a znázornené na obr. 2a. Podávanie simvastatínu vyvolalo trend zníženia merania svalovej glutatiónperoxidázy (GPx) u potkanov. Avšak HCE prejavila tendenciu zlepšovať simvastatínom indukovanú redukciu svalového GPx pri oboch dávkach 1,1 g/kg a 2,2 g/kg. V porovnaní s normálnymi kontrolnými potkanmi sa tiež nezistil žiadny významný účinok liečby samotným HCE na hladiny svalového GPx.

Mitochondriálny membránový potenciál (MMP) a meranie ROS. Liečba simvastatínom (640 mg/kg) vyvolala významné zníženie svalovej MMP (obr. 2b). Toto zníženie sa zlepšilo v závislosti od dávky u potkanov, ktorí dostávali súbežnú liečbu HCE a simvastatínu (obr. 2b). Na druhej strane je zaujímavé, že skupina liečená samotným simvastatínom mala významne znížené hladiny svalového mitochondriálneho ROS v porovnaní s normálnou kontrolnou skupinou (obr. 2c). Avšak liečba HCE podávaná potkanom liečeným simvastatínom vykazovala trend závislý od dávky na obnovenie svalových mitochondriálnych hladín ROS na normálnu úroveň. V porovnaní s normálnou kontrolnou skupinou sa tiež nezistil žiadny významný účinok samotnej liečby HCE u potkanov pri meraní mitochondriálnej MMP a ROS.

Svalová histológia a hodnotenie zápalu. Gastrocnemius svaly z krýs, ktorým boli podávané rôzne liečby, sa ďalej analyzovali histologicky a reprezentatívne zafarbené rezy sú znázornené na obr. 3a. Zvieratá v kontrolnej skupine preukázali histologické rezy normálnych svalov. Na rozdiel od toho rezy H&E zo zvierat liečených simvastatínom odhalili infiltráciu zápalových markerov (žlté šípky), ktorá bola významne znížená v tých svalových rezoch potkanov, ktorým bola podávaná kombinácia simvastatínu a HCE. Uskutočnili sa aj imunohistochemické analýzy na prítomnosť makrofágov CD68 a CD163 na obrázkoch 4a a 5a, v danom poradí, s kvantifikáciou príslušných makrofágov znázornených na obrázkoch 4b a 5b. Imunohistochemická analýza svalových rezov odhalila prítomnosť makrofágov (CD68) u potkanov liečených simvastatínom (hnedé sfarbenie), ktoré bolo významne znížené u potkanov, ktorým bola súčasne podávaná HCE v oboch dávkach (obr. 4b). U zvierat liečených samotným HCE sa tiež nepozoroval žiadny významný zápal. Podobne imunohistochemická analýza svalových rezov odhalila prítomnosť CD163-pozitívnych makrofágov u potkanov liečených simvastatínom (hnedé sfarbenie), ktoré bolo významne znížené u potkanov, ktorým bola súčasne podávaná HCE v dávke 2,2 g/kg (obr. 5b ). U zvierat liečených samotným HCE sa tiež nepozoroval žiadny významný zápal.

Analýza expresie svalových génov. Aby sa určili účinky simvastatínu a HCE na gény súvisiace s oxidačným stresom vo svale, uskutočnil sa PCR test, ktorý profiluje gény súvisiace s oxidačným stresom, s použitím polí PCR s oxidačným stresom potkanov a antioxidačnou obranou. Gény, ktoré boli významne ovplyvnené liečbou simvastatínom, boli analyzované a uvedené na obr. 6. Pre profil expresie génov regulujúcich antioxidanty potkany liečené simvastatínom (640 mg/kg) zvýšili expresiu génov regulujúcich antioxidanty. Tese zahŕňa glutatiónperoxidázy (GPx) GPx1 a GPx7 a ďalšie peroxidázy vrátane Serpinb1b a palice (obr. 6a). HCE v oboch dávkach (1,1 alebo 2,2 g/kg) znížila tieto simvastatínom indukované zvýšenia GPxs a iných peroxidáz na normálnu úroveň. Na druhej strane samotná liečba HCE významne zvýšila hladiny expresie GPx1. Pokiaľ ide o expresiu génov regulujúcich metabolizmus ROS, simvastatín významne indukoval expresiu iných génov metabolizmu superoxidov, vrátane Cyba, Ncf1, Ncf2, Scd1 a Ucp2. Podobne HCE v oboch dávkach významne znížilo tieto zvýšenia (obr. 6b). Okrem toho simvastatín indukoval expresiu génov reagujúcich na oxidačný stres vrátane Apoe, Ccl5 a Txn1, pričom tieto expresie boli významne znížené u zvierat súčasne liečených HCE pri oboch dávkach (obr. 6c). Na druhej strane simvastatín spôsobil významné zníženie génovej expresie Txnipu. Nezistil sa žiadny významný účinok HCE na zníženie expresie génu Txnip indukované simvastatínom (obr. 6c). Simvastatín tiež významne zvýšil expresiu génov regulujúcich transportéry kyslíka vrátane Slc38a1 a Vim. Súbežná liečba HCE znížila expresiu týchto génov pri oboch dávkach (obr. 6d).

Účinky kombinovaného použitia simvastatínu a HCE na príjem potravy a telesnú hmotnosť u myší. Obrázok 7a ukazuje denný príjem potravy myší pre všetky liečené skupiny. Strava s vysokým obsahom tukov vyvolala u zvierat významné zvýšenie denného príjmu potravy v porovnaní so zvieratami kŕmenými potravou (p<0.001). there="" was="" however="" no="" significant="" effect="" of="" the="" herb="" or="" drug="" treatments="" among="" all="" high-fat-fed="" groups="" (fig.="">

Týždenné meranie telesnej hmotnosti. Po 16 týždňoch kŕmenia s vysokým obsahom tuku zvieratá kŕmené HF významne pribrali viac na váhe ako zvieratá kŕmené potravou (obr. 7b). Medzi myšami kŕmenými HF a všetkými liečenými skupinami kŕmenými HF však nebol žiadny významný účinok. Nebol tiež žiadny významný rozdiel medzi myšami kŕmenými HF, ktoré dostávali súbežnú liečbu simvastatínom a HCE v porovnaní s myšami kŕmenými HF, ktoré dostávali liečbu samotným HCE alebo simvastatínom (obr. 7b).

Účinky kombinovaného použitia simvastatínu a HCE na hyperlipidémiu a steatózu pečene u myší. Meranie aktivity plazmatických lipidov a kreatínkinázy. Hladiny lipidov v plazme všetkých myší sú znázornené na obr. 8. V porovnaní s myšami kŕmenými normálnym krmivom mali myši kŕmené HF významne zvýšené hladiny celkového cholesterolu v plazme (TC), ktoré boli významne znížené vo všetkých liečebných skupinách (obr. 8a). . Myši kŕmené HF liečené simvastatínom a HCE mali významne nižšie plazmatické TC v porovnaní so zvieratami so HF, ktorým sa podával samotný simvastatín alebo zvieratá so HF, ktorým bol podávaný samotný HCE (p<0.001 and=""><0.01, respectively)="" (fig.="" 8a).="" no="" significant="" difference="" was="" observed="" between="" hf-fed="" mice="" receiving="" hce="" alone="" vs="" simvastatin="" alone="" treatment="" group,="" suggesting="" hce="" has="" comparable="" effects="" as="" simvastatin.="" besides,="" hf-fed="" mice="" also="" had="" significantly="" higher="" plasma="" triglyceride="" (tg)="" levels="" compared="" to="" mice="" given="" a="" normal="" chow="" diet=""><0.05) (figure="" 8b).="" there="" was="" a="" trend="" for="" a="" reduction="" in="" simvastatin="" treatment="" alone="" group="" on="" plasma="" tg="" in="" hf-fed="" animals,="" though="" this="" did="" not="" reach="" statistical="" significance.="" however,="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" simvastatin="" co-treatment="" significantly="" reduced="" plasma="" tg="" compared="" to="" control="" hf-fed="" animals=""><0.001 and=""><0.01, respectively).="" when="" comparing="" between="" simvastatin="" treatment="" alone="" group="" with="" simvastatin="" co-treatment="" with="" hce="" group,="" hce="" co-treatment="" with="" simvastatin="" had="">

nižší plazmatický TG v porovnaní s myšami kŕmenými HF, ktorým sa podával samotný simvastatín (str<0.01) (fig.="" 8b).="" no="" significant="" difference="" was="" observed="" between="" hf-fed="" mice="" receiving="" hce="" alone="" vs="" the="" simvastatin="" treatment="" group,="" though="" hce="" had="" a="" slightly="" better="" reduction="" in="" tg="" levels.="" in="" addition,="" high-fat-diet-induced="" significant="" increase="" in="" plasma="" high-density="" lipoprotein="" (hdl)="" cholesterol="" and="" plasma="" low-density="" lipoprotein="" (ldl)="" cholesterol="" in="" mice="" compared="" to="" normal="" chow-fed="" animals="" (fig.="" 8c="" and="" d).="" simvastatin="" treatment="" alone="" significantly="" reduced="" both="" lipids="" in="" high-fat-fed="" mice.="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" simvastatin="" co-treatment="" also="" significantly="" reduced="" both="" types="" of="" plasma="" lipids="" compared="" to="" mice="" given="" hf="" diet="" alone.="" there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" both="" lipids="" among="" all="" treatment="" groups.="" figure="" 8e="" showed="" the="" effect="" of="" different="" treatments="" on="" plasma="" creatine="" kinase="" (ck)="" levels.="" interestingly,="" hf="" diet-induced="" significant="" increase="" in="" plasma="" ck="" levels="" in="" mice="" compared="" to="" normal-chow-fed="" mice="" (fig.="" 8e).="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" the="" co-treatment="" of="" simvastatin="" significantly="" reduced="" plasma="" ck="" levels="" compared="" to="" mice="" given="" hf="" diet="" alone=""><0.01 and=""><0.01, respectively).="" simvastatin="" treatment="" alone="" also="" significantly="" reduced="" the="" high-fat="" diet-induced="" increase="" in="" plasma="" ck="" levels.="" there="" was="" also="" no="" significant="" difference="" in="" plasma="" ck="" levels="" among="" all="" active="" treatment="" groups="">meranie lipidov v pečeni.

Účinky rôznych liečebných skupín na hepatomegáliu (zväčšenú pečeň) indukovanú HF boli spojené s významným znížením celkového obsahu lipidov v pečeni, vyjadreného ako miligram lipidov na pečeň (obr. 9a). Celkový obsah pečeňových lipidov bol významne vyšší u myší kŕmených HF v porovnaní s normálnymi myšami kŕmenými potravou (3.0--krát vyšší, p<0.001). simvastatin="" exerted="" no="" significant="" effect="" on="" the="" high-fat="" diet-induced="" increase="" in="" total="" liver="" lipid.="" interestingly,="" hce="" significantly="" reduced="" such="" a="" diet-induced="" increase="" in="" liver="" lipid=""><0.05). on="" the="" other="" hand,="" simvastatin="" co-treatment="" with="" hce="" exerted="" a="" trend="" to="" reduce="" the="" liver="" lipid="" content="" though="" did="" not="" reach="" statistical="" significance="" (p="0.15)." however,="" when="" comparing="" the="" liver="" lipid="" content="" among="" all="" treatment="" groups,="" no="" significant="" difference="" was="" observed="" among="" all="">

Ako je znázornené na obr. 9b a c, meranie celkového cholesterolu v pečeni (TC) a triglyceridov v pečeni (TG) odhalilo, že myši kŕmené HF mali zvýšené hladiny oboch lipidov v porovnaní s normálnymi myšami kŕmenými potravou (tj 3.{{4} }násobné zvýšenie TC, s<0.001; and="" 3.4-fold="" increase="" in="" tg,=""><0.001). simvastatin="" treatment="" significantly="" reduced="" liver="" total="" cholesterol="" levels=""><0.05) but="" not="" triglyceride="" levels.="" on="" the="" other="" hand,="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" simvastatin="" co-treatment,="" significantly="" reduced="" both="" liver="" total="" cholesterol="" and="" triglyceride="" levels="" in="" high-fat-fed="" mice.="" when="" comparing="" the="" effects="" among="" all="" groups,="" we="" observed="" no="" significant="" difference="" in="" liver="" total="" cholesterol,="" but="" there="" was="" a="" significant="" reduction="" in="" liver="" tg="" for="" the="" hce="" treatment="" group="" as="" compared="" to="" the="" simvastatin="" treatment="" group="" (fig.="" 9b="" and="">

Hodnotenie zápalu pečene. Imunohistochemické farbenie sa uskutočnilo na zafarbenie na prítomnosť makrofágov (Mac-3) (obr. 10a). Imunohistochemická analýza rezov pečene odhalila prítomnosť Mac-3 u myší s vysokým obsahom tuku aj u myší s normálnym kŕmením (hnedé sfarbenie). Tento zápal sa ďalej zvýšil u zvierat liečených simvastatínom, hoci takéto zvýšenie nedosiahlo štatistickú významnosť. Je zaujímavé, že liečba HCE so súbežnou liečbou simvastatínom alebo bez nej významne znížila zápal u myší s vysokým obsahom tuku. Pri porovnaní medzi všetkými liečebnými skupinami mala liečba HCE so súbežnou liečbou simvastatínom alebo bez neho tiež významne nižší zápal v porovnaní so skupinou liečenou simvastatínom (p<0.001 and=""><0.001, respectively).="" these="" data="" are="" also="" presented="" as="" percentage="" areas="" in="" fig.="">

Pokračovať v čítaní ...