Časť 2: DHHC21 Slušnosť zmierňuje renálnu dysfunkciu počas septického poranenia

Kontakttina.xiang@wecistanche.com

Diskusia

V súčasnej práci uvádzame DHHC21 ako nový regulátor renálnej perfúzie a funkcie počas septického poranenia. Naše nové zistenia naznačujú: (1) Zdhhc21devde? myši vykazujú lepšiu funkciu obličiek a menšie poškodenie obličiek po septickom poranení v porovnaní s myšami WT;(2)Funkčný nedostatok DHHC21 zachováva perfúziu obličkového tkaniva, saturáciu kyslíkom a RBF pri septickom poranení;(3)DHHC21 katalyzovaná alAR palmitoylácia je potrebná na aktiváciu signálnej dráhy alAR a zúženie obličkových tepien vyvolané alAR. Táto štúdia poskytuje nový mechanistický pohľad na reguláciu renálnej perfúzie a funkcie počas septického poranenia. Navrhujeme, aby funkčný nedostatok DHHC21 poskytoval ochranné účinky nafunkcia obličiekpri septickom zranení a inhibícii DHHC21 môže slúžiť ako terapeutická stratégia na boj protirenálna dysfunkciaPočas septického zranenia.

Kliknite sem a spoznajte výhody extraktu cistanche tubulosa

Hypoperfúzia/hypoxia obličkového tkaniva je jednou z hlavných príčin dysfunkcie obličiek počas septického poranenia3-5. Zistili sme hypoperfúziu obličiek u myší po CLP preukázanej oslabenou intenzitou signálu MSOT celkového hemoglobínu, zníženou saturáciou kyslíka v obličkovom tkanive a zníženou RBF po septickom poranení. V súlade s našimi zisteniami sa zníženie RBF pozorovalo u pacientov so sepsou s poškodením obličiek, ako aj u veľko-zvieracích modelov septického poranenia7,10l1. Stojí za zmienku, že niekoľko štúdií uvádza, že dysfunkcia obličiek sa môže vyvinúť u zvierat sepsy s nezmeneným alebo dokonca zvýšeným RBF334. Tieto nezhodné nálezy možno pripísať rôznym zvieracím modelom a metódam používaným na meranie prietoku krvi. Napríklad, zatiaľ čo sa bežne používa polymikrobiálne septické zranenie vyvolané CLP, niektoré štúdie používajú intravenóznu injekciu Escherichia coli35.

Palmitolácia bielkovín bola nedávno hlásená ako nový regulátor funkcie bielkovín, ktorý sa podieľa na patogenéze a progresii mnohých ochorení. Prvýkrát bol identifikovaný ako nový typ posttranslačnej modifikácie Schmidtom et al.3637.Objav rodiny DHHC odvtedy podporil rýchlu expanziu tohto poľa38,39. Úlohy palmitoylácie a PAC boli hlásené v mnohých fyziologických a patologických stavoch vrátane metabolizmu lipidov,rakovina,kardiovaskulárne ochorenia, a neurologické poruchy23,0,4. Hoci zapojenie palmitoylácie do polycystického ochorenia obličiek a rakoviny obličiek bolo predtým hlásené23., existujú veľmi obmedzené štúdie skúmajúce funkčnú úlohu PAC vochorenia obličiek, konkrétne pri dysfunkcii obličiek počas septického poranenia. Podľa našich najlepších vedomostí sme prví, ktorí skúmajú úlohu DHHC2l pri dysfunkcii obličiek pri septickom zranení. Naše zistenia naznačujú, že inhibícia DHHC21 výrazne zachraňuje funkciu obličiek a zachováva štruktúru obličiek pri septickom poranení.

Naša štúdia využívajúca Zdhhc21dp/d4? myši dokazujú, že priaznivé účinky funkčného nedostatku DHHC21 na funkciu obličiek sa pripisujú jeho schopnosti zlepšiť perfúziu obličkového tkaniva počas septického poranenia. V bazálnych podmienkach myši Zdhhc21ewaeP nevykazujú žiadne známky nerovnováhy soli a vody alebo poškodenia obličiek5. Napriek tomu DHHC21 strata funkcie potláča septické zranenie spôsobené zníženie RBF, renálnu perfúziu a saturáciu obličkovým kyslíkom. Zvýšená vaskulárna rezistencia obličiek spôsobená nadmernou renálnou vazokonstrikciou sa považuje za hlavný dôvod poškodenia perfúzie obličkového tkaniva pri septickom poranení6,9. Naše výsledky naznačujú zapojenie alAR do sprostredkovania hypoperfúzie obličkového tkaniva vyvolanej septickým zranením, o čom svedčí zvýšenie palmitoylácie alAR a aktivácia dráhy signalizácie alAR pri septickom poranení. Funkčný nedostatok DHHC21 však inhibuje alARpalmitoyláciu a vedie k otupenej schopnosti alAR aktivovať jeho následný účinor a sprostredkovať vazokonstrikciu vyvolanú fenylefrínom v obličkových tepnách.

"Molekulárny mechanizmus, ktorý je základom regulácie funkcie alAR DHHC21, musí byť ešte stále plne objasnený. Porucha funkcie alAR spôsobená stratou funkcie DHHC21 sa môže pripísať konformačnej zmene alAR. Mnohé GKR sa spoliehajú na palmitoyláciu pre ich vhodnú intracelulárnu konformáciu, pripojený palmitát v C-terminálnych chvostoch GPCR sa vkladá do plazmatickej membrány, aby sa vytvorila štvrtá intracelulárna slučka, ktorá je nevyhnutná pre interakciu GPCR s ich partnerskými proteínmi a šírenie signálov GPCR17,4. Predchádzajúca štúdia naznačila, že palmitoylácia Albaru sa vyskytuje aj v oblasti C-terminálu44. Preto nedostatok palmitoylácie sprostredkovanej DHHC21 môže zmeniť intracelulárnu konformáciu alAR, čím sa zablokuje šírenie signálov αlAR. To možno podporiť našimi výsledkami, ktoré ukazujú, že aktivácia ERK, následnej signalizačnej udalosti aktivácie alAR, je inhibovaná u myší Zdhhc21devider vystavených septickému zraneniu. Avšak dhhc21 regulovaná topológia alAR karboxyl-terminálu musí byť ďalej potvrdená pomocou röntgenovej kryštalografie.

Ďalším novým aspektom našej štúdie je využitie MSOT na hodnotenie perfúzie obličiek a funkcie počas septického poranenia. MSOT bola hlásená ako metóda bez štítkov na meranie perfúzie rôznych orgánov a spoľahlivá zobrazovacia technika na určenie funkcie obličiek2832,45. V porovnaní s Dopplerovým prietokomerom, ktorý neumožňuje vizualizáciu mikrovaskulatúry45, MSOT generuje snímky s vysokým priestorovým rozlíšením pri 150 um a zároveň poskytuje kvantitatívne hodnotenie stavu perfúzie v mikrovaskulatúre obličiek. Vo vode rozpustný IRDye800CW je bezpečný stopovač, ktorý sa používa na meranie renálnej klírensu, a nevyvoláva toxicitu pri dávke až 20 mg/kg. Dvojfázový pohyb IRDye800CW, ktorý sme pozorovali, je v súlade s predtým publikovanými štúdiami. Naše ZÁZNAMY MSOT naznačujú väčšie oneskorenie Tmax v obličkách sepsy, čo naznačuje zhoršený klírens obličiek. Štúdia nefropatie ukazuje, že zhoršená funkcia obličiek zistená MSOTis významne korelovala s glomerulárnym histologickým poškodením30. Naše údaje, v súlade s predchádzajúcimi publikáciami, naznačujú, že MSOT je minimálne invazívna a spoľahlivá technika na monitorovanie perfúzie a funkcie obličiek.

V súčasnosti nie sú k dispozícii žiadne inhibítory špecifické pre DHHC21. Najčastejšie používaný inhibítor PAT je 2-BP, ktorý má široký účinok na viac DHHC a tiež zasahuje do metabolizmu mastných kyselín47. Vývoj inhibítorov malých molekúl, ktoré sa špecificky zameriavajú na DHHC21, by bol teda sľubným smerom. Je tiež potrebné zdôrazniť, že alAR nie je jediným substrátom DHHC21. Nedávno bolo identifikovaných niekoľko ďalších substrátov DHHC21, vrátane molekuly endotelovej bunkovej adhézie krvných doštičiek (PFCA M-1), estrogénového receptora caveolin-1, syntáza endotelového oxidu dusnatého (eNOS), Fyn, superoxid dismutáza (SOD-1) a PLCB122,41,4s,49, Zatiaľ čo mimo rozsahu tejto štúdie nemôžeme vylúčiť možnosť, že tieto substráty môžu ovplyvniť aj funkciu obličiek počas septického poranenia.

Na záver táto štúdia po prvýkrát dokazuje, že DHHC21 zohráva rozhodujúcu úlohu pri regulácii perfúzie obličiek počas septického poranenia prostredníctvom mechanizmov zahŕňajúcich palmitoyláciu alAR a vazo-zúženie sprostredkované alAR. Okrem toho inhibícia DHHC21 pôsobí ochrannými účinkami na funkciu obličiek počas septického poranenia.

Materiály a metódy

Reagenty. Všetky činidlá sú uvedené v dodatkovej tabuľke S1.

Zvieratá. Myši Zdhhc21depher a ich kontrolné myši divokého typu (B6C3Fe) boli zakúpené v Jacksonovom laboratóriu. Genotyp Zdhhc21dephe? myši boli potvrdené sekvenovaním (Genewiz, Inc., NJ, USA). Základné nátery používané na sekvenovanie boli: AGCTGACTGAAGGGCACC(dopredu) a AAAACCTGTAACGCATTTCCA (reverzne)23. Zvieratá boli udržiavané v 12/12-hodinovom svetelnom/tmavom cykle s voľným prístupom k jedlu a vode. Na túto štúdiu sa použili myši (16-20 týždňov) oboch pohlaví. Všetky pokusy na zvieratách sú schválené Výborom pre starostlivosť a používanie zvierat Na Univerzite južnej Floridy a sú v súlade s príručkou NIH pre starostlivosť a používanie laboratórií

Cekálna ligácia a defekt, Myši boli anestetizované izofluránom (3% indukcia a 1% údržba). V oholenej brušnej oblasti bol vykonaný rez stredovej čiary a cecum bol exteriérizovaný, pevne zviazaný vo výške 5 mm pod ileocekálnym ventilom a dvakrát perforovaný distálnou ihlou kalibru 20 až do bodu ligácie. Z každého otvoru na prepichnutie bol vytlačený jeden mm výkalov. Cecum bol potom premiestnený a brucho bolo uzavreté v dvoch vrstvách. 37 C Laktovaný ringerový roztok sa nanášal lokálne, aby sa zabránilo vysušeniu cecumu. Myšiam sa potom podávalo 37 °C 0,9% fyziologického roztoku subkutánne na resuscitáciu tekutín. Na analgéziu bola podaná predoperačná dávka 0, 5 - 1, 5 mg/kg buprenorfínu s trvalým uvoľňovaním. Falošné myši boli podrobené rovnakému chirurgickému zákroku, ale bez cekálneho väzenia a defektu50,51.

Multispektrálna optoakustická tomografia. Hodnotenie vylučovania obličiek IRDye800CW. Myši boli anestetizované cez izoflurán a depilované okolo oblasti trupu. Myši boli zobrazené pomocou zobrazovacieho systému Altera Medical MSOT (Mníchov, Nemecko) pri viacerých vlnových dĺžkach: 700 730 760 775 785 885, 800 850 nm rýchlosťou 10 snímok/ s. Myši boli umiestnené v polohe na chrbte v držiaku a pohybovali sa pozdĺž horizontálneho lineárneho štádia, aby umiestnili obličky na vrchol fixne umiestneného konkávneho snímača. Po základnom zaznamenaní sa 60 nmol RDve800CW rozpustených v l00 ul 0,9% fyziologického roztoku vstreklo intravenózne počas obdobia l0 s. Obrázky boli rekonštruované pomocou spätného projekčného vzorca a spracované multispektrálnou analýzou. Oblasti záujmu (ROI) boli nakreslené okolo renálnej kôry a oblasti medulla / panvy a boli zobrazené časové zmeny signálu MSOT v ROI.

Meranie perfúzie obličiek. Myši boli pripravené na zobrazovanie MSOT s použitím rovnakých postupov uvedených vyššie. Dýchanie myšou bolo počas celého postupu pozorne monitorované. Obrazy boli zrekonštruované a bolo vykonané spektrálne nezmiešanie. Rois boli nakreslené okolo celej pravej oblasti obličiek. Získali sa priemerné intenzity pixelov okysličeného hemoglobínu (HbO) a odkysličeného hemoglobínu (Hb). Potom sa vypočítal celkový hemoglobín (HbT=HbO,+ Hb) a saturácia kyslíkom (So=HbO, /HbT>2.

Histopatológia obličiek. Obličky boli upevnené, prerezané pozdĺž sagitálnej roviny a spracované na vkladanie parafínu. Oddiely (5 μm) sa odfritovali, rehydratovali a oxidovali periodickou kyselinou počas 8 minút pri izbovej teplote (RT), po ktorej nasledovala inkubácia Schiffovým roztokom počas 25 minút. Sekcie boli potom znečistené hematoxylínom. Obrázky boli zachytené pomocou Keyence BZ-X710 (Itasca, IL, USA). Poškodenie obličiek sa hodnotilo na základe týchto vlastností: glomerulárna abnormalita, strata kefovej hranice proximálnej tubuly, vakuolácia, dilatácia tubulového epitelu, oddelenie tubulových buniek/nekróza a infiltrácia neutrofilov. Každá funkcia bola odstupňovaná na stupnici od 0 do 5 na základe závažnosti.

Meranie kreatinínu a dusíka z močoviny v krvi. Krv myší bola odobratá srdcovým prepichnutím 24 hodín po septickom poranení. Plazma bola vytvorená odstreďovaním krvi na 2500 g počas 15 minút pri RT. Meranie kreatinínu: plazma bola deproteinizovaná pomocou 10-kDa spinovej kolóny; hladiny kreatinínu vo filtráte sa potom merali pomocou súpravy kreatinínového testu. Hladina dusíka močoviny v krvi (BUN) bola stanovená pomocou súpravy na kolorimetrickú detekciu močoviny dusíka v súlade s pokynmi výrobcu.

Meranie RBF a MAP. Myši boli anestetizované pomocou izofluránu. Snímač krvného tlaku bol kanulovaný do krčnej tepny. V brušnej oblasti bol vykonaný rez strednej čiary, po ktorom nasledoval ľavý priečny rez na odhalenie renálnej tepny. RBF bol meraný pomocou ultrazvukového prietokomeru tranzitného času (TS-420; Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA). Po umiestnení prietokovej sondy okolo exponovanej renálnej tepny sa myši mohli stabilizovať najmenej 30 minút. RBF a MAP boli zaznamenané súčasne pomocou PowerLab (AD Instruments, Colorado Springs, CO, USA). Údaje boli analyzované pomocou softvéru LabChart Pro verzie 74,55

Zachytávanie podporované živicou. Renálne tepny boli odobraté a lyzované v lýznom tlmivom roztoku (100 mM HEPES.25 mM NaCl,1 mM EDTA,10 μM palmostatín B, inhibítory proteázy, pH 7,4)22,56. Tkanivové lyzáty boli inkubované blokujúcim tlmivým roztokom (100 mM HEPES.1 mM EDTA, 2,5% SDS,6 ul/ml MMTS,pH 7,4) pri teplote 50°CC počas 30 minút s konštantným vírovaním. Po vyzrážaní studeným acetónom boli bielkoviny peletované odstreďovaním pri 5000 g po dobu 30 minút a päťkrát sa umyli 70% studeným acetónom. Proteínové pelety boli resuspendované v viazacom tlmivom roztoku (100 mM HEPES,1,0% SDS,1 mM EDTA, pH 7,4). Koncentrácia bielkovín bola stanovená a normalizovaná medzi skupinami. Každá vzorka proteínu bola rozdelená na dve rovnaké časti, z ktorých každá dostala rovnaké množstvo korálkov izopropyl sepharózy 6B, hydroxvlamínu (0,2 M, pH 7,4) a NaCl (0,2 M) pridaných do každej časti. Po 4 hodinách inkubácie v RT s konštantnou rotáciou boli palmitoylované proteíny eluované 50 mM DTT v 1×Sample Buffer a zozbierané pre SDS-PAGE.

Západné nafúknutie. Meranie palmitoylovaného αlAR. Vzorky odobraté z RAC boli naložené na 4-20% tris-glycínový gél a po elektroforéze sa preniesli na nitrocelulózovú membránu. Po zablokovaní na 1 h v RT bol alAR vyšetrený primárnou protilátkou proti králikom anti-αlAR (1:500) cez noc pri teplote 4 °C. Po trojnásobnom umytí TBST bola membrána inkubovaná sekundárnou protilátkou proti králikovi IRDye800CW (1:20 000) počas 45 minút v RT.

Meranie fosforylácie ERK. Renálne tepny boli lyzované v 1×RIPA obsahujúcom inhibítory proteázy a fosfatázy. Membrána bola skúmaná protilátkami proti králičiemu antierk(1:1000) a proti fosforylovanej ERK (1:1000) proti myšiam. IRDye800CW somár anti-myš a IRDye680RD oslie anti-králičie protilátky boli použité na sekundárnu inkubáciu (1:20,000). Membrány boli snímané a analyzované pomocou Li-COR Odyssey CLx.

Hodnotenie vazoreaktivity pomocou drôteného myografu. Myšie obličkové tepny. Renálne tepny (s priemerom 250 - 350 μm) boli izolované od myší WTand Zdhhc21dp/de a ponorené do ľadovo studených okysličených (95% O,/5% CO.) fyziologický soľný roztok (PSS,130 mM NaCl,4,7 mM KCl,1,18 mM KH,PO,1,17 mM MgSO.7H,O, 14,9 mM NaHCO,5,5 mM glukózy,0,026 mM EDTA a 1,6 mM CaCl,pH 7,4). Segmenty nádob (~2 mm dlhé) boli namontované na drôtenú myografovú komoru (Living Systems Instrumentation, VT, USA) medzi dvoma volfrámovými drôtmi (priemer 30 um). Izometrické napätie bolo zaznamenané pomocou signálneho kondicionéra Living Systems (MYO-SC-1) spolu so softvérom LabScribe v4 iWorks. Po 30 minútach pri 37°CCin PSS sa vykonal normalizačný postup na určenie optimálneho vnútorného obvodu L,=0,9×L(Lo=vnútorný obvod, ktorý zodpovedá transmurálnemu tlaku 100 mmHg). Ďalej bola otestovaná životaschopnosť plavidla so 60 mMKPSS (74,7 mM NaCl,60 mM KCl,1,18 mM KH,PO.1,17 mM MgSO.7H,O,14,9 mM NaHCO, 5,5 mM glukózy,0,026 mM EDTA,1,6 mM CaCl,pH 7,4). Tepny, ktoré nereagovali na KPSS, boli odmietnuté. Tepny boli ošetrené zvyšujúcimi sa koncentráciami fenylefrínu (10 nM-30 μM). Endotelová integrita sa potom posúdila pomocou acetylcholínu (10 μM). Krivky koncentrácie a odozvy boli skonštruované.

Malé tepny z ľudských obličiek. Malé tepny (~ 1000 um v priemere) boli pitvané z neporušených životaschopných ľudských obličiek, ktoré boli odmietnuté na transplantáciu. Segmenty nádob (~2 mm dlhé) boli namontované na I-tyče (priemer 250 um) drôtenej myografovej komory. Podobné ekvalibračné a normalizačné postupy sa vykonávali na ľudských tepnách. Ďalej boli tepny inkubované ovládaním vozidla (0,02% DMSO v PSS) počas 1 h. Nádoby boli potom testované na životaschopnosť 60 mM KPSS a ošetrené zvyšujúcimi sa koncentráciami fenylefrínu [10 nM-30 uM]. Po umytí boli nádoby inkubované 2-BP(100 uM) počas 1 h; životaschopnosť plavidla sa potom opäť testovala s 60 mM KPSS so 100 uM 2-BP. Malé tepny bez alebo so zníženou odpoveďou na KPSS boli zlikvidované. Tepny boli potom napadnuté rovnakými koncentráciami fenylefrínu, po ktorých nasledoval acetylcholín (10 uM). Krivky reakcie na koncentráciu alebo tepny ošetrené 2 BP boli skonštruované a porovnané.

Imunofluorescencie. Ľudské renálne tepny boli fixované v 10% formalíne pre 48 hodín, vložené parafínom a oddelené. Snímky boli potom deparaffinizované, rehydratované a permeabilizované PBS obsahujúcimi 0,05% Triton X-1002. Po zablokovaní boli snímky označené králičím anti-DHHC21 a protilátkami proti kozám anti-αlAR(1:100) cez noc pri teplote 4 °CC. Po umytí bola vykonaná inkubácia sekundárnych protilátok so somárom anti-králikom Alexa Fluor 488 a somárom proti koze Alexa Fluor 568(1:500). Po montáži s montážnym médiom ProLong Diamond s DAPI boli snímky snímané spektrálnym spektrálnym refrakčným mikroskopom Leica SP8 s obráteným laserovým skenovaním.

Štatistická analýza. Podrobné informácie (napr. názov testu, post-hoc test, n hodnota, alfa úroveň, p-hodnota) pre každý štatistický test sú uvedené v dodatkovej tabuľke S2. Všetky údaje spĺňajú normálny predpoklad distribúcie. Test normálnosti bol vykonaný pomocou Shapiro-Wilkovho testu s hladinou alfa nastavenou na 0,05. Porovnania medzi dvoma skupinami boli analyzované pomocou Studentovho t-testu (dvojchvostého) a tri skupiny alebo viac boli porovnané prostredníctvom jednosmernej ANOVA s Tukeyho post-hoc analýzou. Porovnanie pre krivky drôteného myografu sa vykonalo pomocou obojsmernej ANOVA.p<0.05 was="" used="" for="" statistical="" significance.="" all="" statistical="" analyses="" were="" performed="" using="" graphpad="" prism="" 7.0d="" (san="" diego,="" ca,="" usa).="" the="" actual="" values="" for="" all="" quantification="" results="" are="" listed="" in="" supplementary="" table="">