Časť 2: Renovaskulárne účinky anorganických dusičnanov po ischémii a reperfúzii obličiek

Pre viac info. kontakttina.xiang@wecistanche.com

3. Výsledky

3.1. Suplementácia dusičnanov zvyšuje markery biologickej aktivity NO a zmierňuje renálnu dysfunkciu po IR

Hladiny dusičnanov a dusitanov boli zvýšené a cGMP mala tendenciu sa zvyšovať u myší po liečbe dusičnanmi (obr. 1A-C). Renálna dysfunkcia, vyjadrená zmenami v BUN a GFR, bola tiež zlepšená nitrátmi (obr. 1D a E).

3.2. Dusičnany zoslabujú odozvu krvného tlaku a renálne hladiny Ang II po IR

Po dvoch týždňoch reperfúzie bol krvný tlak mierne zvýšený v IR skupine v porovnaní s falošne operovanými kontrolami. Liečba nitrátmi zabránila tomuto zvýšeniu krvného tlaku (obr. 2A-C). Aby sme preskúmali súvislosť so zmenami v systéme renín-angiotenzín, merali sme hladiny Ang II v plazme aobličkové tkanivá. Naše údaje ukazujú, že Ang II v plazme bol medzi skupinami podobný, zvýšený v ischemickej obličke, ale významne sa nezmenil v neischemickej obličke (obr. 2D-F). Dusičnan zabránil zvýšeniu AngⅡ v obličkových tkanivách po IR, čo môže prispieť k jeho účinkom na krvný tlak.

Kliknutím získate ďalšie informácie. o cistanche benefitoch

3.3. Dusičnan zlepšuje renálne histopatologické zmeny, zápal a apoptózu po IR

Ďalej sme analyzovali renálne histopatologické zmeny po IR pomocou farbenia H&E a PAS. IR skupina vykazovala hlboké glomerulárne poškodenie kombinované s tubulárnou nekrózou v porovnaní s falošne operovanými kontrolami (obr. 3A-F a tabuľka 1). IR myši liečené nitrátom mali významne menšie histopatologické zmeny, ako je zrejmé z menšej tvorby odliatku, nekrózy, prasknutia ektázie tubulárnej bazálnej membrány a viac tubulárnej regenerácie a nekrotických tubulov v regenerácii (obr. 3A-F a tabuľka 1). Okrem toho imunofarbenie F4/80 ukázalo podstatnú infiltráciu makrofágov v ischemickej obličke po IR, ktorej sa zabránilo ošetrením dusičnanmi (obr. 4A a B). Farbenie TUNEL na detekciu apoptózy bolo významne zvýšené po IR poranení, ktoré bolo opäť významne znížené dusičnanmi (obr. 4C a D)[6].

3.4 Dusičnan zlepšuje poškodenie mitochondrií po IR obličiek prostredníctvom mechanizmov, ktoré oživujú obnovenie hladín proteínu TFAM

Renálne mitochondriálne abnormality a dysfunkcia spojené s nadmernou produkciou ROS sa podieľajú na patogenéze renálneho dávkovania. vrátane AN [27.28]. Naše údaje ukazujú, že mitochondriálny transkripčný faktor A (TFAM), ktorý je kľúčovým regulátorom expresie mitochondriálnych génov [29], bol v IR obličke významne znížený (Hg.5A-C). Liečba dusičnanmi nebola spojená so žiadnymi významnými zmenami v TFAM v IR obličke, ale zvýšila jeho expresiu v neischemickej obličke po IR (obr. 5A-C).

3.5. Liečba dusičnanmi zmierňuje kontraktilitu interlobárnych artérií a aferentných artérií po renálnom R indukovanú Ang II

Ďalej sme použili myografickú techniku ​​na vyhodnotenie účinkov IR na vaskulárnu funkciu vo veľkých intrarenálnych cievach ľavej obličky po reperfúzii. Kontraktilita na fenylefrín sa medzi experimentálnymi skupinami významne nelíšila (obr. 6A). Avšak kontraktilita indukovaná Ang I bola významne zvýšená v IR obličke (Hg.6B), čomu sa zabránilo liečbou dusičnanmi. V izolovaných a perfundovaných aferentných arteriolách (obr. 6C) bola citlivosť a maximálna kontraktilná odozva na Ang II zvýšená aj v IR obličke, čomu do značnej miery zabránila liečba dusičnanmi (1, 6D).

3.6.Fypoxia-treoxygenation-zabezpečená bunková apoptóza a mi chandndl abnormality v glomerulárnych endotelových bunkách sú zlepšené nitie

V ďalších štúdiách cievneho mechanizmu. zamerané na napodobňovanie in vivo IR modelu sme použili GEC. V tejto bunkovej štúdii sme na obídenie použili dusitany namiesto dusičnanov, čo je prvý krok v ceste dusičnan-dusitan-NO, ktorá vyžaduje komenzálne baktérie in vivo. Hypoxia nasledovaná reoxygenáciou v GEC znížila životaschopnosť buniek/zvýšila mortalitu (Fg. 7A a B).

Toto bolo spojené so zvýšenými hladinami štiepenej kaspázy-3, zníženou expresiou mitochondriálneho komplexu IⅡ a TFAM (obr. 7C-G) a produkciou mitochondriálneho ROS, ako naznačuje MitoSox (obr. 7H). Všetky tieto abnormality spojené s hypoxiou a reoxygenáciou sa zlepšili súčasnou liečbou dusitanmi.

Naše in vivo údaje ukázali, že IR-indukované vaskulárne poranenia a dysfunkcia boli spojené so zvýšenými renálnymi hladinami Ang II a citlivosťou (obr. 2E a 6B a D). V prítomnosti Ang I hypoxia-reoxygenácia znížila životaschopnosť buniek a ďalej zvýšila mitochondriálne Produkcia ROS (obr. S1 a obr. 8), ktorá bola opäť znížená úpravou dusitanmi.

3.7. Ochranné účinky dusitanov po hypoxii-reoxygenácii v glomerulárnych endoteliálnych bunkách sa rušia inhibíciou xantínoxidoreduktázy

XOR je považovaný za jeden z kľúčových enzýmov podieľajúcich sa na redukcii dusitanov na NO a iné bioaktívne druhy oxidov dusíka. Tu ukazujeme, že v prítomnosti selektívneho inhibítora XOR febuxostatu boli priaznivé účinky dusitanov na životaschopnosť buniek, expresiu TFAM a mitochondriálne ROS (obr. 9A-D) po hypoxii-reoxygenácii kombinovanej s Ang I v GEC zrušené. Údaje o životaschopnosti buniek v neprítomnosti Ang II v skupine s vehikulom sú znázornené na obrázku S2.

4. Diskusia

V tejto štúdii demonštrujeme, že ošetrenie anorganickými dusičnanmi bezprostredne predrenálna ischémiavýznamne znižuje glomerulárne a tubulárne poškodenia, ako aj stratu funkcie obličiek po 2 týždňoch reperfúzie. Tieto priaznivé účinky dusičnanov sú spojené s tlmenými zápalovými odpoveďami a odpoveďami angiotenzínu II, spojenými s moduláciou mitochondriíoxidačný stresa životaschopnosť buniek.

Toto je prvý opis toho, ako posilnenie dráhy dusičnanov-dusitanov-NO pred ischemickou príhodou môže chrániť obličku pred následnou renálnou a endoteliálnou dysfunkciou a poraneniami súvisiacimi s reperfúziou.

Generácia NO odvodená od NO je životne dôležitá pre mnohé kardiovaskulárne arenálnych funkciívrátane modulácie krvného tlaku a autoregulácie obličiek, ako aj manipulácie s tubulárnym elektrolytom [30-32]. Avšak v podmienkach s nízkou tenziou kyslíka a nízkym pH je tento enzymatický systém narušený, čo vedie k nedostatku NO alebo dokonca k odpojeniu NOS, čo zvyšuje produkciu reaktívnych foriem kyslíka [6,30]. Alternatívna cesta dusičnan-dusitan-NO je nezávislá od systému NOS a možno ju podporiť prostredníctvom našej každodennej stravy. Dôležité je, že účinnosť dráhy dusičnan-dusitan-NO je výrazne zvýšená v podmienkach s ischémiou alebo hypoxiou, keď je ohrozený systém NOS [9,33]. Experimentálne a klinické štúdie preukázali priaznivé kardiovaskulárne účinky suplementácie nitrátov, vrátane zlepšenia endotelovej funkcie a zníženia krvného tlaku u normotenzných a hypertenzných jedincov [1]. Už sme predtým ukázali, že renálna mikrovaskulatúra vynikajúco reaguje na vazodilatáciu sprostredkovanú dusitanmi [23], najmä počas kyslých podmienok a podmienok s nízkym obsahom kyslíka, ktoré napodobňujú in vivo ischemické prostredie [20]. Celkovo tieto zistenia naznačujú, že liečba dusičnanmi môže byť spojená s ochranou orgánov po IR.

Predchádzajúce štúdie s použitím dusitanových intervencií priniesli trochu protichodné výsledky, pokiaľ ide o jeho terapeutickú hodnotu v modeloch poranenia IR na hlodavcoch [16,17,34,35]. Triptatara a kol. ukázali, že akútne renálne lokálne podanie dusitanu (30 nmol) chráni obličky potkana pred 60 minútovou bilaterálnou ischémiou a 6-hodinovým reperfúznym poranením a dysfunkciou in vivo, aspoň čiastočne, prostredníctvom XOR- závislá produkcia NO [16]. Použitím myšieho transgénneho prístupu, zistenia Milsom et al. naznačil, že eNOS je kľúčovým hráčom tým, že prispieva k zníženiu dusitanov počas IR, čím sprostredkúva ochranu [35]. V zhode, Cantor a kolegovia ukázali, že akútne systémové podávanie dusitanov (0.172 nasledované 0,057 mg/h/kg) významne zlepšilo renálnu reoxygenáciu a reperfúziu po unilaterálnej ischémii (45 min) a 60 min reperfúzii u potkanov [ 34]. Na rozdiel od toho Basireddy et al. nepozorovali žiadne ochranné účinky akútneho systémového podávania dusitanov (0,{19}} nmol/g/kg) u potkanov podrobených jednostrannej nefrektómii, po ktorej nasledovala 45 minútová ischémia zvyšnej obličky a 24-48 h reperfúzia [17]. Možnými vysvetleniami týchto nezrovnalostí môžu byť rôzne experimentálne prístupy (tj IR model, trvanie IR období), dávkový režim, spôsob podávania a rozdiely medzi druhmi. V súčasnosti je menej poznatkov o terapeutickej hodnote používania anorganických dusičnanov namiesto dusitanov. Dusičnany sa môžu bezpečne podávať vo vyšších dávkach ako dusitany a majú oveľa dlhší polčas rozpadu (6 h oproti 30 min), čo umožňuje kontinuálnu tvorbu dusitanov, NO a iných bioaktívnych oxidov dusíka počas oveľa dlhšieho obdobia. V tomto kontexte možno dusičnan považovať za prekurzor pre kontinuálnejšiu tvorbu dusitanov.

V predchádzajúcej štúdii na myšiach sme ukázali, že predbežná liečba dusičnanmi v potrave počas 2 týždňov chránila obličky pred poškodením IR prostredníctvom mechanizmov, ktoré zahŕňajú moduláciu fenotypu imunitných buniek a antioxidačné vlastnosti [18]. Namiesto napodobňovania scenára chronického vysokého príjmu dusičnanov súčasná štúdia testovala účinky akútneho podania pred ischemickým inzultom. Tento prístup je atraktívnejší z klinického a terapeutického hľadiska, pretože by sa mohol podobať akútnej intervencii pred ischémiou u pacienta s rizikom rozvoja AKI. Naša súčasná štúdia naznačila, že akútna liečba dusičnanmi, po ktorej nasledovala nepretržitá suplementácia dusičnanov počas 2 týždňov, významne zvýšila hladiny dusičnanov, dusitanov a cGMP v obehu. Morfologická analýza ukázala, že liečba dusičnanmi zlepšila poranenia vyvolané IR v porovnaní s neošetrenými IR kontrolami. Spolu so znížením štrukturálneho poškodenia obličiek liečba dusičnanmi zachovala funkciu obličiek po poranení IR. Pretože plazmatický kreatinín sa zvyčajne vráti na normálne hladiny jeden týždeň po reperfúzii [36,37, merali sme BUN a GFR, aby sme zhodnotili funkciu obličiek po 2 týždňoch reperfúzie. GFR a BUN sa významne nezmenili po IR v porovnaní s falošne operovanými kontrolami, čo sa pravdepodobne vysvetľuje kontralaterálnou kompenzačnou obličkou. Naše údaje však ukazujú, že oba tieto parametre boli významne zlepšené dusičnanmi v porovnaní s neliečenou IR skupinou.

Zápalové reakciea bunková apoptóza sú kľúčové biologické procesy počas IR poškodenia, ktoré prispievajú k odstraňovaniu bunkového odpadu a adekvátnej oprave tkaniva [18,24]. Predĺžený a nevyriešený zápal však môže ešte viac zhoršiť poškodenie tkaniva [7,38,39].Zápal obličiek, ako sa detegovalo farbením F4/80 infiltrácie makrofágov, bola významne znížená dusičnanmi po IR. To je v súlade s nedávno publikovanými štúdiami Yang et al. [18] a Khambata a kol. [40] Okrem toho test TUNEL na apoptózu objasnil, že poškodenie IR zvýšilo apoptózu buniek v myšej ischemickej obličke, ktorej sa čiastočne zabránilo liečbou dusičnanmi. Celkovo tieto výsledky jasne naznačujú, že liečba dusičnanmi môže inhibovať zápal obličiek a apoptózu buniek, ktoré sa vyskytujú po IR.

Hromadné dôkazy ukazujú, že mitochondriálna dysfunkcia významne prispieva k rozvoju AKI po IR, a preto nové prístupy, ktoré modulujú mitochondriálnu funkciu, môžu mať terapeutickú hodnotu [41-45]. Napríklad v ischemickej obličke sú mitochondrie v endotelových bunkách významne zmenené funkčne aj morfologicky a stávajú sa extrémne reaktívnymi a poškodzujú seba aj okolité mitochondrie [44]. Už skôr sme ukázali, že dusičnany z potravy zlepšujú mitochondriálnu účinnosť u ľudí [46]. Stimulácia dráhy dusičnan-dusitan-NO bola v niekoľkých nedávnych experimentálnych štúdiách spojená s priaznivými účinkami na mitochondriálne funkcie počas metabolických porúch, vrátane diabetu 2. typu, prostredníctvom mechanizmov, ktoré zahŕňajú tlmenie oxidačného stresu [47]. Shiva a kolegovia navyše preukázali, že pre- aj akútna liečba anorganickými dusitanmi má cytoprotektívne účinky a potenciálne obmedzuje reperfúzne poškodenie srdca a pečene prostredníctvom modulácie transportného reťazca elektrónov v mitochondriách a redukcie ROS [48]. V našom in vivo IR modeli sa TFAM zvýšil v neischemickej obličke, ale významne sa nezmenil v ischemickej obličke. Vzhľadom na to, že dusitany obnovili expresiu TFAM in vitro po hypoxii-reoxygenácii, predpokladáme, že by to mohlo súvisieť s časovo závislými rozdielmi v expresii. V modeli in vivo sa analýza TFAM uskutočnila až po 2 týždňoch a je možné, že by to bolo iné v skoršom časovom bode po reperfúzii.

Je všeobecne známe, že zvýšená signalizácia Ang I stimuluje NADPH oxidázu a produkciu ROS odvodenú od mitochondrií, čo vedie k oxidačnému stresu [49-51]. Cao a kolegovia ukázali, že reno-cerebrálny reflex aktivoval renín-angiotenzínový systém po IR, čo podporovalo oxidačný stres a progresiu renálnych poranení [52]. Už predtým sme demonštrovali, že liečba dusičnanmi tlmí kontraktilitu sprostredkovanú Ang I v renálnych aferentných arteriolách a hypertenziu prostredníctvom mechanizmov, ktoré zahŕňajú zníženie sympatickej hyperaktivity a tlmenie oxidačného stresu, ako aj zníženú expresiu receptora Ang typu 1 [{{7} }]. V súlade s predchádzajúcimi zisteniami naše údaje ukazujú, že liečba dusičnanmi znižuje krvný tlak, ktorý bol spojený s nižšími hladinami Ang II v obličkách po IR a tlmením kontraktility sprostredkovanej Ang IⅡ v interlobárnych artériách aj aferentných arteriolách.

Pretože abnormality endotelových buniek po IRis sú úzko spojené s poraneniami obličiek a zníženou funkciou obličiek, ďalej sme použili glomerulárne endotelové bunky (GEC) na mechanické štúdie. Na napodobnenie scenára IR in vivo sa použil in vitro model hypoxie-reoxygenácie so súčasným ošetrením dusičnanmi a bez neho. Naše výsledky in vitro ukazujú, že hypoxia-reoxygenácia zvýšila úmrtnosť buniek, produkciu mitochondriálnych ROS a štiepenú kaspázu-3, znížila životaschopnosť buniek a proteínovú expresiu komplexu OXPHOS I a TFAM. Všetky tieto abnormálne zmeny výrazne zlepšili dusitany.

Pretože naše údaje in vivo ukázali, že hladiny Ang I boli zvýšené v obličkách po IR, študovali sme tiež účinky liečby dusitanmi v GEC po hypoxii-reoxygenácii v prítomnosti Ang. Naše údaje ukazujú, že hypoxia-reoxygenácia v kombinácii s Ang I ďalej znížila životaschopnosť buniek a zvýšila mitochondriálnu produkciu ROS, čomu sa opäť zabránilo súčasným ošetrením dusičnanmi.

Počas normoxie a normálneho pH sa NO odvodený od NOS oxiduje na dusitany a dusičnany, ale počas hypoxie a kyslých podmienok sa dusitany môžu redukovať späť na NO pôsobením nitritreduktázy XOR. Spoločná inkubácia so selektívnym inhibítorom XOR febuxostatom zrušila ochranné účinky dusitanov po hypoxii-reoxygenácii v GEC. Tieto údaje naznačujú, že XOR katalyzuje redukciu dusitanov na NO, čo zase sprostredkováva ochranu buniek pred poškodením vyvolaným hypoxiou-reoxygenáciou.

Niektoré obmedzenia súčasnej štúdie zahŕňajú, že nebola zahrnutá skupina so samotnými dusičnanmi u simulovane operovaných zvierat. Hlavným dôvodom bolo to, že predchádzajúce štúdie na normálnych potkanoch a myšiach nepozorovali žiadne výrazné účinky pri použití podobných dávok dusičnanov na krvný tlak, funkciu obličiek alebo vaskulárnu reaktivitu. Ďalším obmedzením je, že všetky in vivo charakterizácie sa uskutočnili až po dvoch týždňoch reperfúzie. Dodatočné časové body mohli potenciálne vygenerovať mechanickejší pohľad.

Záverom možno konštatovať, že akútna liečba anorganickými dusičnanmi pred príhodou renálnej ischémie, po ktorej nasleduje nepretržitá diétna liečba dusičnanmi počas dvoch týždňov reperfúzie, chránená pred renálnou dysfunkciou a poraneniami prostredníctvom mechanizmov, ktoré zahŕňajú zníženie infiltrujúcich zápalových buniek a hladiny angiotenzínu I v ischemickej chorobe. obličiek, ako aj moduláciu mitochondriálnej funkcie. Budúce klinické štúdie môžu objasniť, či intervencie s anorganickými nitrátmi môžu poskytnúť priaznivé účinky u pacientov s vysokým rizikom získania poškodenia obličiek IR.