Časť 2: Účinok celkových diterpenoidov z Euphorbiae Ebracteolatae Radix proti malígnemu ascitu možno pripísať zmenám akvaporínov prostredníctvom inhibície aktivity PKC v obličkách

Pre viac info. kontakttina.xiang@wecistanche.com

Všetci vieme, že obličky sú najdôležitejším orgánom v ľudskom tele. Ak oblička nie je dobrá, potrebuje obličku vyživovať. Existuje mnoho spôsobov, ako vyživovať obličky. Niektorí ľudia budú jesťCistanchevyživovať obličky. Cistanche je bohatá na alkaloidy,echinakozid, glykozidy Verbascumkryštalické neutrálne látky, aminokyseliny, stopové prvky, vitamíny a ďalšie zložky. Cistanche dokáže regulovať aj obehový systém s nasledujúcimi účinkami: chrániť ischemický myokard; znižujú lipidy v krvi, odolávajú ateroskleróze a odolávajú trombóze; zníženie periférnej vaskulárnej rezistencie, rozšírenie periférnych krvných ciev a zníženie krvného tlaku; chrániť pečeň a odolávať stukovateniu pečene.

3. Diskusia

EER sa historicky používa v TCM na liečbu abdominálnej distenzie a edému [1]. V tejto štúdii sa antiascitické účinky EER skúmali pomocou ascitických myší nesúcich nádorové bunky H22. Malígne ascitické myši sú široko používané vo výskume na štúdium liečby nádorov a ascitu [21,22]. Naše výsledky ukázali, že EER aj TDEE môžu výrazne znížiť objem ascitu, zatiaľ čo NTDEE nemalo žiadny účinok. Tieto výsledky ukázali, že TDEE bola anti-ascites aktívna frakcia EER. Predchádzajúce štúdie ukázali, že diterpenoidy z EER majú inhibičné aktivitynádorových buniekin vitro [5,23]. Táto štúdia však zistila, že nemajú žiadne účinky na životaschopnosť nádorových buniek, bunkový cyklus alebo apoptózu nádorových buniek. Možné dôvody tejto nezrovnalosti môžu zahŕňať rozdiely v dávkach a slabú koreláciu medzi aktivitami in vivo a in vitro. TČM zastáva názor, že EER je účinná v liečbe edémov najmä rýchlou reguláciou exkrécie moču a stolice [6]. Preto sme analyzovali účinok TDEE na hmotnosť moču a obsah fekálnej vody u ascitických myší. Je potrebné poznamenať, že hmotnosť moču a hmotnosť ascitickej tekutiny boli ovplyvnené TDEE pri dávkach 3 a 0,6 g surových bylín/kg, zatiaľ čo obsah fekálnej vody sa zvýšil iba pri 3 g surových bylín/kg, takže TDEE hlavne znížený objem ascitu znížením reabsorpcie vody v obličkách. Reabsorpcia vody obličkami hrá ústrednú úlohu pri udržiavaní homeostázy vody v tele [16]. AQP poskytujú obličkám hlavné kanály na reabsorpciu vody a koncentrovanie moču [24]. V dôsledku toho môže štúdium expresie AQP poskytnúť mechanizmus na zníženie ascitu.

Rôzne AQP sú vyjadrené v rôznych oblastiachobličky.AOP1, AOP2, AOP3, and AQP4 are localized in renal epithelial cells and are closely related to water reabsorption in the kidney [25]. AQP1 is highly expressed in both apical and basolateral membranes of the proximal tubules and control>70 percent absorpcie vody v glomerulárnom filtráte [16]. AQP2, AOP3 a AOP4 sú exprimované výlučne v zberných kanáloch, ktoré sú životne dôležitými segmentmi pre reguláciu vodnej bilancie a koncentrácie moču [16]. V tejto štúdii TDEE znížil proteínovú expresiu AQP1, AQP2, AQP3 a AQP4 v obličkách myší. Tieto zistenia potvrdili výsledky bunkových experimentov in vitro. Inhibičné aktivity AQPs hlavných diterpenoidov v TDEE boli hodnotené v bunkových líniách proximálneho tubulu a zberného kanála. Naše výsledky ukázali, že diterpenoidy v TDEE znížili hladiny expresie proteínu AQPs a mRNA v bunkách HK-2 a mIMCD3.

Kliknutím kontaktujte dodávateľa pre nákup cistanche tubulosa

Relatívne hladiny expresie proteínu AQPs a mRNA každého diterpenoidu sa porovnávali s kontrolnou skupinou.RenálnaTubuly sú dôležitou súčasťou reabsorpcie vody. Spomedzi štyroch diterpenoidov mal ent-abietán diterpenoidy jolkinolid B (1269 percent TDEE) najsilnejší účinok na reguláciu AQP1 v HK-2 bunkách. Porovnaním so štruktúrou zlúčeniny 2 má jolkinolid B (zlúčenina 3) dva epoxidové kruhy v polohách C-11 a 14. Keď sa epoxidový kruh na C-11 a 14 premenil na hydroxylovú a dvojitú väzbu v zlúčenine 2, inhibičná aktivita AQP1 zmizla. Koncentrácia moču sa vyskytuje hlavne v obličkových zberných tubuloch. Výsledky z buniek mIMCD3 ukázali, že rosánová diterpenoidná zlúčenina 4 a norditerpenoidná laktónová zlúčenina 5 (ktorá predstavuje 9,16 percent a 39,26 percent TDEE, v uvedenom poradí) majú najsilnejšie inhibičné účinky na expresiu AQP2, AQP3 a AQP4. Inhibičné účinky ent-abietánových diterpenoidov boli slabé v porovnaní s týmito dvoma typmi diterpenoidov. Inhibičné účinky rôznych typov diterpenoidov na rôzne AOP v obličkách neboli rovnaké, čo môže byť spôsobené zmenami v chemickej štruktúre diterpenoidov a dobou odozvy AQP na každú zlúčeninu. Celkovo môžu tieto diterpenoidy poskytnúť synergické inhibičné účinky AQP. Pretože aktivity týchto diterpenoidov boli odhadnuté in vitro, aktivity týchto zlúčenín po metabolizme in vivo zostávajú nejasné, a preto si vyžadujú ďalšie skúmanie.

Niekoľko štúdií naznačilo, že PKC a PKA fungujú pri regulácii AQP [17-20]. PKC je rodina serín/treonín kináz zapojených do rôznych bunkových signálnych transdukcií [26]. Rodina PKC zahŕňa niekoľko izoforiem [26]. Po aktivácii sa PKC translokujú z cytosolu do plazmatickej membrány, viažu sa na diacylglycerol (DAG) a následne indukujú sériu fyziologických zmien [27]. Translokácia PKC z cytosolu do plazmatickej membrány je indikátorom aktivácie PKC [28]. DAG je generovaný PLC katalyzovanou hydrolýzou membránového fosfatidylinozitolu-4,5-bisfosfátu (PIP2)[27]. V experimentoch na zvieratách sme merali hladiny expresie PKCo a PKC v membránovej frakcii. Súčasne sme tiež detekovali zmeny v upstream proteínoch PKC. Výsledky naznačujú, že TDEE znižuje expresiu PKC na bunkovej membráne a inhibuje aktivitu PKC. Nebol však pozorovaný žiadny účinok TDEE na hladinu fosforylácie PLC. TDEE sa môže priamo viazať na PKC a inhibovať aktiváciu PKC. Enzymatická aktivita PKA je primárne riadená regulačnými podjednotkami, ktoré tvoria holoenzýmový komplex s katalytickými podjednotkami [29] Uvoľňovanie katalytických podjednotiek je charakteristickým znakom aktivácie PKA [29]. Zistili sme, že liečba TDEE nemala žiadny vplyv na aktiváciu PKA. Aby sme preskúmali, či je inhibícia AQP1, AQP2, AQP3 a AQP4 v obličkách sprostredkovaná blokovaním aktivácie signálov PKC, použili sme PMA ako agonistu PKC na interferenciu s expresiou AOP1, AOP2, AQP3 a AQP4 v HK{ {19}} a mIMCD3 bunky. Naše výsledky ukázali, že eufebrakteolatín A (diterpenoid z TDEE) znížil hladiny expresie AQP1, AQP2, AQP3 a AQP4 vobličkové bunky. Inhibícia expresie AOP1, AOP2, AOP3 a AQP4 indukovaná eufebrakteolatínom A bola blokovaná PMA. Z toho vyplýva, že TDEE regulovala expresiu AQP1, AQP2, AQP3 a AQP4 inhibíciou aktivácie PKC. PKC izoforiem je veľa; TDEE môže tiež regulovať expresiu AQP inhibíciou iných izoforiem, ktoré čakajú na ďalší výskum. K dnešnému dňu zostávajú molekuly downstream od PKC, ktoré regulujú expresiu AQP, nedostatočne pochopené. V ďalšom kroku sa zameriame na nadväzujúce regulačné mechanizmy PKC.

Stručne povedané, TDEE je aktívna frakcia EER proti ascitu. TDEE pozostáva z diterpenoidov, ako sú ent-abietán, rosane a norditerpénové laktóny. TDEE a jeho diterpenoidy môžu inhibovať reabsorpciu a koncentráciu vody v obličkách znížením hladín expresie AQP1, AQP2, AQP3 a AQP4, čím sa vyrieši ascites. Inhibícia expresie AQP1, AQP2, AQP3 a AQP4 v obličkách pomocou TDEE súvisí s inhibíciou aktivácie PKC. Táto štúdia môže poskytnúť základ pre klinickú aplikáciu EER a identifikáciu kandidátskych liekov, ktoré dodávajú diurézu a účinky proti ascitu.

4. Materiály a metódy

4.1. Chemikálie a činidlá

Súprava na testovanie albumínu bola zakúpená od Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Čína). Acetonitril v kvalite HPLC bol zakúpený od Media Co. (Anqing, Čína). Dulbeccovo modifikované Eaglovo médium (DMEM) bolo získané od HyClone (Logan, UT, USA). Minimálne esenciálne médium s neesenciálnymi aminokyselinami (MEM NEAA) a fetálne bovinné sérum (FBS) boli získané od Procell Life Science & Technology Co., Ltd. (Wuhan, Čína). Králičie anti-AQP1 a AQP3 protilátky boli získané od EnoGene Co., Ltd. (Nanjing, Čína). Králičie anti-AQP2, AQP4 a myšie anti- -aktínové protilátky boli zakúpené od Zen BioScience Co., Ltd. (Chengdu, Čína). Králičie anti-PKC, PKC, PLC a fosfo-PLC(Tyr783) protilátky boli zakúpené od Affinity Biosciences Co., Ltd. (Changzhou, Čína). Rádiový imunoprecipitačný testovací pufor (RIPA pufor), súpravy na detekciu bunkového cyklu a bunkovej apoptózy poskytla spoločnosť Yifeixue Biotechnology (Nanjing, Čína). Súprava BCA bola zakúpená od Beyotime Biotechnology (Shanghai, Čína). Reagenčný pufor TRIzol bol zakúpený od Thermo Fisher Scientific (Carlsbad, CA, USA). PVDF membrány boli zakúpené od Millipore (Bedford, MA, USA). Súprava na syntézu cDNA bola zakúpená od YEASEN Biotech Co., Ltd. (Shanghai, Čína).

4.2. Rastlinný materiál

EER, koreň Euphorbia ebracteolate Hayata, bol zakúpený od Baohetang Pharmaceutical Co., Ltd. (Bozhou, Čína) 15. septembra 2017 a overený profesorom Harbinom Huom z Jiangsu Institute for Food and Drug Control. Vzor poukážky (WH20170915) bol uložený v Herbári tradičnej čínskej medicíny na Farmaceutickej fakulte Univerzity čínskej medicíny v Nankingu.

4.3. Extrakcia a izolácia TDEE a čistenie diterpenoidov

EER bol rozdrvený pomocou mechanickej brúsky. Prášok (100 g) sa podrobil následnej extrakcii na Soxhletovom extraktore počas 6 hodín dichlórmetánom. Potom sa extrakt skoncentroval za zníženého tlaku, čím sa získal dichlórmetánový extrakt. Dichlórmetánový extrakt sa podrobil stĺpcovej chromatografii (CC) na ODS eluovaním postupne 40 percentami a 90 percentami metanolu. Eluent 90 percent metanolu sa zozbieral, skoncentroval a vysušil, čím sa pripravil TDEE (2,4 g). Extrahované zvyšky sa spojili a extrahovali trikrát 95 % etanolom. Extrakt sa potom spojil a odparil do sucha, čím sa získal NTDEE (15,6 g). TEER (19,8 g) sa extrahoval z prášku EER (100 g) 95 percentným etanolom. Tieto extrakty boli použité pri pokusoch na zvieratách.

Hlavné zlúčeniny TDEE boli izolované pomocou nasledujúceho postupu. Koreň EER (20 kg) sa rozdrvil a extrahoval dichlórmetánom počas 72 hodín pri teplote miestnosti maceráciou trikrát. Získal sa dichlórmetánový extrakt a skoncentroval sa na rotačnej odparke. Zvyšok sa podrobil CC na silikagéli použitím gradientového systému so zvyšujúcou sa polaritou s CH, Cl a MeOH (100:0-0:100), čím sa získalo 8 frakcií (Fr. 1-Fr.8) . Fr.4 sa podrobil silikagélovej kolóne s elúciou petroléterom-EtOAc (od 50:1 do 1:1), nasledovala reverzná fáza ODS CCelúcia s MeOH-H, O od 60 percent do 80 percent, čím sa získali zlúčeniny 5 a 6. Fr.5 sa chromatografoval na silikagélovej kolóne elúciou petroléterom-EtOAc (od 35:1 do 0:1), čím sa získalo 7 subfrakcií (Fr.5.1-Fr.5.7). Fr.5.3 sa oddelil pomocou ODS CC eluovaním s MeOH-H20 (od 75 percent do 100 percent), nasledoval

semipreparatívnou HPLC (MeOH-H20, od 75 percent do 100 percent), čím sa získa zlúčenina 4. Fr.5.4 sa chromatografuje na stĺpci silikagélu s elúciou petroléterom-EtOAc (od 30:1 do 5:1), potom Sephadex LH-20(MeOH:CH2CI, 1:1) a semi-preparatívna HPLC (MeOH-H,0, od 60 percent do 95 percent), čím sa získa zlúčenina 3.Fr. 5.6 sa čistil pomocou ODS CC elúciou s gradientom MeOH-H20 od 40:60 do 100:0, po čom nasledoval Sephadex LH-20CC (CHCl-MeOH, 1:1), čím sa získali zlúčeniny 1 a 2.

4.4. Experimenty in vivo

4.4.1.Zvieratá a experimentálny dizajn

Samce myší ICR (hmotnosť: 18-22 g) boli získané z chovu zvierat Qing Long Shan Animal Breeding Farm (Nanjing, Čína). Myši boli chované v štandardných laboratórnych klietkach v miernej vlhkosti (50 percent ± 5 percent) pri konštantnej teplote (22 ± 1 stupeň) v 12-hodinovej miestnosti s cyklom svetlo-tma. Všetky zvieratá mali počas experimentálneho obdobia voľný prístup k potrave a vode. Experimentálny protokol bol schválený Výborom pre etiku zvierat Nanjingskej univerzity čínskej medicíny (Nanjing, Čína).

Celkom 90 myších samcov bolo náhodne rozdelených do 9 skupín (n= 10). Kontrolnej skupine bola intraperitoneálne podaná injekcia 0,2 ml fyziologického roztoku. Myši v ostatných skupinách boli ip inokulované 1 x 1 {{10}} bunkami H22 stupňa v objeme 0,2 ml. Všetky liečivá boli suspendované vo vode s 0,5 % (wo/o) sodnou soľou karboxymetylcelulózy (0,5 % Na-CMC). Po 24 hodinách boli myši liečené sondou každý deň podľa nasledujúcej schémy počas 8 dní: normálnym a modelovým skupinám sa podával 0,5 % Na-CMC. Furosemid (6 mg/kg) bol vybraný ako pozitívna kontrola, pretože sa vo veľkej miere používa na liečbu edematóznych ochorení, ako je ascites, vďaka účinku diurézy. Skupinám TEER, TDEE a NTDEE sa podávali zodpovedajúce extrakty EER (3,0 a 0,6 g surových bylín/kg).

4.4.2. Stanovenie hmotnosti ascitickej tekutiny, hmotnosti moču a obsahu vody vo výkaloch

Myši z modelovej a liečenej skupiny sa usmrtili a z peritoneálnej dutiny sa odobrala ascitická tekutina. Kvapalina sa potom odvážila na elektronických váhach.

Myši boli umiestnené v individuálnych klietkach. Výkaly sa zbierali do odvážených a zapečatených fľaštičiek. Po 5 hodinách boli fľaštičky obsahujúce vlhké výkaly odvážené. Potom sa fľaštičky vysušili na konštantnú hmotnosť pri 105 stupňoch. Obsah fekálnej vody ( percentá )=((hmotnosť liekoviek obsahujúcich vlhké výkaly – hmotnosť liekoviek obsahujúcich sušené výkaly)/(hmotnosť liekoviek obsahujúcich vlhké výkaly – hmotnosť liekoviek)) × 100.

Hmotnosť exkrécie moču bola meraná modifikáciou predchádzajúcej metódy [30]. Myši boli umiestnené v jednotlivých kadičkách. Kadičky sa prikryli kovovou sieťkou na ústach a potom sa prevrátili na plastové misky obsahujúce superabsorpčný polymér (SAP). V tomto teste boli vyčistené výkaly. Po 5 hodinách boli plastové misky obsahujúce SAP a moč odvážené. Na stanovenie hmotnosti moču sa použila nasledujúca rovnica: hmotnosť moču (g) ​​= hmotnosť plastových misiek obsahujúcich SAP a hmotnosť moču plastových misiek obsahujúcich SAP.

4.4.3. Analýza sérového albumínu

Krv zo všetkých skupín bola odobratá orbitálnou punkciou a centrifugovaná pri 5000 x g počas 10 minút pri 4 stupňoch. Sérový albumín sa meral pomocou súpravy na testovanie albumínu.

4.4.4. Testy životaschopnosti, cyklu a apoptózy nádorových buniek

Po usmrtení myší sa ascitická tekutina obsahujúca nádorové bunky odobrala z peritoneálnej dutiny a okamžite sa zriedila 20-krát fyziologickým roztokom. Životaschopnosť nádorových buniek bola hodnotená 0,4 percentným farbením trypánovou modrou a spočítaná v automatizovanom počítadle buniek (ALIT Life Science Co., Ltd., Shanghai, Čína).

Zriedená bunková suspenzia (0,5 ml) sa centrifugovala pri 1000 g počas 5 minút pri 4 °C. Bunky sa zozbierali a fixovali v studenom 70 percentnom etanole pri 4 °C cez noc. Po fixácii boli nádorové bunky dvakrát premyté v PBS a centrifugované a potom inkubované s roztokom RNázy A (100 ul) počas 30 minút pri 37 stupňoch. Nakoniec sa bunky inkubovali so 400 ul propidium jodidu

(PI) počas 30 minút pri 4 stupňoch v tme a prefiltrovaná cez 300-sieťovú nylonovú membránu. Percento buniek v rôznych fázach sa analyzovalo pomocou prietokového cytometra Accuri C6 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).

Apoptóza nádorových buniek sa detegovala pomocou súpravy Annexin V-FITC/PI Apoptosis. Zriedená bunková suspenzia (0,5 ml) sa dvakrát premyla v PBS a centrifugovala pri 1000 g počas 5 minút pri 4 stupňoch. Bunky sa zhromaždili a resuspendovali v 100 ul väzbového pufra, po čom nasledovala inkubácia s 5 ul Annexin V-FITC a 10 ul PI farbiaceho roztoku počas 15 minút pri teplote miestnosti v tme. Po inkubácii sa do každej skúmavky pridalo 400 ul väzbového pufra. Bunková apoptóza sa detegovala pomocou prietokového cytometra Accuri C6.

4.4.5. Analýza Western Blot AQP, PKC, PKA a PLC v obličkách

Potom, čo boli myši usmrtené, boli obličky izolované a rýchlo zmrazené a potom uložené pri -80 stupni na analýzu expresie proteínu. Vzorky tkaniva sa homogenizovali v RIPA lyzovacom pufri. Po uskladnení pri -20 stupňoch cez noc sa tkanivové lyzáty zhromaždili po centrifugácii počas 10 min pri 12,000×g. Po odstredení sa supernatant odobral na stanovenie celkových a fosforylovaných proteínov. Membránové proteíny sa extrahovali z obličiek použitím súpravy na extrakciu membránových proteínov podľa protokolu výrobcu. Koncentrácie proteínov boli stanovené pomocou súpravy BCA. Proteínové roztoky boli denaturované vo vriacej vode počas 5 minút a zmiešané s 5x nanášacím pufrom. Rovnaké množstvá proteínov boli separované na 10 percent SDS-polyakrylamidovej gélovej elektroforéze, prenesené na polyvinylidéndifluoridové (PVDF) membrány a následne blokované 5 percentným albumínom z bovinného séra (BSA) počas 2 hodín. Po blokovaní boli membrány inkubované s primárnymi protilátkami proti AOP1 (1:2000), AOP2 (1:1000), AQP3 (1:2000), AQP4 (1:1000), PKC (1:2000), PKC (1: 2000), PKA (1:2000), PLC (1:2000), p-PLC (1:800) a -aktín (1:5000) pri 4 stupňoch cez noc. Potom sa membrány premyli Tris-pufrovaným fyziologickým roztokom obsahujúcim 0,1 percenta Tween{42}} (TBST) a primárne protilátky sa detegovali sekundárnymi protilátkami konjugovanými s chrenovou peroxidázou (1:5000). Proteíny sa vizualizovali pomocou chemiluminiscenčného činidla a chemiluminiscenčného zobrazovacieho systému Tanon 5200 (Tanon, Shanghai, Čína). Blotové pásy boli kvantifikované denzitometriou s použitím ImageJ.

4.5. Stanovenie šiestich hlavných diterpenoidov v TDEE

Euphoria G, ent{{0}}l-hydroxyabicta-8(14),13(15)-dién-16,12-olid,jolkinolid B, EU-febrakteolatín A, Fischer A a jolkinolid E sa rozpustili v acetonitrile na príslušné koncentrácie. TDEE sa tiež rozpustil v acetonitrile na detekciu obsahu zložiek pomocou HPLC. HPLC analýza sa uskutočnila na separačnom systéme Waters 2695 vybavenom detektorom s fotodiódovým poľom (Waters, Milford, CT, USA) a kolónou Agilent Eclipse XDB-C18 (4,6 mm x 250 mm, 5 um）). Mobilná fáza pozostávala z 0,1 percenta kyseliny mravčej, vody (A) a acetonitrilu (B). Rozpúšťadlo bolo vyvinuté s prietokovou rýchlosťou 1 ml/min s použitím nasledujúceho gradientového programu:0-25 min, 65 percent B;25-40 min, 65 percent -85 percent B;{{25 }} min, 85 percent -100 percent B. Objem injekcie bol 10 μl. Teplota kolóny bola 30 stupňov a použila sa vlnová dĺžka 265 mm.

4.6. Experimenty in vitro

4.6.1. Bunková kultúra

Bunky HK-2 a mIMCD3 boli zakúpené od spoločnosti Procell Life Science & Technology Co., Ltd. (Wuhan, Čína). Všetky bunky boli kultivované v inkubátore v 5-percentnej atmosfére CO2 pri 37 stupňoch až do 90-percentnej konfluencie a potom ošetrené rôznymi zlúčeninami a riadené pre experimenty. Bunky HK-2 boli pestované v MEM NEAA doplnenom 10 percentami FBS a 1 percentami antibiotík, zatiaľ čo bunky mIMCD3 boli pestované v médiu DMEM obsahujúcom 10 percent FBS a 1 percento antibiotík.

4.6.2. Western Blot a kvantitatívna reverzná transkripčná-PCR (qRT-PCR) analýzy AQP

Bunky HK{{0}} a mIMCD3 sa naočkovali (5 x 105/jamku) na 6-jamkové platne počas 24 a 12 hodín pred ošetrením. Bunky boli ošetrené rôznymi zlúčeninami počas 8 hodín v 5 percentách CO, inkubátore pri 37 stupňoch. Bunky ošetrené 0,1 percentným dimetylsulfoxidom sa použili ako kontrola vehikula. Po ošetrení boli bunky dvakrát premyté v studenom PBS, zozbierané zoškrabaním v RIPA lýzovom pufri a potom lyzované. Po skladovaní pri -20 stupňoch cez noc sa lyzáty vyčerili centrifugáciou pri 12,{15}xg počas 10 minút a supernatanty sa zhromaždili a použili na analýzu Western blot. Western blot sa uskutočnil tak, ako už bolo opísané v experimentoch na zvieratách v tomto článku.

Na izoláciu celkovej RNA. Po inkubácii s rôznymi zlúčeninami počas 8 hodín boli bunky premyté PBS a rozpustené v TRIzolovom reagenčnom pufri a RNA bola izolovaná podľa pokynov výrobcu. cDNA bola syntetizovaná z rovnakého množstva RNA s použitím súpravy na syntézu cDNA. Reakčná zmes pre gRT-PCR sa pripravila pridaním cDNA, dopredných a reverzných primérov uvedených v tabuľke 1, DEPC vody a zelenej základnej zmesi SYBR. Na analýzu génovej expresie sa použil prístroj Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR. Podmienky PCR boli nasledujúce: počiatočná denaturácia pri 95 stupňoch počas 5 minút, po ktorej nasledovalo 40 cyklov pri 95 stupňoch počas 10 s a 60 stupňoch počas 34 s. Nakoniec sa údaje z PCR analyzovali metódami dvojitého delta CT na tabuľkovom procesore Microsoft Excel.

4.6.3. Účinok PKC agonistu PMA na expresiu proteínu AQP v obličkových bunkách

Bunky HK-2 a mIMCD3 boli nanesené na 6-jamkové platne v hustote 5x10 stupňov buniek/jamku. Po pripojení buniek sa bunky predinkubovali s alebo bez 200 nM PKC agonistu (PMA) počas 1,5 hodiny a potom sa ošetrili s eufebrakteolatínom A (2,5 uM) počas 8 hodín. Extrakcia celkových a membránových proteínov a analýza Western blotting sa uskutočnili tak, ako bolo podrobne opísané vyššie.

4.7. Štatistická analýza

Na štatistickú analýzu sa použil analytický softvér SPSS 19.{1}}. Údaje sa analyzovali pomocou jednosmernej ANOVA alebo testu poradia súčtu. Číselné údaje boli vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka (SD). Rozdiely s p<0.05 were="" considered="" statistically="">