ČASŤ 1 A Cistanches Herba Frakcia/𝛽-sitosterol spôsobuje redox-senzitívnu indukciu mitochondriálneho uncouplingu a aktiváciu adenozínmonofosfát-dependentného proteínkinázy/receptora aktivovaného peroxizómovým proliferátorom 𝛾 koaktivátor-1 A Underspositable A MyotuMechanizmus C2C1 Redukčný efekt

Hoi Shan Wong, Jihang Chen, Pou Kuan Leong, Hoi Yan Leung, Wing Man Chan a Kam Ming Ko

Division of Life Science, Hong Kong University of Science and Technology, Kowloon, Hong Kong

Correspondence should be addressed to Kam Ming Ko; bcrko@ust.hk

Prijaté 29. augusta 2014; Prijaté 14. januára 2015 Akademický redaktor: Man Li Copyright © 2015

Hoi Shan Wong et al. Toto je článok s otvoreným prístupom distribuovaný pod licenciou Creative Commons Attribution License, ktorá umožňuje neobmedzené používanie, distribúciu a reprodukciu na akomkoľvek médiu za predpokladu, že pôvodné dielo je správne citované. Predchádzajúce štúdie ukázali, že HCF1, polopurifikovaná frakciaCistanches Herba, spôsobuje zníženie hmotnosti u myší kŕmených normálnou stravou a vysokým obsahom tukov. Zníženie hmotnosti bolo spojené s indukciou mitochondriálneho odpájania a zmenami v metabolických enzýmových aktivitách v kostrovom svale myší. Na ďalšie skúmanie biochemického mechanizmu, ktorý je základom redukcie hmotnosti vyvolanej HCF{2}}, sa skúmal účinok HCF1 a jeho aktívnej zložky, 𝛽-sitosterolu (BSS), na myotrubice C2C12. Inkubácia s HCF1/BSS spôsobila prechodné zvýšenie mitochondriálneho membránového potenciálu (MMP), pravdepodobne fluidizáciou mitochondriálnej vnútornej membrány. Zvýšenie MMP bolo paralelné so zvýšením produkcie mitochondriálnych reaktívnych foriem kyslíka (ROS). Mitochondriálne ROS zase spustili redoxne citlivú indukciu mitochondriálneho uncouplingu uncouplingom proteínu 3 (UCP3). Biochemická analýza ukázala, že HCF1 bol schopný aktivovať dráhu receptora 𝛾 koaktivátora-1 závislú od adenozínmonofosfátu/proliferátorom peroxizómu, a tým zvýšiť expresiu cytochróm c oxidázy a UCP3. Štúdie na zvieratách s použitím mitochondriálneho spojovacieho prvku tiež potvrdili úlohu mitochondriálneho odpájania pri redukcii hmotnosti1-indukovanej HCF. Záverom možno povedať, že HCF1/BSS spôsobuje redoxne citlivú indukciu mitochondriálneho odpájania a aktivácie AMPK/PGC-1 v myotrubičkách C2C12 s výsledným znížením telesnej hmotnosti a adipozity zvýšenou spotrebou energie.

Pre viac informácií kontaktujte:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola má mnoho účinkov, kliknite sem a dozviete sa viac

1. Úvod

Obezita, ktorá je definovaná ako abnormálne hromadenie telesného tuku, sa ukázala ako hrozba pre verejné zdravie. Bez ohľadu na metabolicky zdravé alebo metabolicky narušené stavy sa zistilo, že obezita je spojená so zvýšeným rizikom komorbidít a mortality [1]. Centrálna obezita, abnormality v profiloch cholesterolu a zvýšenie hladín triglyceridov v plazme, čo sú všetky bežné znaky obéznych jedincov, prispievajú k vysokému výskytu cukrovky 2. typu, kardiovaskulárnych ochorení, nekardiovaskulárnych úmrtí a rakovín súvisiacich s obezitou u obéznych jedincov. 2]. Preto sa redukcia telesnej hmotnosti a adipozity považuje za kľúč k prevencii zdravotných následkov súvisiacich s obezitou. Manažment obezity kladie dôraz predovšetkým na vytvorenie optimálnej energetickej bilancie zvýšením energetického výdaja a/alebo znížením energetického príjmu. Úpravy životného štýlu, vrátane zvýšenia fyzickej aktivity a rozvoja zdravých stravovacích návykov, sa vo všeobecnosti považujú za bezpečné prístupy na vyvolanie chudnutia. Takéto prístupy sa však vo všeobecnosti ukázali ako neefektívne Hindawi Publishing Corporation Doplnková a alternatívna medicína založená na dôkazoch, zväzok 2015, ID článku 142059, 12 strán http://dx.doi.org/10.1155/2015/1420592 Doplnkové a založené na dôkazoch Alternatívna medicína na zvýšenie energetického výdaja alebo zníženie energetického príjmu [3]. Preto sa v súčasnosti aktívne skúmajú stratégie založené na použití farmakologických látok. V tejto súvislosti naše predchádzajúce zistenie preukázalo, že HCF1, polopurifikovaná frakciaCistanchesHerba(sušená celá rastlinaCistanche deserticolaYC Ma charakterizovaný ako tonizujúca bylina „povzbudzujúca jang“ v tradičnej čínskej medicíne) sa ukázal ako účinný pri prevencii obezity vyvolanej diétou a s ňou spojených metabolických abnormalít [4]. Perorálne podanie HCF1 spôsobilo zníženie hmotnosti u myší kŕmených normálnou diétou (ND-) a vysokotučnou diétou (HFD-), pravdepodobne indukciou mitochondriálneho odpojenia v kostrovom svale, s výsledným zvýšením energetického výdaja [4 ]. Mechanizmus, ktorý je základom takéhoto mitochondriálneho odpájania{10}}indukovaného HCF (a tým aj redukcie hmotnosti), však zostáva nejasný. Mitochondriálne odpojenie rozptýli protónové gradienty zavedením alternatívnej dráhy protónovej vodivosti cez vnútornú mitochondriálnu membránu (IMM), s výsledným znížením mitochondriálneho membránového potenciálu a mitochondriálnej tvorby ATP. Tento márny cyklus transportu protónov spotrebováva vysoký podiel metabolickej energie v rôznych tkanivách a je zodpovedný za značnú časť denného energetického výdaja s následným zvýšením spotreby molekúl paliva (ako sú mastné kyseliny), čo spôsobuje stratu hmotnosti a zníženie adipozity [5, 6]. Na potvrdenie mitochondriálneho odpájacieho účinku produkovaného HCF1 sa skúmali účinky HCF1 na expresiu MMP a UCP3 v myotrubiciach C2C12, čo sú diferencované svalové bunky odvodené zo stehenného svalu myší C3H. Naším cieľom bolo preskúmať biochemický mechanizmus, ktorý je základom redukcie hmotnosti, ktorú poskytuje HCF1. Na porovnanie sa skúmal aj 𝛽-sitosterol (BSS), aktívna zložka HCF1. Možné zapojenie mitochondriálneho uncouplingu v HCF1-indukovanej redukcii hmotnosti u obéznych myší kŕmených HFD sa ďalej skúmalo spoločným podávaním HCF1 s chemickým väzbovým činidlom, 6-ketocholestanolom (kCh). Adenozínmonofosfát-dependentná proteínkináza (AMPK), všadeprítomne exprimovaná serín/treonín-proteínkináza, predstavuje dôležitý uzol na kontrolu bunkového energetického metabolizmu. Po aktivácii AMPK integruje intra/extracelulárne signály a vyvoláva bunkové odpovede prostredníctvom rôznych bunkových signálnych kaskád [7, 8]. AMPK je schopný modulovať bunkový metabolizmus reguláciou metabolických enzýmových aktivít priamou fosforyláciou. AMPK tiež vytvára dlhodobé účinky na transkripčnej úrovni prostredníctvom fosforylácie peroxizómového proliferátora aktivovaného receptora 𝛾koaktivátora-1 (PGC-1), čo vedie k adaptívnym zmenám v génovej expresii súvisiacej s energetickým metabolizmom a mitochondriálnou funkciou [9, 10]. V tomto ohľade sme tiež skúmali účinok HCF1 / BSS na signálnu dráhu AMPK / PGC-1 v myotrubiciach C2C12.

cistanchevýhody deserticoly

2. Materiály a metódy

2.1. Bylinná extrakcia.

Cistanches Herba, sušená celá rastlinaCistanche deserticolaYC Ma (Orobanchaceae), bol zakúpený od miestneho predajcu byliniek (Lee Hoong Kee). Bylina bola overená dodávateľom a exemplár poukážky (HKUST00301) bol uložený v divízii Life Science, Hong Kong University of Science and Technology (HKUST). ACistanchesBylinný extrakt sa získal etanolovou extrakciou rozomletého rastlinného materiálu zahrievaním pod spätným chladičom pri teplote 78 °C počas 2 hodín, ako už bolo opísané [11], s výťažkom 14 % (hmotn./hmotn.). Extrakt sa ďalej frakcionoval pomocou chromatografie na silikagéli [12]. HCF1 sa získal vo výťažku 1,14 % (hmotn./hmotn.). Extrakt sa vysušil odparením rozpúšťadla za zníženého tlaku pri 50 °C a vysušený extrakt sa pred použitím skladoval pri -20 °C.

2.2. Chemikálie.

Anti-𝛽-aktínová protilátka, BSS (CAS 83-46- 5), koktail inhibítora proteázy a kokteil inhibítora fosfatázy 3 boli zakúpené od Sigma (St Louis, MO). Protilátka anti-AMPK𝛼1/2, protilátka anti-p-AMPK𝛼1/2, protilátka anti PGC-1 (H-300), protilátka anti-UCP3 (E-18), {{16} }[4- (2-piperidín-1-yl-etoxy)-fenyl)]-3-pyridín-4-yl-pyrazolo[1,5-a ]-pyrimidín (CC) a 6-ketocholestanol (kCh) boli zakúpené od Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Anti-COX protilátka bola zakúpená od Cell Signaling (Danvers, MA). Anti-lamin B1 protilátka bola zakúpená od Abcam (Cambridge, MA). Testovacie činidlo Bio-Rad bolo zakúpené od Bio-Rad Laboratories (Richmond, CA, USA). Všetky ostatné chemikálie boli zakúpené od Sigma (St. Louis, MO, USA).

2.3. Bunková kultúra.

C2C12, kultúru myoblastov z kostrového svalstva myši odvodenú od C3H [13] z American Type Culture Collection (ATCC), láskavo poskytol profesor Zhenguo Wu (Division of Life Science, HKUST). Bunková línia bola kultivovaná v Dulbeccovom modifikovanom Eaglovom médiu (DMEM) (Gibco BRL Life Technologies, Grand Island, NY), doplnenom 10 percentami (obj./obj.) fetálnym bovinným sérom (FBS), 100 IU/ml penicilínu a 100 µg /ml streptomycínu a 17 mM NaHC03. Diferenciácia myoblastov C2C12 na myotrubice C2C12 bola indukovaná nahradením kompletného kultivačného média diferenciačným médiom obsahujúcim 2 percentá (v/v) konského séra (HS) namiesto 10 percent (v/v) FBS. Bunky rástli v atmosfére 5 percent (objem/objem) CO2 vo vzduchu pri 37 °C.

Cistanchemáefekt chudnutia

2.4. Biochemické analýzy v C2C12 Myotubes

2.4.1. MMP.

Potenciál mitochondriálnej membrány sa meral pomocou fluorescenčného katiónového farbiva, 5,5,6,6 -tetrachlór- 1,1,3,3 -tetraetylbenzimidazolyl-karbokyanínjodidu (JC- 1) [14]. Bunky sa kultivovali pri hustote 1.0 × 104 bunky v 96-jamkových mikrotitračných platniach. Po stabilnom prichytení boli bunky vopred zafarbené 20 µM JC-1 (rozpustené v kultivačnom médiu) pri 37 °C počas 10 minút. Po predbežnom farbení sa bunky dvakrát premyli Hankovým vyváženým soľným roztokom (HBSS), doplneným 0,1 percenta bovinného sérového albumínu (BSA). Meranie MMP sa začalo pridaním média obsahujúceho HCF1/BSS. Množstvo J-agregátu JC-1 molekúl, ktoré sa tvorí vo vnútornej membráne mitochondrií s vysokým membránovým potenciálom, bolo stanovené monitorovaním JC-1 červenej fluorescencie (Ex 485 nm/Em 580 nm) Dôkaz -Na základe doplnkovej a alternatívnej medicíny 3 pri 37 °C počas 1 hodiny. MMP sa odhadla odčítaním intenzít fluorescencie slepých vzoriek (tj obsahujúcich iba médium) od intenzít fluorescencie testovaných vzoriek. Hodnoty MMP buniek inkubovaných s HCF1/BSS sa normalizovali s príslušnými kontrolnými hodnotami neinkubovanými s HCF1/BSS a vyjadrili sa ako percentuálna kontrola.

2.4.2. Aktivácia adenozínmonofosfát-dependentnej proteínkinázy (AMPK).

Myotrubičky C2C12 sa naočkovali (1,5 x 105 buniek) do 6-jamkových mikrotitračných platní. Po stabilnom pripojení sa bunky predinkubovali s médiom obsahujúcim HCF1/BSS počas 8 hodín. Predinkubované bunky sa potom lýzovali s 300 µl lyzačného pufra dodecylsulfátu sodného (SDS-) (20 mM Tris-Cl, 2 mM kyselina etyléndiamíntetraoctová (EDTA), 3 mM kyselina etylénglykoltetraoctová (EGTA), 1 percento (w/ v) Triton X- 100, 10 percent (w/v) glycerol, 5 percent SDS, 1 mM ditiotreitol (DTT), koktail inhibítorov proteázy a kokteil inhibítorov fosfatázy 3, pH 7,5). Lyzát sa ďalej centrifugoval pri 12 000 x g pri 4 °C počas 10 minút, aby sa odstránili bunkové zvyšky. Rozsah aktivácie AMPK bol hodnotený z relatívneho pomeru fosfor-AMPK𝛼 (p-AMPK) a AMPK𝛼 analýzou Western blot s použitím anti-p-AMPK𝛼1/2 protilátky a anti-AMPK𝛼1/2 protilátky po analýze SDS-PAGE, s separačný gél 10 % (v/v) akrylamidu. Naniesol sa bunkový lyzát (20 µg) a ako referenčný marker sa použil Δ-aktín. Imunitne zafarbené proteínové pásy sa analyzovali denzitometriou (Quantiscan, Biosoft) a množstvá (ľubovoľné jednotky) p-AMPK𝛼 a AMPK𝛼 sa normalizovali vzhľadom na hladinu -aktínu (ľubovoľné jednotky) vo vzorke.

2.4.3. PGC-1 jadrová translokácia.

Myotrubičky C2C12 sa kultivovali pri hustote 2.0×106 buniek v 100 mm kultivačných platniach. Po 8 hodinách predinkubácie HCF1/BSS boli bunky trypsinizované a inkubované s 1 ml ľadovo chladného hypotonického pufra (10 mM HEPES, 1,5 mM KCI a 1,5 mM MgCl2, pH 7,9) pri 4 °C počas 10 minút. Po inkubácii sa bunky zhromaždili centrifugáciou pri 500 x g pri 4 °C počas 10 minút. Zozbierané bunky boli resuspendované v 300 𝜇L hypotonického pufra, doplneného 0,5 mM DTT, 0,1 percenta (w/v) nonylfenoxy-polyetoxyletanolu (NP-40) a kokteilu inhibítora proteázy, aby sa uľahčila extrakcia rozpustných cytosolických proteínov . Výsledný lyzát sa centrifugoval pri 12 000 x g pri 4 °C počas 1 minúty, čím sa získali cytosolické (supernatant) a jadrové (pelety) frakcie. Izolácia jadrových proteínov sa dosiahla inkubáciou pelety s 25 1 ľadovo studeným hypertonickým pufrom (20 mM HEPES, 25 percent (w/v) glycerol, 400 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, 0,2 mM DTT5 koktail inhibítora proteázy, pH 7,9) pri 4 °C počas 30 minút, po čom nasledovala centrifugácia pri 12 000 x g pri 4 °C počas 5 minút. Rozsah jadrovej translokácie PGC-1 sa odhadol z relatívneho pomeru hladiny PGC-1 v cytosolických a jadrových frakciách pomocou analýzy Western blot po analýze SDS-PAGE, ako je opísané vyššie. Boli nanesené cytozolové aj jadrové frakcie (20 µg), pričom ako cytosolické a jadrové referenčné markery sa použili Ν-aktín a lamin B1. Množstvá (ľubovoľné jednotky) PGC-1 boli normalizované s odkazom na hladiny -aktínu a lamin B1 (ľubovoľné jednotky) vo vzorke.

2.4.4. Expresia mitochondriálneho odpájacieho proteínu 3 (UCP3) a cytochróm c oxidázy (COX).

Myotrubičky C2C12 boli nasadené (2 0 x 106 buniek) na 100 mm kultivačné platne. Po stabilnom pripojení sa bunky predinkubovali s médiom obsahujúcim HCF1/BSS pri 37 °C počas 48 hodín. Po odstránení média obsahujúceho HCF1/BSS boli bunky trypsinizované a lyzované pridaním 300 ml SDS-lyzačného pufra. Bunkový lyzát sa centrifugoval pri 12 000 x g pri 4 °C počas 10 minút, aby sa odstránili zvyšky buniek. Hladiny UCP3 a COX v supernatante boli stanovené analýzou Western blot s použitím anti-UCP3 (E- 18) protilátky a anti-COX protilátky po analýze SDS-PAGE, ako je opísané vyššie. Naniesol sa bunkový lyzát (50 µg) a ako referenčný marker sa použil Ν-aktín. Množstvá (ľubovoľné jednotky) UCP3 a COX boli normalizované s odkazom na hladinu 2-aktínu (ľubovoľné jednotky) vo vzorke.

2.5. Starostlivosť o zvieratá.

ICR myši (8 týždňov; 30 až 35 g pre samce a 25 až 30 g pre samice) boli chované v 12-hodinovom cykle tma/svetlo v prostredí s kontrolovaným vzduchom/vlhkosťou pri teplote asi 22 °C a potrava a voda boli povolené podľa potreby. v zariadeniach starostlivosti o zvieratá a rastliny (APCF) na Hongkongskej univerzite vedy a techniky (HKUST). Všetky experimentálne postupy boli schválené Výborom pre výskumnú prax (HKUST) (číslo schválenia protokolu pre zvieratá 2013049; dátum schválenia: 25. septembra 2013; trvanie experimentu: 3 roky).

2.6. Protokol liečby.

Na preskúmanie účinku 6-keto-cholestanolu (kCh) na HCF1-indukovanú redukciu hmotnosti u myší kŕmených HFD boli zvieratá náhodne rozdelené do 6 skupín, v každej bolo 10–15 myší: (1 ) normálna strava (ND, 13 percent energie získaná z tuku, zakúpené od LabDiet, číslo produktu 5010) kontrola; (2) ND plus kCh (v dennej dávke 9 mg/kg); (3) HFD (60 percent energie získanej z tuku; zakúpené od Research Diet Inc., číslo produktu D12492) kontrola; (4) HFD plus HCF1 (v dennej dávke 45 mg/kg); (5) HFD plus kCh; a (6) HFD plus HCF1 plus kCh. Ukázalo sa, že HCF1 v dennej dávke 45 mg/kg spôsobuje významné zníženie hmotnosti u samcov myší [4], zatiaľ čo kCh pri dennej dávke 9 mg/kg ruší HCF1- indukovaný odpájací účinok v mitochondriách izolovaných z myšacieho kostrového svalstva (údaje nie sú uvedené). Zvieratám sa intragastricky podával kCh, HCF1 alebo HCF1/kCh, 5 dní v týždni, počas 8 týždňov (tj celkovo 40 dávok). Kontrolné myši dostali len vehikulum (olivový olej). Telesná hmotnosť a spotreba potravy myší sa monitorovali týždenne počas priebehu experimentu. Zmeny telesnej hmotnosti sa kvantifikovali výpočtom plochy pod krivkou (AUC) z grafu zobrazujúceho percento počiatočnej telesnej hmotnosti proti času (týždeň 1 až 8) a vyjadrili sa v ľubovoľných jednotkách. Myši boli usmrtené cervikálnou dislokáciou 24 hodín po poslednej dávke (s kCh, HCF1 alebo HCF1/kCh) po celonočnom hladovaní. Vzorky lýtkového svalu boli vyrezané na meranie mitochondriálneho dýchania. Tukové vankúšiky (gonadálny, retroperitoneálny a mezenterický tuk) sa vypreparovali a odvážili. Odhadol sa pomer hmotnosti konkrétneho tukového vankúša k telesnej hmotnosti a vyjadril sa ako "index tukového vankúša".

Cistancheje prírodná bylina s účinkom na chudnutie

2.7. Biochemické analýzy na myšiach

2.7.1. Vzorové prípravky.

Mleté svalové tkanivá gastrocnemius sa zmiešali s 1 0 ml roztoku kolagenázy (0,075 percent (w/v)) v pufri (100 mM KCl, 50 mM MOPS, pH 7,2) a zmesi sa inkubované pri 4 °C počas 20 minút. Zmesi štiepeného tkaniva sa centrifugovali pri 600 x g pri 4 °C počas 20 minút. Supernatant sa odstránil; natrávené tkanivá sa zmiešali s 20 ml ľadovo studeného homogenizačného pufra (50 mM sacharóza, 200 mM manitol, 5 mM KH2P04, 1 mM EGTA a 5 mM MOPS, pH 7,2) a homogenizovali sa na ľade s homogenizátorom z teflónového skla pri 4000 otáčkach za minútu na 25 až 30 úplných zdvihov. Homogenáty sa potom centrifugovali pri 600 x g pri 4 °C počas 10 minút, čím sa získala frakcia bez jadra (supernatant). Mitochondriálne pelety sa pripravili zo svalových homogenátov centrifugáciou pri 9200 x g pri 4 °C počas 30 minút. Mitochondriálne frakcie sa získali suspendovaním peliet v pufri obsahujúcom 125 mM KCI, 10 mM Tris-Bázy, 2 mM KH2P04, 0,5 mM EGTA a 20 mM MOPS, pH 7,5 [15].

2.7.2. Mitochondriálne dýchanie.

Rýchlosti dýchania v mitochondriách izolovaných z myšacieho kostrového svalstva boli stanovené tak, ako opísali Wong a Ko [12]. Stručne povedané, mitochondriálne dýchanie sa meralo polarograficky pomocou elektródy Clarkovho typu (Hansatech Instruments, Norfolk) pri 30 C. Mitochondriálne frakcie (1 mg proteínu/ml) sa inkubovali v dýchacom pufri (3{17} } mM KCI, 6 mM MgCl2, 75 mM sacharózy, 1 mM EDTA a 20 mM KH2P04, pH 7,0). Pridal sa roztok substrátu obsahujúci 15 mM pyruvát sodný a 5 mM malát sodný. Po ekvilibrácii sa dýchanie v stave 3 iniciovalo pridaním ADP (konečná koncentrácia 0,6 mM). Keď sa všetok pridaný ADP spotreboval na tvorbu ATP, pridal sa oligomycín, aby sa vyvolalo dýchanie v 4. stave. Pomer respiračnej kontroly (RCR) sa odhadol výpočtom pomeru frekvencií dýchania v 3. a 4. stave [16].

2.7.3. Mitochondriálna expresia UCP3 v kostrovom svale myši.

Mitochondriálne hladiny UCP3 sa odhadli analýzou Western blot s použitím anti-UCP3 (E-18) protilátky po analýze mitochondriálnej frakcie SDS PAGE pomocou separačného gélu 10 percent akrylamidu. Mitochondriálne frakcie izolované z myšacieho kostrového svalu (~60 𝜇g) boli aplikované na gél a cytochróm c oxidáza (COX) bola použitá ako referenčný marker. Imunozafarbené proteínové pásy sa analyzovali denzitometriou a množstvá (ľubovoľné jednotky) UCP3 sa normalizovali vzhľadom na hladinu COX (ľubovoľné jednotky) vo vzorke.

2.8. Proteínový test.

Koncentrácie proteínov boli stanovené pomocou súpravy na testovanie proteínov Bio-Rad. Alikvot (10 µl) vzorky mitochondriálneho/bunkového lyzátu sa zriedil 40 µl vody. Alikvotná časť (10 µl) zriedenej vzorky sa potom pridala do jamky 96-jamkovej mikrotitračnej doštičky, po čom nasledovalo pridanie 200 µl zriedeného testovacieho činidla Bio-Rad (5-násobné riedenie). Zmes sa nechala stáť pri teplote miestnosti 5 minút a potom sa merala absorbancia reakčnej zmesi pri 570 nm. Koncentrácia proteínu bola stanovená z kalibračnej krivky s použitím hovädzieho sérového albumínu (BSA) ako štandardu.

2.9. Štatistická analýza.

Všetky údaje boli vyjadrené ako priemer ± štandardná chyba priemeru (SEM), pokiaľ nie je uvedené inak. Údaje sa analyzovali jednosmernou analýzou rozptylu (jednosmerná ANOVA), pokiaľ nie je uvedené inak, a rozdiely medzi skupinami sa zistili pomocou Tukeyovho testu rozsahu s 𝑃<>

Cistanchedeserticola máveľa efektov

3. Výsledky

3.1. Účinky HCF1/BSS na MMP v C2C12 Myotubes.

Inkubácia chemického odpájača, karbonylkyanid {{0}} (trifluórmetoxy)fenylhydrazón (FCCP), v koncentrácii 1 𝜇M, spôsobila časovo závislé zníženie MMP, pričom rozsah zníženia bol 29 percent pri koniec merania (obrázky 1 a 2). Na rozdiel od toho, HCF1 a BSS v koncentráciách 30 ng/ml a 10 µM zvýšili MMP o 5 a 4 percentá počas prvých 10 minút inkubácie HCF1/BSS (obrázky 1 a 2) . Po počiatočnom zvýšení vyvolanom HCF1/BSS nasledovalo postupné znižovanie MMP na 95 a 93 percent príslušnej počiatočnej hodnoty na konci merania (60 minút inkubácie HCF1/BSS) (obrázky 1 a 2). Zmeny v MMP vyvolané HCF1/BSS boli charakterizované použitím špecifických inhibítorov. Rotenón (0,1 nM), inhibítor mitochondriálneho komplexu I, a cholesterol (0,3 𝜇M), zosilňovač tuhosti membrány, potláčali zmeny MMP vyvolané HCF1/BSS v priebehu merania (obrázky 1 a 2). Na druhej strane, spoločná inkubácia so špecifickým inhibítorom UCP, GDP, chemickým väzbovým činidlom, 6-ketocholestanolom (kCh) alebo antioxidantom, dimetyltiomočovinou (DMTU), znížila HCF1-indukované zníženie MMP v neskoršom čase inkubácie HCF1 (obrázok 1). GDP, kCh a DMTU tiež znížili BSS-indukované zníženie MMP v neskoršom čase inkubácie BSS, pričom hodnota MMP bola 110 percent v porovnaní s príslušnou časovou kontrolou (obrázok 2)

3.2. Účinok HCF1/BSS na aktiváciu AMPK v C2C12 Myotubes.

Účinok HCF1 na AMPK sa skúmal meraním pomeru fosforylovaného AMPK𝛼 (p-AMPK𝛼) k celkovému AMPK𝛼 (AMPK𝛼), čo indikuje rozsah aktivácie AMPK. Inkubácia s HCF1 v koncentráciách 30 a 100 ng/ml vyvolala časovo závislé zvýšenie aktivácie AMPK, pričom rozsah týchto zvýšení bol 32 a 43 percent po 8 hodinách inkubácie HCF1 v porovnaní s príslušným časom- zhodná kontrola (obrázok 3). Paralelne s HCF1 predinkubácia s BSS (10 M) významne zvýšila rozsah aktivácie AMPK o 25 percent v porovnaní s nepredinkubovanou kontrolou (obrázok 5). Aktivácia AMPK indukovaná HCF1/BSS v myotrubiciach C2C12 bola úplne zrušená koinkubáciou buď s kCh (oddeľovač) alebo DMTU (obrázky 4 a 5, tabuľky 1 a 2 doplnkového materiálu dostupného online

3.3. Účinok HCF1/BSS na jadrovú translokáciu PGC-1 v myotrubiciach C2C12.

Aktiváciu PGC-1 možno nepriamo merať rozsahom jadrovej translokácie PGC-1. Predinkubácia s HCF1 a BSS významne zvýšila PGC-1 jadrovú translokáciu o 25 a 28 percent, čo dokazujú zvýšené pomery PGC-1 v jadre k cytoplazme (obrázky 6 a 7). Špecifický inhibítor AMPK, 6-[4-(2-piperidín-1-yl-etoxy)-fenyl)]-3-pyridín-4-ylpyrazolo[ 1,5-a]-pyrimidín (CC) v koncentrácii 10 𝜇M inhiboval HCF1/BSS-indukované zvýšenie jadrovej translokácie PGC-1 o 156 a 235 percent v myotrubiciach C2C12 ( Tabuľky 1 a 2). HCF1/BSS-indukovanej jadrovej translokácii PGC-1 sa tiež zabránilo koinkubáciou buď s kCh alebo DMTU (obrázky 6 a 7, tabuľky 1 a 2 doplnkového materiálu).

3.4. Účinok HCF1/BSS na mitochondriálnu expresiu UCP3 a cytochróm c oxidázy (COX) v myotrubiciach C2C12.

Na určenie významnosti aktivácie indukovanej HCF1/BSS v dráhe AMPK/PGC-1 sa zhodnotili účinky HCF1/BSS na mitochondriálne odpojenie a biogenézu, ako sa hodnotili hladinami UCP3 a COX (spoľahlivý indikátor mitochondriálnej hmoty v bunkách), resp. Predinkubácia s HCF1/BSS významne zvýšila mitochondriálne hladiny UCP3 a COX, pričom rozsah týchto zvýšení bol 37 a 23 percent (v myotrubičkách inkubovaných HCF) (obrázok 8) a 52 a 24 percent (v myotrubičkách inkubovaných BSS ) (obrázok 9), v tomto poradí, v porovnaní s príslušnou nepredinkubovanou kontrolou. Zvýšeniu hladín UCP3 a COX vyvolanému HCF1/BSS sa úplne zabránilo koinkubáciou HCF1 s kCh, DMTU alebo

CC (tabuľky 1 a 2 doplnkového materiálu). Treba poznamenať, že koncentrácie kCh a CC použité v tomto experimente boli upravené na 20 a 1 µM, v danom poradí, aby sa predišlo cytotoxickým účinkom kCh a CC na myotrubice C2C12 (nepublikované pozorovanie).

3.5. Úloha mitochondriálneho odpojenia pri HCF1-indukovanej redukcii hmotnosti u obéznych myší vyvolaných HFD.

Možná úloha mitochondriálneho odpájania pri redukcii hmotnosti1-indukovanej HCF sa ďalej skúmala použitím chemického spojovacieho prvku kCh (tabuľka 3 doplnkového materiálu). HCF1 indukoval mitochondriálne odpojenie v myšom kostrovom svale, čo dokazuje zníženie mitochondriálneho pomeru respiračnej kontroly (RCR) a zvýšenie mitochondriálnej expresie UCP3 u myší kŕmených ND aj HFD. kCh per se (pri dennej dávke 9 mg/kg) významne zvýšilo mitochondriálne RCR o 23 percent u myší kŕmených ND (ale nie u myší kŕmených HFD). HCF1-indukované mitochondriálne odpojenie u myší kŕmených HFD bolo úplne inhibované spoločnou liečbou kCh. HCF1 spôsobil zníženie hmotnosti u myší kŕmených ND aj HFD. Tento účinok bol spojený s potlačením HFD-indukovaného zvýšenia indexu viscerálneho tuku. Na rozdiel od HCF1 nemala kCh počas 8-týždňového priebehu experimentu žiadny zistiteľný účinok na prírastok hmotnosti u zvierat s ND a HFD. Spoločné podávanie kCh s HCF1 zrušilo HCF{18}}indukované supresívne účinky na zvýšenie telesnej hmotnosti a indexu viscerálneho tuku u myší vyvolané HFD (tabuľka 3 doplnkového materiálu).