Časť 1: Účinky izohamnetínu na diabetes a jeho pridružené komplikácie: Prehľad štúdií in vitro a in vivo a post hoc transkriptómová analýza zapojenej molekulárnej dráhy

Pre viac info. kontakttina.xiang@wecistanche.com

Abstraktné: Diabetesmellitus, najmä typu 2 (T2DM), je celosvetovo hlavným problémom verejného zdravia. DM sa vyznačuje vysokými hladinami glykémie a inzulinémie v dôsledku narušenej sekrécie inzulínu a inzulínovej citlivosti buniek, známej ako inzulínová rezistencia. T2DM spôsobuje mnohopočetné a závažné komplikácie, ako je nefropatia, neuropatia a retinopatia spôsobujúce oxidačné poškodenie buniek v rôznych vnútorných tkanivách, najmä pankrease, srdci, tukovom tkanive, pečeni a obličkách. Rastlinné extrakty a ich bioaktívne fytochemikálie získavajú záujem ako nové terapeutické a preventívne alternatívy pre T2DM a s ním spojené komplikácie. V tomto ohľade izohamnetín, rastlinaflavonoid, bol dlho skúmaný pre svoje potenciálne antidiabetické účinky. Tento prehľad opisuje jeho vplyv na znižovanie porúch súvisiacich s cukrovkou znížením hladín glukózy, zlepšením oxidačného stavu, zmiernením zápalu a moduláciou metabolizmu lipidov a diferenciácie adipocytov reguláciou zahrnutých signálnych dráh uvádzaných v štúdiách in vitro a in vivo. Okrem toho zahŕňame post hoc celogenómovú transkriptómovú analýzu biologických aktivít izohamnetínu pomocou nástroja založeného na kmeňových bunkách.

Kľúčové slováizohamnetín; kvercetín; biologické aktivity; cukrovka; molekulárne dráhy; microarray

Kliknutím sem získate ďalšie kontakty

1. Úvod

Rastliny sa ako tradičné lieky používajú takmer na všetkých kontinentoch sveta už od staroveku. Vedecký výskum dôvodov ich medicínskeho použitia viedol k skúmaniu bioaktívnych molekúl. Extremofilné rastliny, ktoré rastú v extrémnych podmienkach prostredia, sa považujú za dobrý potenciálny zdroj bioaktívnych molekúl záujmu. V skutočnosti sú tieto environmentálne obmedzenia pôvodom dysfunkčného metabolizmu kyslíka, ktorý vedie k oxidačnému stresu zvýšením reaktívnych foriem kyslíka (ROS)[1,2]. Niektoré rastliny, ako sú halofyty, majú mocnéantioxidantsystém na odstránenie týchto škodlivých zlúčenín. Medzi zaujímavé bioaktívne molekuly patria fenolové zlúčeniny. Niekoľko štúdií ocenilo rastliny bohaté na polyfenoly s reštriktívnymi podmienkami alebo bez nich v laboratóriu [3-10]. Extraktom bohatým na polyfenoly sa pripisuje niekoľko biologických účinkov, ako sú protizápalové a protirakovinové účinky [11-13]. Ďalšie štúdie preukázali antioxidačné, antimikrobiálne [8,{4}}], ako aj antiobezitné, antidiabetické a antihepatické steatotické [17-19] účinky izohamnetínu. Medzi týmito polyfenolmi,flavonoidysa rozlišujú. Táto skupina zahŕňa niekoľko podskupín, ako sú flavonoly. Izorhamnetín je jednou z hlavných zlúčenín flavonolov. Izorhamnetín je monometoxyflavón alebo O-metylovaný flavonol z triedy flavonoidov. to jekvercetínv ktorom metoxy skupina nahrádza hydroxy skupinu v polohe 3'. Niektoré deriváty izohamnetínu sú prítomné v prírode, ako napríklad izohamnetín 3-O- -d-glukopyranozid, izohamnetín 3--neohesperidozid a izohamnetín 3--rutinozid z Calendula officinalis L [20]. Izorhamnetín má významné biologické vlastnosti, ako sú antioxidačné [21], protirakovinové [22], antimikrobiálne [23], antivírusové [24], protizápalové a antidiabetické účinky [21,25-33].

V tomto prehľade sa prvý dôraz kladie na pôvod, chemickú štruktúru, metódy izolácie a extrakcie, ako aj na fytochemický aspekt izohamnetínu. Potom sa v druhej časti zameriavame na popis potenciálnych antidiabetických účinkov tohto flavonolu prostredníctvom znižovania porúch súvisiacich s diabetom znížením hladín glukózy, zlepšením oxidačného stavu, zmiernením zápalu a moduláciou metabolizmu lipidov a diferenciácie adipocytov. Nakoniec sme vykonali sekundárnu analýzu našich predtým publikovaných údajov mikročipu s celým genómom, aby sme preskúmali biologické aktivity izohamnetínu súvisiace s cukrovkou v nástroji založenom na kmeňových bunkách. Naším cieľom je tiež zdôrazniť účinok tejto molekuly na reguláciu zahrnutých signálnych dráh hlásením štúdií in vitro a in vivo používaných v tejto oblasti výskumu. V tomto prehľade sme odhalili charakteristiky antidiabetickej aktivity izohamnetínu v porovnaní skvercetínktorý sa považuje za metabolit izohamnetínu a dôležitý odkaz v prírodnej liečbe cukrovky.

2. Všeobecný prehľad bioaktívnych molekúl v konkrétnych polyfenoloch a flavonoidoch

2.1. Oxidačný stres ako pôvod bioaktívnych molekúl v rastlinách

Niektoré rastliny môžu byť vystavené rôznym podmienkam prostredia (slanosť, sucho, UV žiarenie, ťažké kovy, extrémne teploty, nedostatok živín, znečistenie ovzdušia a napadnutie patogénmi). Tieto obmedzenia sú pôvodom dysfunkcií metabolizmu kyslíka, ktoré generujú oxidačný stres zvýšením reaktívnych foriem kyslíka (ROS). Molekula kyslíka (O2) hrá dôležitú úlohu vo fotosyntetických organizmoch. Pôvodne vo vyšších rastlinách a riasach dochádza k výmene plynov zahŕňajúcej elektróny v chloroplastoch zachytávaním oxidu uhličitého počas dňa a produkciou kyslíka. Táto výmena plynu zahŕňa elektróny. V prípade vážnych environmentálnych obmedzení totiž veľká časť kyslíka nie je redukovaná a môže tak vytvárať ROS v niektorých organelách z rastlinných buniek [1,2] v dôsledku nerovnováhy v správnom fungovaní chloroplastov a prenosu elektrónov [ 1]. Okrem toho sa pri vyššie uvedených environmentálnych obmedzeniach produkuje veľa ROS, ako je hydroxylový radikál (OH), superoxidový aniónový radikál (O,-), alkoxylové a peroxylové radikály (RO: a RO2, v tomto poradí), peroxid vodíka (H202, ), chlórnanový radikál (-OCl), singletový kyslík (O2), radikál oxidu dusnatého (NO) a iné lipidové peroxidy (ako je malondialdehyd a 4-hydroxynonenal)[2,34,35]. Niekedy môže mať ROS úlohu v bunkovej signalizácii vo fyziologickom správaní rastlín, napríklad v procese rastu a vývoja semien, vývoja tkanív a prechodu od bunkovej proliferácie k bunkovej elongácii počas skorších štádií diferenciácie [36]. . Na vysokej úrovni tieto molekuly spôsobujú molekulárne poškodenie, ako je peroxidácia lipidov na membránach, zmena proteínov a DNA a bunková smrť [1,35,37]. Niektoré rastliny, ako sú halofyty, majú schopnosť dobre sa prispôsobiť týmto podmienkam prostredníctvom silného antioxidačného systému. Je známe, že halofyty sú zdrojom sekundárnych metabolitov, ako sú polyfenoly [3-10]. Títo autori ukazujú, že v ťažkých podmienkach sa syntetizujú polyfenoly, ktoré zohrávajú dôležitú úlohu pri ochrane pred stresom vyvolaným oxidačným poškodením. Biosyntéza, obsah a aktivity týchto fenolových zlúčenín sú funkciou niekoľkých vonkajších (svetlo, teplota, slanosť a suchosť) a vnútorných (genotyp, orgán a štádium vývoja) parametrov, ktoré ovplyvňujú ich obsah a distribúciu v rastlinách. 8,38,39]. Napríklad u Pyracantha coccinea sú niektoré flavonoidy ako flavanóny, flavóny a flavonoly prítomné v výhonkoch počas vegetatívnej fázy a v koreňoch výlučne počas reprodukčnej 40]. Na druhej strane viacerí autori ukázali, že tieto fenolové zlúčeniny majú iné biologické vlastnosti, ako sú protizápalové a protirakovinové účinky [11-13]. Ďalšie štúdie preukázali antioxidačné, antimikrobiálne [8,14-16], ako aj antidiabetické [18,41,42] účinky fenolových extraktov.

2.2. Klasifikácia prírodných antioxidantov

Antioxidačný systém možno klasifikovať podľa povahy týchto zložiek na enzymatické alebo neenzymatické zlúčeniny. Medzi prvé patria superoxiddismutáza (SOD), kataláza (CAT), askorbátperoxidáza a glutatiónreduktáza [1,3542-44]. Gény súvisiace s týmito enzýmami odhalili ich dôležitosť počas fyziologického poškodenia zásobného koreňa po zbere a ako odpoveď na osmotický stres a kyselinu abscisovú, ako aj infekciu Xanthomonas axonopodis [44]. Druhá skupina obsahuje najmä fenolové zlúčeniny, karotenoidy, vitamíny a osmolyty [1]. Fenolové zlúčeniny sú charakterizované prítomnosťou jedného alebo viacerých benzénových kruhov a líšia sa zložitosťou základnej molekuly, počtom a umiestnením hydroxylu a stupňom polymerizácie. Tieto zlúčeniny sú sekundárne metabolity, ktoré spadajú do troch širokých skupín: fenolové kyseliny (deriváty kyseliny benzoovej a škoricovej), flavonoidy (flavonoly, flavonoly, flavanóny, flavóny, antokyaníny) a taníny (hydrolyzovateľné taníny a proantokyanidíny). Okrem týchto molekúl sa rozlišujú aj stilbény, lignany a kumaríny [45].

2.3. Pôvod a biochemická štruktúra flavonoidov, najmä izohamnetín

Fenolové zlúčeniny sú sekundárne metabolity prevládajúce v rastlinách. Tieto zlúčeniny majú aromatický kruh s jednou alebo viacerými hydroxylovými skupinami (OH) a obsahujú molekuly od jednoduchých fenolových kyselín až po polymerizované zlúčeniny, ako sú taníny. Syntéza fenolových zlúčenín je zložitý proces, ktorý prechádza niekoľkými fázami. Fenolové zlúčeniny sú bioaktívne molekuly s dvomi dráhami pôvodu: na jednej strane kyselina šikimová a na druhej strane molekuly fenylpropanoidu. Biosyntéza flavonoidov, ako je izohamnetín, je založená na týchto dráhach. V skutočnosti na jednej strane šikimát poskytuje základnú kostru polyfenolov, ktoré majú jeden alebo viac benzénových kruhov (C6) nesúcich jednu alebo viac hydroxylových funkcií. Na druhej strane existuje syntéza C6-C3 bázy vytvorenej kondenzáciou fenylalanínu na kyselinu škoricovú (obrázok 1)[46].

Presnejšie povedané, kyselina šikimová je základom niekoľkých reakcií, ktoré predstavujú kostru aromatických aminokyselín, ktoré sú iniciátormi fenolových zlúčenín. Prvý krok pozostáva z kombinácie dvoch molekúl: fosfoenolpyruvátu a erytrózo 4-fosfátu, ktoré po štyroch reakciách vedú k vytvoreniu prvého skeletu fenolov: šikimátu alebo kyseliny šikimovej (CHOOs). Toto neskôr predstavuje prvý kruh, ktorý charakterizuje fenolové skupiny s dvoma hydroxylovými skupinami. Šikimát prechádza šiestimi reakciami, ktoré končia prvou aminokyselinou: fenylalanínom. Vďaka dvom kľúčovým enzýmom, fenylalanín-ammonia-lyáze (PAL) a cinamát-4-hydroxyláze (C4H), fenylalanín postupne vytvára cinnamát a p-kumarát. V tomto kroku by úroveň aktivity PAL mohla kvantitatívne regulovať akumuláciu fenolové zlúčeniny. Molekula p-kumarátu je pôvodom kumarínových derivátov. Cesta syntézy molekúl fenylpropanoidu je charakterizovaná prítomnosťou kľúčového enzýmu nazývaného 4-kumarát CoA ligáza (4CL), ktorý v prítomnosti tiolovej funkcie koenzýmu A(CoA) katalyzuje p-kumarovú kyseliny na 4-kumaroyl CoA(C30Ha2N-018P, S). Aromatický A-kruh flavonoidov poskytuje z kondenzácie troch molekúl malonyl-CoA (-C6).

Následne 4-kumaroyl CoA produkoval naringenínový chalkón, čo vysvetľuje spojenie medzi aromatickým B-kruhom a 3C kruhom chalkónu (C6-C3-). Chalkón je kľúčovým prvkom v tejto téme, pretože je prekurzorom všetkých flavonoidov na báze pätnásťuhlíkového skeletu pozostávajúceho z dvoch benzénových kruhov. Potom sa chalkón premení na naringenín (tiež nazývaný flavanón alebo trihydroxyflavón) pôsobením chalkónizomerázy (CHI). Na jednej strane sa z naringenínu v prítomnosti flavónu syntetizujú flavóny, ako je apigenín, acacetín, chryzín alebo luteolín. syntáza (FNS). Na druhej strane rôzne flavonoly a zlúčeniny kyseliny jantárovej sa vyrábajú z naringenínu v prítomnosti dvoch enzýmov; flavanón 3-dioxygenáza (F3D) a flavonolsyntáza (FS). Okrem derivátov flavonolu sa vyrábajú aj iné zlúčeniny, ako je kaempferol, myricetín a kvercetín. Prenosom metylovej skupiny z S-adenosyl-L-metionínu vzniká izohamnetín v prítomnosti flavón-3'-O-metyltransferázy (FMT) [47,48]. Potom je izohamnetín monometoxyflavón alebo O-metylovaný flavonol z triedy flavonoidov. Je to kvercetín (prekurzor), v ktorom je hydroxyskupina v polohe 3' nahradená metoxyskupinou. Niektoré deriváty izohamnetínu sú prítomné v prírode, ako napríklad izohamnetín 3-O- -d-glukopyranozid, izohamnetín 3--neohesperidozid a izohamnetín 3--rutinozid z Calendula officinalis L [20].

V skutočnosti sú flavonoidy považované za jednu z najdôležitejších skupín polyfenolov. Majú štruktúru založenú na difenylpropánovom type s dvoma benzénovými kruhmi (kruh A a B, pozri obrázok 2) spojenými trojuhlíkovým reťazcom, ktorý tvorí uzavretý pyránový kruh (kruh C). Preto sa ich štruktúra označuje ako C6-C3-C6. O-glykozylačné polohy sú C7 vo flavónoch, izoflavónoch, flavanónoch a flavonoloch a C3 vo flavonoloch a antokyanidínoch. C-glykozylačné polohy sú vo flavónoch C6 a C8 [49]. Okrem toho dôležitosť antioxidačnej úlohy fenolových zlúčenín súvisí so stupňom hydroxylácie molekuly. Flavonoidy zahŕňajú izoflavóny, flavóny, flavanóny a ich glykozidy a flavonoly ako izohamnetín, ktorý sa tiež nazýva 3'-metoxykvercetín a 3-metylkvercetín [50]. V rastlinách je enzým, UDP-dependentné glykozyltransferázy, zodpovedný za glykozidovú formu izohamnetínu (izoramnetín 3-O-glukozid). Tento enzým využíva nukleotidové difosfátové cukry, zvyčajne uridíndifosfátové (UDP)-cukry, na prenos metylovej skupiny do cyklu a spojenie glykozidovej funkcie s izohamnetínom [51].

2.4. Izolácia a analýzy ilsorhamnetínu pochádzajúceho z liečivých rastlín

Distribúcia izohamnetínu v liečivých rastlinách je veľmi široká a metódy extrakcie a analýzy sú rôzne. Obzvlášť žiadané sú deriváty izohamnetínu. Pri ich charakterizácii pomáhajú hydroxylové a metylové skupiny. Na extrakciu izohamnetínu sa používajú niektoré metódy, medzi nimi založené na frakcionácii, s použitím chemometrických prístupov, enzýmovej a superkritickej tekutinovej extrakcie (SFE-CO2). Po prvé, frakcionácia sa môže použiť na zjednodušenie extrakcie odstránením všetkých olejových a lipofilných pigmentov zo vzoriek obsahujúcich lipidy. Odtučnená vzorka sa tiež sonikuje pred maceráciou v zmesi metanolu a vody. Chromatografiu potom možno použiť na analýzy fenolových zlúčenín, najmä flavonoidov [49]. Pre tieto posledné zlúčeniny sa používa LC-MS a často sa používa elektrosprejová ionizácia (ESI) aj chemická ionizácia pri atmosférickom tlaku a najlepšia citlivosť na flavonoidy sa vo všeobecnosti dosahuje v režime záporných iónov [49]. Napríklad sa hodnotila fytochémia rastlinných frakcií Calligonum Azel Maire zozbieraných z tuniskej púšte a na identifikáciu fenolových látok medzi nimi sa použila ultra vysokoúčinná kvapalinová chromatografia spojená s hmotnostnou spektrometriou so štvornásobným časom letu UHPLC-ESI-QTOF. a flavanoly, ktoré boli najrozšírenejšími identifikovanými fenolovými zlúčeninami [52]. Presnejšie povedané, prítomnosť izohamnetín glukozidu a izohamnetín glukozyl-ramnozidu bola potvrdená ako hlavné zlúčeniny v listoch jedlého halofytu Mesembryanthemum edule pomocou technológie LC/ESI-MS/MS [3]. Po tejto práci nasledovali ďalší, ktorí použili LC-ESI-TOF-MS na charakterizáciu mnohých polyfenolov; medzi nimi boli flavonoidy identifikované zo vzdušných častí plného kvitnutia halofytov, ako sú Arthrocnemum indicum [5], Tamarix gallica [16], Glaucium flavum[13] a Salsola kali[8]. Podobne ako v posledných prácach sa vykonalo profilovanie LC-ESI-TOF-MS a GC-MS pre Artemisia herbal na identifikáciu fenolových látok, ako sú flavóny, flavonoly a flavonoidné alkaloidy[7]. Ďalšia práca bola vykonaná na Pancratium maritimum a analýza pomocou HPLC-DAD-ESI/MS odhalila prítomnosť flavonoidov vrátane flavonolu ako izoramnetínu s ich pentoxidovými a hexozidovými konjugátmi, ako je izohamnetín dihexozid [53].

Flavonoly ako nemastné zlúčeniny sa dajú izolovať hexánom. Potom sa môže použiť polárne rozpúšťadlo, ako je etanol. Štúdia na Limoniastrum guyonianum pomocou HPLC ukázala prítomnosť mnohých fenolických látok, medzi nimi izohamnetín-3-O-rutinozid [54].

Ďaleko od fenolových extraktov sa fenolové zlúčeniny nachádzajú aj v olejoch, ako je olivový olej [55]. Tieto zlúčeniny majú schopnosť chrániť oleje pred oxidáciou a zlepšujú nutričnú hodnotu oleja. Izorhamnetín ako fenolová zlúčenina bol tiež zistený v olejovom extrakte zo semien tuniského čierneho kmínu (Nigella sativa L.) získaných so zeleným rozpúšťadlom, ako je 2-metyltetrahydrofurán (MeTHF) ako alternatíva k rope alebo hexánu rozpúšťadlo na extrakciu olejom obohatených fenolových zlúčenín [10]. Prítomnosť izohamnetínu bola potvrdená analýzou HPLC. Analýzy pomocou kvapalinovej chromatografie s detektorom diódového poľa (LC-DAD) odhalili vysoké množstvo izoramnetínu v rozsahu medzi 6,3 a 6,6 (ug/g oleja) po extrakcii oleja z čierneho rasce pomocou MeTHF a hexánu, v danom poradí. Okrem toho pomocou H nukleárnej magnetickej rezonancie (HNMR) a C nukleárnej magnetickej rezonancie (CNMR) sa niektoré flavonolové glykozidy, ako napríklad kaempferol-3-O-rutinozid (nikotiflorín) a izohamnetín-3--rutinozid (narcizmus) boli charakterizované zo vzdušných častí Peucedanum aucheri Boiss zozbieraných v meste Marivan, provincia Kurdistan, Irán [56]. NMR metóda zisťuje vlastnosť, že určité atómové jadrá zlúčeniny interagujú s magnetickým poľom. Táto vlastnosť, ktorou je vytvárať magnetickú rezonanciu pri určitej frekvencii, poskytuje informácie o štruktúre molekuly. Po druhé, na vyhodnotenie účinnosti extrakcie flavonolu sa vyberú matematické modely, najmä na pochopenie najlepšieho spôsobu získania izoramnetín-3-O-rutinozidu [20]. Uskutočnila sa multivariačná faktorová analýza s použitím kvetov Calendula officinalis. Analyzovali sa lineárne, kvadratické, plné kubické a špeciálne kubické modely. Najvhodnejšia bola posledná plná kubická nádoba, ktorá umožnila vyššiu účinnosť extrakcie izohamnetín-3-O-rutinozidu o 60 percent . Pre túto štúdiu boli enzýmy Rapides Maxi Fruit a Viscozyme použité pri niektorých dôležitých faktoroch ovplyvňujúcich aktivitu enzýmu v superkritických podmienkach CO2, ako je tlak, teplota, pH, čas a vodný roztok etanolu. Nakoniec sa na extrakciu fenolových zlúčenín, ako sú flavonoly, použila metóda extrakcie superkritickou tekutinou. Pred mnohými rokmi bola na kôre Eucalyptus globulus prvýkrát použitá extrakcia superkritickou tekutinou s použitím čistého a modifikovaného CO2 s vodou, etylacetátom a etanolom [57]. Autori ukázali, že superkritický CO2 v kombinácii s etanolom môže extrahovať značné množstvo fenolových zlúčenín vrátane izohamnetínu. Kvantifikácia HPLC-MS určila niektoré flavonoly, ako je izohamnetín-hexozid (0,26 gg-I extraktu) a jednoduchý izohamnetín (14,29 mg:g extraktu). Ako ko-rozpúšťadlo sa použil etanol. Kvantifikácia sa uskutočnila pomocou vysokotlakovej kvapalinovej chromatografie vybavenej detektorom fotodiódového poľa. Izorhamnetín 3-O-glukozyl-ramnosyl-ramnozid, izohamnetín 3-O-glukozyl-ramnosyl-pentoxid, izohamnetín 3-O-glukozyl-ramnozid a izohamnetín 3-O-glukozyl -pentoxid boli najhojnejšie flavonoly extrahované z nadkritických extraktov O. ficus-indica. Ako už bolo uvedené, vysokotlaková kvapalinová chromatografia alebo HPLC je bežne používaná metóda na analýzu fenolových zlúčenín. V jablkovom džúse a hruškovom džúse bol zistený izohamnetín 3--O-glukozid. V skutočnosti separácia flavonolových glykozidov v extrakte z jablka "Brettacher" pomocou HPLC a hmotnostnej spektrometrie odhalila prítomnosť dvoch glykozidových foriem, ako je izohamnetín 3-O-glukóza a izohamnetín 3--galaktozid [ 58].