Fenyletanolové glykozidy z Cistanche Tubulosa potláčajú aktiváciu pečeňových hviezdicových buniek a blokujú vedenie signálnych dráh v TGF-01/smad ako potenciálne látky proti hepatálnej fibróze
Mar 05, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Shu-Ping You, Long Ma, Jun Zhao, Shi-Lei Zhang a Tao Liu
Abstrakt: Cistanche tubulosaje tradičný čínsky bylinný liek široko používaný na reguláciu imunity afenyletanoidové glykozidy(CPhG) patria medzi primárne zložky zodpovedné za túto činnosť. Predchádzajúce štúdie naznačili preventívne a terapeutické účinky CPhG na pečeňovú fibrózu u potkanov indukovanú hovädzím sérovým albumínom (BSA). Cieľom štúdie bolo zhodnotiť účinok CPhG a monomérov proti fibróze pečeneechinakozidaakteozidinhibíciou aktivácie hepatických hviezdicových buniek (HSC), blokovaním vedenia signálnych dráh v transformačnom rastovom faktore-p1 (TGF-p1)/smad, a určiť, že majú in vitro hepatoprotektívnu aktivitu. Proliferácia HSC bola zjavne inhibovaná po liečbe CPhG (100,50 ug/ml)/echinakozid (500,250,125 ug/ml)/akteozid (6,3 ug/ml), s hodnotami IC50 119,125,520,399 a g v MTT teste. Rôzne koncentrácie CPhG/echinakozid/akteozidneovplyvnil bunkovú toxicitu na HSC podľa meraní laktátdehydrogenázy (LDH). Rôzne koncentrácie CPhG/echinakozid/akteozidzvýšili hladinu mRNA a proteínovú expresiu smad7 a znížili hladiny mRNA smad2, smad3 a proteínovú expresiu smad2, fosfo-smad2 (p-smad2), smad3, fosfo-smad3 (p-smad3) v HSC. V súhrne tieto výsledky ukazujú, že CPhGs/echinakozid/akteozidmôže blokovať vedenie signálnych dráh v TGF-p1/smad a inhibovať aktiváciu HSC, čo naznačuje, žeC. tubulosamôže byť teda potenciálnym rastlinným liekom na liečbu fibrózy pečene.
Kľúčové slová: Cistanche tubulosa; fenyletanolové glykozidy zCistanche(CPHG);echinakozid; akteozid; pečeňové hviezdicové bunky (HSC); TGF-pl/smad
1. Úvod
sa stanú proliferatívnymi a fibrogénnymi, následne akumulujú ECM a nakoniec sa diferencujú na fibrogénne bunky podobné myofibroblastom. Transformujúci rastový faktor-1 (TGF-p 1) sa považuje za hlavný profibrogénny mediátor. Signálna dráha súvisiaca s TGF-&1 je dôležitým mechanizmom hepatálnej fibrózy a zahŕňa hlavne signalizáciu závislú od smad a nezávislú od smad a signálna transdukčná dráha závislá od smad sa považuje za hlavný kanál signalizácie TGF-p1. . Blokáda signálnej dráhy TGF-p1/smad preto môže potlačiť produkciu kolagénu a prípadne zmierniť fibrózu pečene, vďaka čomu sa táto dráha v posledných rokoch stala dôležitým cieľom výskumu liekov proti fibróze pečene.
Napriek vysokej celosvetovej incidencii hepatálnej fibrózy nie je dostupná žiadna všeobecne akceptovaná antifibrogénna liečba [2–4]. Tradičné čínske bylinné lieky (TCHM) sú veľmi zaujímavé na liečbu porúch pečene, pretože niektoré môžu byť použité ako terapeutické lieky pri liečbe a prevencii fibrózy pečene. V súčasnosti sa veľa štúdií zameriava na potenciálne antifibrogénne liečivá, ktoré sa ako TCHM používajú už tisíce rokov [5].
Parazitická rastlina Cistanche tubulosa W (čeľaď Orobanchaceae)fa, je široko pestovaná v južnom regióne Xinjiang v Číne [6]. Ľudia ho používajú na povzbudenie obličiek, výživu krvi, uvoľnenie čriev a oddialenie starnutia bez vedľajších účinkov a je oficiálne uvedený v Čínskom liekopise [7]. C. tubulosa obsahuje rôzne aktívne zložky, vrátane fenyletanoidných glykozidov (CPhG), iridoidov a polysacharidov. Medzi mnohými aktívnymi zložkami v C. tubulous sú CPhGs, ktoré majú množstvo bioaktivít (antioxidant, proti únave, rádiorezistencia, atď.), hlavné charakteristické zložky tejto rastliny. V posledných rokoch sa uvádza, že CPhGi majú nadmerné hepatoprotektívne účinky Hent a môžu zachytávať stromové radikály, chrániť pečeňové membrány a prejavovať imunoregulačné účinky, inhibíciu apoptózy, inhibíciu expresie povrchového antigénu hepatitídy B (HBs Ag) a hepatitídy B replikačná aktivita DNA antigénu (HBeAg) a vírusu hepatitídy B (HBV) atď. Hladina DNA HBV je najspoľahlivejším indexom, ktorý priamo odráža aktivitu replikácie vírusu, ktorá je kľúčovým faktorom pri určovaní prirodzenej histórie chronických infekcií HBV, sledovanie účinku oP antivírusovej terapie a hodnotenie prognózy akútnych a chronických infekcií HBV. Sérologické detekčné indexy HBV zahŕňajú najmä HBsAg, HBeAg atď. [8–11]. Existuje však málo správ v literatúre o účinkoch CPhG proti fibróze pečene. Predchádzajúce štúdie naznačili preventívne a terapeutické účinky CPhG na pečeňovú fibrózu indukovanú hovädzím sérovým albumínom (BSA) u potkanov, ale antifibrogénna aktivita CPhG a jeho hlavných monomérov (echinakozid a akteozid, obrázok 1) nebola nikdy hodnotená in vitro.
organická Cistanche tubulosa
2. Výsledky
2.1. Kvantitatívne stanovenie CPhG
CPhG vC. tubulosaobsahujú IT dva fenyletylalkoholové glykozidy: echinakozid a akteostranu a ich obsah v CPhG bol zistený analýzou HPLC (obrázok 1) na 42,71 percenta 土 0,42 percent a 14,27 percenta 土 0.18 percent, resp.
2.2. Inhibičné aktivity CPhG, echinakozidu a akteozidu na HSC-T6
CPhG, echinakozid a akteozid (62.5-500 卩g/ml) inhibovali životaschopnosť buniek HSC v závislosti od koncentrácie. CPhGs a akteozid vykazovali pozoruhodnú inhibičnú aktivitu na HSC bunky, pričom 50-percentná inhibícia aktivity rastu buniek (IC50) bola 119,125 昭/ml a 6,999 昭/ml. Echinakozid vykazoval miernu inhibičnú aktivitu (IC50 520,345 昭/ml; tabuľka 1 a obrázok 2).
2.3. Bunková toxicita CPhG, akozidu Echin a Acteorida na HSC
Laktátdehydrogenáza (LDH), stabilný cytoplazmatický enzým prítomný vo všetkých bunkách, sa po poškodení plazmatickej membrány rýchlo uvoľňuje do supernatantu bunkovej kultúry. Enzýmová aktivita v supernatante kultúry koreluje s podielom lyzovaných buniek [12]. Ako je uvedené v tabuľke 2, pri liečbe rôznymi: koncentráciami C PhG, echinakozidu a akteozidu, hoci aktivita LDH vykazovala mierne zvýšenie v porovnaní s bunkovou koitrolnou skupinou, rozdiel nebol štatisticky významný (p > 0,05 ), čo naznačuje, že väčšina bunkových membrán si zachovala svoju integritu a inhibícia CPhG, echinakozidu a akteozidu na HSC nie je spôsobená nešpecifickou bunkovou toxicitou.
2.4. Účinok CPhG, Echinakozidu a Acteosde na proliferáciu HSC indukovanú TGF-^i
Proliferáciu, aktiváciu a diferenciáciu HSC reguluje množstvo faktorov. Spomedzi rôznych faktorov podieľajúcich sa na fibróze pečene je TGF{{0}} považovaný za najdôležitejší, pretože môže aktivovať HSC, podporovať diferenciáciu myofibroblastov, zvyšovať syntézu ECM a inhibovať degradáciu ECM a uvoľňovať chemokíny a cytokíny podieľajúce sa na fibróze pečene [13]. V tejto štúdii, s výnimkou kontrolnej skupiny, boli stacionárne HSC stimulované TGF-P1 in vitro, aby sa simulovala tvorba včasnej fibrózy pečene a aby sa preskúmal účinok CPhG, echinakozidu a akteozidu na TGF-p1-} indukovaná proliferácia HSC. Ako je uvedené v tabuľke 3, v porovnaní s kontrolnou skupinou skupina s TGF-61 významne podporovala proliferáciu HSC (p < 0.01).="" v="" porovnaní="" so="" skupinou="" tgf-p1,="" tgf-p1="" plus="" cphg="" (tc)="" (50,100="" 卩g/ml,="" p="">< 0,05),="" tgf{{18}="" }="" plus="" echinakozid="" (te)="" (125,="" 250,="" 500="" µg/ml,="" p="">< 0,05),="" tgf-p1="" plus="" akteozid="" (ta)="" (3,0,="" 6,0="" µg/ml,="" p="">< 0,05)="" všetky="" pozoruhodne="" inhibovali="" proliferáciu="" hsc="" indukované="" tgf-|3="" 1="" v="" rôznej="">
2.5. Expresie mRNA smad2) smad3 a smad7 po intervencii CPhG, ochmakozidu a acteaside na HSC
Smad3 a smad2 sú kľúčové downstream efektory signálnej dráhy TTGF-p [14,15] a smad7 je inhibítor signálnej dráhy smad. Teoreticky môže zvýšená expresia smad7 alebo znížená expresia smad2/smad3 blokovať vedenie signálnych dráh v TGF-p1/smad. Ako je znázornené na obrázku 3, kvantitatívna PCR analýza v reálnom čase ukázala, že expresia mRNA smad2 a smad3 indikovala nižšiu hladinu, zatiaľ čo smad7 indikovala vyššie hladiny v kontrolnej skupine v porovnaní so skupinou TGF-|31. V skupine TC (25, 50, 75,100 |dg/mL) hladina mRNA smad2 (p < 0.{{37="" }}5)="" a="" smad3="" (p="">< 0,01)="" boli="" významne="" znížené="" v="" porovnaní="" so="" skupinou="" tgf-pf="" a="" boli="" dokonca="" podobné="" kontrolnej="" skupine;="" medzitým="" bola="" hladina="" mrna="" smad7="" významne="" zvýšená="" v="" skupine="" tc="" (50,="" 75="" 100="" µg/ml)="" (p="">< 0,05,="" p="">< 0,05,="" p="">< 0,01).="" avšak;="" expresia="" smad7="" indikovala="" vzostupný="" trend="" v="" skupine="" tc="" 25="" µg/ml="" v="" porovnaní="" so="" skupinou="" tgf-p1="" (obrázok="">
Medzitým, v porovnaní so skupinou TGF-p1, bola expresia mRNA smad2 a smad3 významne znížená v TE (62,5, 125, 250, 500 卩g /ml) skupina (p < 0.01)="" a="" expresia="" smad7="" mrna="" sa="" významne="" zvýšila="" v="" skupine="" te="" (125,="" 250="" 500="" 昭/ml)="" (p="">< 0,01)="" (obrázok="" 4)="" .="" podobne="" skupina="" ta="" (0,75,="" 1,5,="" 3,0,="" 6,0="" ^g/ml)="" tiež="" vykazovala="" rovnaký="" trend="" (obrázok="">
2.6. Vplyv CPhG, echinakozidu a Ac)eozidov na signálnu dráhu T GF-^i/smad v HSC
Signálna dráha TGF-p 1/smad závisí od smad2, smad3, fosfo-smad2 (p-smad2), fosfo-smad3 (p-smad3) a smad7, kde p-smad2, p-smad3 sú aktivované formy smad2 a smad3. V tejto štúdii sa analyzovali hladiny proteínov omad2, smad3, p-smad2, p-smsd3 a smad7. Analýza Western blot detekovala zvýšenie hladín smad2, smad3, p-smad2, p-smad3 prostredníctvom TGF-p1 a inhibíciu týchto zvýšení pomocou CPhG, ekhinakozidu a akteozidu; medzitým analýza wesiern blot odhalila up-regulované hladiny smad7 prostredníctvom CPhG, echinakozidu a akteozidu. (obrázky 6-8).
Ako je znázornené na obrázku 6, v porovnaní so skupinou c on2rol (proteínové expresie smad2, smad3, p-smad2, p-smad3 boli významne zvýšené a expresia proteínu smad7 bola znížená v skupine TGF-p1. V TC (25 , 50, 75, 100 昭/ml) liekových skupín, smad/ (obrázok 6A), p-smad2 (obrázok 6B), smad 3 (obrázok 6C), p -smad3 (Obrázok 6D) expresie boli významne nižšie ako v skupine TGF-p1 (卩 < 0,01) a expresia proteínu smad7 (obrázok 6E) bola vyššia ako v skupine TGF-S1 (p < 0,01) (obrázok 6).
Zároveň sa merali expresie proteínu smad 2, smad3, p-smad2, p-smad3 a smad7 po echinakozidovej a akteozidovej intervencii na HSC. Ako je znázornené na obrázkoch 7 a 8, hladiny expresie proteínov smad2, smad3, p-smad2 a p-smad3 boli významne inhibované (p < 0.05="" alebo="" p="">< 0,01="" ),="" hladina="" expresie="" proteínu="" smad7="" bola="" zvýšená="" (p="">< 0,01)="" v="" porovnaní="" so="" skupinou="" tgf-p="" 1="" (obrázky="" 7="" a="">
3. Diskusia
Fibróza pečene je jednou z hlavných príčin morbidity a mortality na celom svete, ale v súčasnosti sú pre tento stav k dispozícii veľmi obmedzené terapeutické možnosti, preto je pre nás veľmi dôležité hľadať potenciálne ciele pre terapeutickú intervenciu, aby sa zabránilo rozvoju fibrózy pečene [ 16]. Nedávno výskumníci zistili, že rôzne bylinné lieky majú hepatoprotektívne alebo antifibrotické účinky. Mnohé TCHM, ako sú pilulky Fufang Biejia Ruangan [17] a odvar Xiao-chai-hu (shosaiko to v Japonsku) [18,19] sa široko používajú na liečbu fibrózy pečene v Číne, Kórei a Japonsku po tisíce rokov. C. tubulosa obsahuje rôzne aktívne zložky vrátane CPhG, iridoidov a polysacharidov. Ako jeden z účinných materiálových základov C. tubulosa majú CPhG vynikajúcu hepatoprotektívnu aktivitu, ale existujú obmedzené informácie o antifibrotických účinkoch GPhC a jeho príbuzných zlúčenín. V tejto štúdii sme skúmali, ako CPhG, echinakozid a akteozid potláčajú aktiváciu HSC a blokujú vedenie signálnej dráhy v TGF-p1/snaad ako potenciálnych antihepatických fibróznych činidlách in vitro.
Poškodenie pečene akejkoľvek etiológie nakoniec povedie k aktivácii HSC, ktoré podliehajú transdiferenciácii na fibrogénne bunky podobné myofibroblastom [20]. To znamená, že myofibroblasty
sú odvodené od aktivácie a proliferácie HSCs [21] a považuje sa za mediátor tvorby fibrózy pečene. Z tohto dôvodu sme vykonali štúdie in vitro na porovnanie miery životaschopnosti buniek HSC vystavených CPhG, echinakozidu a akteozidu. Výsledky ukázali, že inhibičný účinok akteozidu na HSC bol najsilnejší a účinok CPhG bol lepší ako účinok echinakozidu. Všetky CPhG, echinakozidové a akteozidové séra inhibovali proliferáciu HSC spôsobom závislým od dávky.
LDH je cytoplazmatický enzým v živých bunkách a za normálnych okolností nemôže preniknúť cez bunkovú membránu. Keď sú bunky poškodené, zvyšuje sa priepustnosť membrány a LDH sa uvoľňuje do vonkajšieho prostredia bunky. LDH zvyčajne dokáže zistiť stupeň poškodenia buniek [{{0}}]. Skúmanie ukázalo, že aktivita LDH CPhG, echinakozidu a akteozidového séra vykázala len mierne zvýšenie v porovnaní s kontrolnou skupinou buniek a rozdiel nebol štatisticky významný (p > 0,05), čo naznačuje, že väčšina bunkovej membrány si zachovala svoju integritu. a inhibícia HSC CPhG, echinakozidom a akteozidom nie je spôsobená nešpecifickou bunkovou toxicitou.
Keď dôjde k poškodeniu pečene, aktivované hepatocyty môžu uvoľňovať TGF-pi, ktorý následne aktivuje HSC-T6, preto má TGF-pi úzky vzťah s fibrózou [25-27]. V tejto štúdii by sa CPhG, echinakozid a akteozid mohli považovať za atraktívnu terapeutickú stratégiu na inhibíciu proliferácie HSC po stimulácii HSC pomocou wTGF-pi in vitro. Predpokladáme, že CPhG, echinakozid a akteozid môžu byť použité ako druh liečby a/alebo prevencie fibrózy pečene a inhibujú tvorbu skorej fibrózy pečene. Vznik hepatálnej fibrózy je komplexný proces multifaktorového a multibunkového postihnutia. V tomto patologickom procese interakcie bunka-bunka, bunka-cytokíny a bunka-matrix tvoria ťažkopádnu sieť. V tejto sieti môže byť rozvoj hepatálnej fibrózy regulovaný rôznymi signálnymi dráhami a prostriedkami. TGF-pi je klasickým aktivátorom HSC a kľúčovým mediátorom v patogenéze fibrózy pečene [28]. CPhG, echinakozid a akteozid môžu inhibovať expresiu mRNA a proteínov súvisiacich s dráhou TGF-pi/smad v HSC.
TGF-pi uplatňuje svoje bunkové účinky prostredníctvom signálnej dráhy smad a považuje sa za kľúčového mediátora pri rozvoji fibrózy pečene a zápalu. Po naviazaní TGF-pi na receptor TGF-p-typu II kináza receptora typu II fosforyluje GS doménu receptora TGF-p typu I, čo vedie k aktivácii receptora typu I [29]. Pôsobením p-smad2 a p-smad3 na dva serínové zvyšky v motíve SSXS ich C-konca sa aktiváciou receptora typu I aktivujú reakcie za signálnou dráhou smad [30]. P-smad2 a p-smad3 tvoria oligomérne komplexy so smad4, potom vstupujú do jadra a prejavujú svoju biologickú transkripčnú aktivitu. Smad proteíny teda prenášajú signály priamo z receptorovej kinázy do jadra [3i]. Na druhej strane, smad7 je pevne spojený s TGF-pi receptorom, čo vedie k neschopnosti aktivovať smad 2/3, ako aj k inhibícii signálnych transdukčných dráh [32]. Smad7 môže pôsobiť tak, že inhibuje p-smad2 a p-smad3, jadrovú translokáciu aktivovaných komplexov smad a aktiváciu (CAGA) (9)-MLP-Luc, čo vedie k zníženiu expresie kolagénu I a úplnej inhibícii prenosu signálu TGF-p [33,34]. Naše výsledky ukázali, že CPhG, echinakozid a akteozid môžu znížiť expresiu mRNA smad2 a smad3 a zvýšiť expresiu mRNA smad7; inhibujú expresiu proteínov smad2, p-smad2, smad3 a p-smad3 a zvyšujú expresiu proteínu smad7, čo naznačuje, že CPhG, echinakozid a akteozid tiež zohrávajú úlohu pri inhibícii aktivácie HSC, a tým inhibujú pečeňovú fibrózu, čo poukazuje na potenciálnu antifibrotikum mechanizmus.
Ukázalo sa, že sekvencia hepatoprotektívnych účinkov troch testovacích činidiel je akteozid > CPhG > echinakozid. Aby sa ďalej objasnili dôvody rozdielov v mechanizme, ktorým CPhG, echinakozid a akteozid chránia pred fibrózou pečene, analyzovali sa ich chemické štruktúry. Fenetylalkoholová glykozidová časť sa zdá byť základnou štruktúrou pre hepatoprotektívny účinok [35]. Akteozid (C29H36Oi5) je dvojitý glykozid a echinakozid (C35H46O20) je triglykozid, tj echinakozid má vo svojej štruktúre v porovnaní s akteozidom extra glykozid, čo vedie k zväčšeniu jeho priestorovej veľkosti. Hepatoprotektívna alebo inhibícia HSC aktivity akteozidu je lepšia ako u echinakozidu, čo môže byť spôsobené existenciou stérickej zábrany.
chrániť pečeň: extrakt z cistanche
4. Experimentálna časť
4.1. Chemikálie a činidlá
TGF-pi bol zakúpený od Peprotech (Rocky Hill, NJ, USA). Bunková línia HSC-T6 bola zakúpená od Wuhan Procell Gene Bio-technology Co., Ltd. (Wuhan, Čína). Dimetylsulfoxid (DMSO) bol zakúpený od Sigma Inc. (St. Louis, MO, USA). Priméry Smad2, smad3 a smad7 vyrobila spoločnosť Shanghai Sangon Biological and Technological Company (Shanghai, Čína). Súprava na syntézu prvého vlákna cDNA Revert Aid bola zakúpená od Thermo Scientific (Shanghai, Čína). Zelená PCR súprava Quantifast SYBR bola zakúpená od QIAGEN GmbH (Hilden, Nemecko). p-smad2 (ser465/467) protilátka, Smad3 (C67H9) králičia mAb a p-smad3 (ser423/425) králičia mAb boli zakúpené od Cell Signaling Technology (Boston, MA, USA). Protilátka Smad7 bola zakúpená od spoločnosti Boster (Wuhan, Čína). Polyklonálna protilátka Smad2 a monoklonálna protilátka p-aktínu boli zakúpené od Proteintech (Wuhan, Čína). Detekcia primárnej protilátky sa uskutočňovala s použitím 2-stupňového roztoku protilátky (Alk-Phos. konjugovaný, anti-králičí) a 2-stupňového roztoku protilátky (Alk-Phos. konjugovaný, anti-myš) zakúpeného od Invitrogen™ (Carlsbad, CA, USA). Testovacia súprava laktátdehydrogenázy bola od Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Čína).
4.2. Rastlinný materiál
C. tubulosa bola zozbieraná z Tulufanu v autonómnej oblasti Xinjiang Uirghur v Číne v máji 2006. Rastlinné materiály identifikoval ako C. tubulosa Jiang He, Inštitút Materia Medica v Xinjiangu. Vzor poukážky bol uložený v Inštitúte Materia Medica v Xinjiangu v Číne.
4.3. Izolácia a purifikácia CPhG a jeho zlúčenín
Sušené a nakrájané podzemky C. tubulosa (6,{1}} kg) sa postupne trikrát extrahovali pod spätným chladičom so 70 percentným etanolom (4,8 l) a potom sa zo spojených extraktov odstránilo rozpúšťadlo. za získania etanolového extraktu (1,146 kg). Etanolové extrakty sa purifikovali pomocou AB-8 živice, čím sa získal surový fenyletanolglykozidový extrakt (CPhGs). Po rozpustení d vo vode sa extrakt čistil pomocou AB-8 adsorpčnej makroporéznej živicovej chromatografie, aby sa získali celkové fenyletanolové glykostrany z C. tubulosa (CPhGs, 210g). CPhG sa aplikovali na kolónu ODS OP{{10}} a eluovali sa postupne zmesami MeOH-H2.(0:1 -^1:0). Eluáty sa spojili do piatich podfrakcií podľa správania TLC s použitím systému rozpúšťadiel CHCh-MeOH-H2 (6:4:0,5). Škvrny sa vizualizovali po postriekaní 1 percentom FeCih. Rôzne frakcie sa opakovane čistili stĺpcovou chromatografiou na Sephadex LH-20 s metanolom ako eluentom a z CPhG sa izolovali dva fenyletanolglykozidy. Ich štruktúry boli potvrdené ako echinakozid (C35H46O20) a akteozid (C29H36O15) pomocou MS, 1H- a MC-NMR [35], ktorých čistoty boli pomocou UV-HPLC určené na 99,17 percent a 98,92 percent. Štruktúry echinakozidu a akteozidu sú znázornené na obrázku 9.
4.5. Kvantitatívne stanovenie CPhG
Kvapalinová chromatografia (HPLC) (LC{{0}}} HPLC prístroj, Shimadzu Co., Kyoto, Japonsko) sa použila na analýzu obsahu echinakozidu a cteozidu v CPhG. Použila sa kolóna Phenomenex Gemini ODS (250 x 4,6 mm, 5 |^m) pri 30 stupňoch. Izokratická mobilná fáza pozostávajúca z metanol-acetonitril{7}}-percentnej kyseliny octovej (15:10:75, obj./obj./obj.) sa použila počas 40 minút, pri prietoku 0,6 ml/min, s UV detekcia pri 334 nm.
4.6. Bunková kultúra
Bunky HSC sa kultivovali v Dulbeccovom modifikovanom Eaglovom médiu (vysoká glukóza) (DMEM, Peking, Čína) doplnenom 10 percentom fetálneho bovinného séra (FBS, Gibco, Carlsbad, CA, USA), 10 0 IU/ml penicilínu a 100 ug/ml streptomycínu (HyClone, Logan, UT, USA) vo zvlhčenom inkubátore pri 37 stupňoch s 5 percentami CO2. Tieto bunky sa pravidelne subkultivovali 0,25 percentným (1x) roztokom trypsínu (HyClone, Logan, UT, USA) a médium sa menilo každé 2 dni. Spočiatku sa bunky kultivovali s DMEM obsahujúcim 10 percent FBS počas 48 hodín. Médium sa potom nahradilo DMEM bez FBS, aby sa bunky vyhladovali počas 12 hodín. Tieto bunky sa množili počas 48 hodín a po 48 hodinách sa sérum nechalo vyhladovať s 0,5 percentným FBS počas 12 hodín pred pridaním 5 ng/ml TGF-&1,
4.7. Stanovenie hodnôt IC50
Po celonočnej inkubácii v hladnom médiu obsahujúcom {{0}}},5 % FBS boli bunky HSC nasadené na 96-jamkovú platňu v hustote 5 x 104 buniek/ml počas 24 hodín. Bunky HSC boli ošetrené CPhG, echinakozidom a akteozidom v rôznych koncentráciách (0, 3,90625, 7,8125, 15,625, 31,25, 62,5, 125, 250 a 500 ug/ml) počas 48 hodín. Každá koncentrácia mala štyri jamky. Na konci ošetrenia sa pridalo 20 µl MTT [3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazólium bromid] (Sigma; 5 mg/ml) a bunky sa inkubovali ďalšie 4 hodiny. Po odstránení supernatantu sa do každej jamky pridal DMSO (200 ul). Po trepaní doštičky počas 10 minút na trepačke sa získali hodnoty IC50 meraním absorbancie pri vlnovej dĺžke 490 nm pomocou prístroja na značenie enzýmov (Benchmark PLUS, Hercules, CA, USA), tento test sa uskutočnil trikrát. Hodnoty IC50 CPhG, echinakozidu a akteozidu boli 119,125, 520,345 a 6,999 Rg/ml.
4.8. Inhibičné účinky na bunkovú proliferáciu a životaschopnosť buniek
Bunky HSC boli vystavené rôznym koncentráciám CPhG (25, 50, 100 Rg/ml), echinakozidu (125, 250, 500 Rg/ml) a akteozidu (1,5, 3, 6 Rg/ml). Rôzne koncentrácie CPhG, echinakozidu a akteozidu sa aplikovali na platňu v štyroch po sebe idúcich jamkách a inkubovali sa 48 hodín. Účinky inhibície bunkovej proliferácie a úroveň životaschopnosti buniek (na základe merania aktivity LDH uvoľnenej z poškodených buniek do supernatantu [36]) boli stanovené testom MTT. Miera inhibície sa vypočítala pomocou nasledujúceho vzorca [37]:
Miera inhibície ( percentá ) " [1 — (priemerná absorbancia experimentálnej skupiny/priemerná absorbancia slepej kontrolnej skupiny)] x 100 percent
Podľa návodu súpravy,
LDH (U/L) {{0}} (nameraná OD – kontrolná OD)/(štandardná OD – prázdna OD) x 0,2 mmol/l x 1000
Naša predbežná štúdia ukázala, že CPhG, echinakozid a akteozid neovplyvnili životaschopnosť buniek.
4.9. Antiproliferatívne aktivity prostredníctvom TGF-^1
HSC aktivovaný TGF-p1 sa dlho považoval za spojený s fibrózou pečene a inhibícia rastu HSC bola navrhnutá ako metóda na liečbu fibrózy pečene [36,38]. Antiproliferatívne účinky CPhG, echinakozidu a akteozidu na HSC aktivované TGF-p1 boli stanovené pomocou MTT testu [39]. Použitím opísaných postupov a koncentrácií liečiva
experimentálne skupiny zahŕňali kontrolnú skupinu, skupinu TGF-pi, skupinu TGF-pi plus skupiny liečiv s rôznymi koncentráciami. Všetky bunkové skupiny okrem kontrolnej skupiny boli kultivované v DMEM obsahujúcom 50 ng/ml TGF-p1 (bez FBS) počas 24 hodín. Inhibičná aktivita na bunkovú proliferáciu sa vypočítala ako 100 x (absorbancia ošetrenej zlúčeniny – absorbancia svetla pozadia)/(absorbancia modelu – absorbancia svetla pozadia).
4.10. Reverzná transkripcia-polymerázová reťazová reakcia (RT-PCR)
Úroveň expresie mRNA smad2, smad3 a smad7 sa určila pomocou PCR v reálnom čase. Na stanovenie expresie mRNA v bunkách HSC sa bunky (5 x 104 bunky) naočkovali na šesťjamkové doštičky s 30 ml DMEM s 10 percentami FBS a inkubovali sa cez noc pri 37 stupňoch a 5 percent CO2. Po výmene kultivačného média za DMEM bez séra sa do jamiek pridali CPhG (100, 50, 25 µg/ml), echinakozid (500 250 125 µg/ml) a akteozid (6, 3,1,5 ug/ml). Po inkubácii počas 48 hodín s CPhG a monomérnymi kompozíciami sa celková RNA extrahovala pomocou činidla TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) a intenzívne sa miešala s chloroformom počas 15 s. Po ponechaní stáť pri teplote miestnosti počas 3 minút bol lyzát centrifugovaný pri 12,000 x g počas 15 minút pri 4 stupňoch. RNA vo vodnej fáze sa vyzrážala izopropanolom a horná vodná fáza sa preniesla do novej mikrocentrifugačnej skúmavky. RNA bola precipitovaná pridaním 0,75 percenta etanolu, potom bola mikrocentrifugačná skúmavka a centrifugovaná pri 12,000xg pri 4 stupňoch nie dlhšie ako 5 minút. Supernatant sa odstránil a RNA sa sušila pri teplote miestnosti počas 5-10 min. Priméry (Sangon) boli navrhnuté s použitím dávkového priméru 3 a sú uvedené v tabuľke 4. Výsledky boli normalizované na mRNA prevádzkového génu p-aktínu ako vnútornej kontroly a sú prezentované ako relatívne hladiny mRNA. Reakcie sa uskutočňovali s 8 |^ 1 iQ SYBR Green Supermix, 1 10 pM páru primérov, 8,5 ul destilovanej vody a 2,5 ul cDNA.
Každá polymerázová reťazová reakcia sa uskutočnila za nasledujúcich podmienok: 95 stupňov počas 3 minút, potom 40 cyklov 10 s pri 95 stupňoch, 30 s pri 55 stupňoch a 10 s pri 55 stupňoch -95 stupňa na predĺženie, po ktorých nasledovalo jedno meranie fluorescencie. Konečné výsledky boli opísané s relatívnymi hodnotami (2_AACt). Výpočet a analýza boli uskutočnené pomocou iQ5 Real Time PCR Detection System.
4.11. Western Blot analýza
Extrakty celých buniek sa pripravili s použitím tlmivého roztoku pre rádioimunoprecipitačný test (RIPA) (Thermo Fisher Scientific, Inc.) s 1 percentom Halt inhibítora proteázy a 1 percentom koktailov Halt inhibítora fosfatázy (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Celkový proteín sa použil na detekciu smad2, p-smad2, smad3, p-smad3 a smad7. Koncentrácia proteínu sa merala a kvantifikovala Bradfordovou metódou. Proteín (10-30 Rg) bol separovaný na 10 percentnom SDS-PAGE géli a prenesený na polyvinylidénfluoridové (PVDF) membrány (Millipore, Boston, MA, USA). Membrány sa blokovali 1 hodinu pri izbovej teplote 5 percentným hovädzím sérovým albumínom a primárnymi protilátkami (polyklonálna protilátka smad2, protilátka p-smad2, králičia mAb smad3 a králičia mAb p-smad3, riedenie 1:1000; králičia mAb smad7, 1 :200 riedenie, p-aktín monoklonálna protilátka, 1:5000 riedenie) boli inkubované pri 4 stupňoch cez noc. Zodpovedajúci Alk-Phos. konjugované sekundárne protilátky sa inkubovali pri teplote miestnosti. Nakoniec sa membrány trikrát premyli 1 x Tris-HCl fyziologickým roztokom s 0,1 percentami Tween 20 a signály sa skenovali a vizualizovali pomocou GEL DOC XR Imaging System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Na požadovaných proteínoch sa uskutočnila denzitometrická analýza a normalizovala sa na p-aktín pomocou softvéru GEL DOC Image Studio (Bio-Rad). p-aktín sa použil ako vnútorná kontrola.
4.12. Štatistická analýza
Údaje boli vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka (SD). Štatistické analýzy boli vykonané pomocou softvéru SPSS 16.0 (Xinjiang Medical University). Na analýzu hodnôt IC50 sa použila probitová analýza. Významnosť rozdielu bola vypočítaná jednosmerným testom ANOVA a hodnoty s p < 0,05="" boli="" považované="" za="" štatisticky="">
5. Závery
Záverom možno povedať, že CPhG z C. tubulosa a jej zložky echinakozid a akteozid vykazujú významné antifibrotické účinky. Medzi nimi je aktivita akteozidu najsilnejšia, zatiaľ čo aktivita CPhG je medzi týmito dvoma zlúčeninami. Inhibícia aktivácie signalizácie TGF-p1/Smad môže byť základným mechanizmom, ktorým CPhG chránia pred chronickým ochorením pečene súvisiacim s fibrózou, a echinakozid a akteozid sú účinným antifibrotickým materiálovým základom C. tubulosa.
Poďakovanie:Tento výskum podporila Čínska národná nadácia pre prírodné vedy (81260624). Autori by radi vyjadrili svoje úprimné poďakovanie profesorovi Tao Liuovi za zlepšenie písania v tomto článku.
Príspevky autora:TL, JZ, S.-PY, LM a S.-LZ koncipovali a navrhli experimenty. S.-PY, TL a JZ analyzovali dáta. Rukopis napísali S.-PY a JZ. TL, LM a JZ rukopis recenzovali. Všetci autori prečítali a schválili konečný rukopis.
Konflikt záujmov:Autori nedeklarujú žiadny konflikt záujmov.
Referencie
1. Subramoniam, A.; Pushpangadan, P. Vývoj fytomedicíny pre choroby pečene. Ind. J. Pharmacol. 1999, 31, 166-175.
2. Friedman, SL Mechanizmy choroby: Mechanizmy hepatálnej fibrózy a terapeutické dôsledky. Nat. Clin. Prax. Gastroenterol Hepatol. 2004,1, 98-105. [CrossRef] [PubMed]
3. Friedman, SL; Roll, FJ; Boyles, J.; Bissell, DM Pečeňové lipocyty: Hlavné bunky normálnej potkanej pečene produkujúce kolagén. Proc. Natl. Akad. Sci. USA 1985, 82, 8681-8685. [CrossRef] [PubMed]
4. Friedman, SL; Bansal, MB Zvrat hepatálnej fibrózy – Fakt alebo fantázia? H叩atology 2006, 43, S82-S88. [CrossRef] [PubMed]
5. Ahmad, A.; Ahmad, R. Pochopenie mechanizmu hepatálnej fibrózy a potenciálnych terapeutických prístupov. Saudi J. Gastroenterol. 2012, 18, 155-167. [CrossRef] [PubMed]
6. Peter, H.; Havran; Zhang, LB Orobanchaceae Ventenat. In Flora of China, 23. vydanie; Redakčný výbor Flóry Číny: Čínska akadémia vied, Peking, Čína, 2013; str. 1-16.
7. Komisia pre čínsky liekopis Ministerstva zdravotníctva Čínskej ľudovej republiky. Čínsky liekopis; Časť 1; Vydavateľstvo chemického priemyslu: Peking, Čína, 2010; p. 126.
8. Li, J.; Huang, D.; He, L. Účinok roucongrongu (Herba Cistanches Deserticolae) na reprodukčnú toxicitu u myší indukovanú glykozidom Leigongteng (Radix et Rhizoma Tripterygii). J. Tradit. Brada. Med. 2014, 34, 324-332. [CrossRef]
9. Xing, Y.; Liao, J.; Tang, Y.; Zhang, P.; Tan, C.; NIH.; Wu, X.; Li, N.; Jia, X. ACE a inhibítory agregácie krvných doštičiek z Tamarix hohenackeri Bunge (hostiteľská rastlina Herba Cistanches) rastúca v Xinjiang. Pharmacogn. Mag. 2014, 10, 111-118. [PubMed]
10. Jia, Y; Guan, Q.; Jiang, Y.; Salh, B.; Guo, Y.; Tu, P.; Du, C. Zlepšenie kolitídy vyvolanej dextránsulfátom sodným u myší pomocou extraktu z Cistanche tubulosa obohateného o echinakozid. Phytother. Res. 2014, 28, 110-119. [CrossRef] [PubMed]
11. Wong, HS; Ko, KM Herba Cistanches stimuluje bunkový redoxný cyklus glutatiónu pomocou reaktívnych foriem kyslíka generovaných mitochondriálnym dýchaním v kardiomyocytoch H9c2. Pharm. Biol. 2013, 51, 64-73. [CrossRef] [PubMed]
12. Martin, A.; Clynes, M. Kyslá fosfatáza: Koncový bod pre testy toxicity in vitro. Vitro Cell. Dev. Biol. 1991, 27, 183-184. [CrossRef]
13. Lechuga, CG; Hernandez-Nazara, ZH; Dominguez Rosales, JA; Morris, ER; Rincon, AR; Rivas-Estilla, AM; Esteban-Gamboa, A.; Rojkind, M. TGF-01 moduluje expresiu matricovej metaloproteinázy-13 v pečeňových hviezdicových bunkách komplexnými mechanizmami zahŕňajúcimi p38MAPK, PI3-kinázu, AKT a p70S6k. Am. J. Physiol. Gastrointest Pečeň Physiol. 2004, 287, G974-G987. [CrossRef] [PubMed]
14. Nguyen, J.; Tang, SY; Nguyen, D.; Alliston, T. Load reguluje tvorbu kostí a expresiu sklerostínu prostredníctvom mechanizmu závislého od TGFp. PLoS ONE 2013, 8, e53813. [CrossRef] [PubMed]
15. Pessah, M.; Marais, J.; Prunier, C.; Ferrand, N.; Lallemand, F.; Mauviel, A.; Atfi, A. C-Jun sa spája s onkoproteínom Ski a potláča transkripčnú aktivitu Smad2. J. Biol. Chem. 2002, 277, 29094-29100. [CrossRef] [PubMed]
16. Ding, N.; Yu, RT; Subramaniam, N.; Sherman, MH; Wilson, C.; Rao, R.; Leblanc, M.; Coulter, S.; On, M.; Scott, C.; a kol. Genómový okruh receptora vitamínu D/SMAD riadi fibrotickú odpoveď pečene. Bunka 2013, 153, 601-613. [CrossRef] [PubMed]
17. Yang, FR; Fang, BW; Lou, JS Účinky piluliek Fufang Biejia Ruangan na fibrózu pečene in vivo a in vitro. World J. Gastroenterol. 2013, 19, 5326-5333. [CrossRef] [PubMed]
18. Sakaida, I.; Hironaka, K.; Kimura, T.; Terai, S.; Yamasaki, T.; Okita, K. Herbal medicine Sho-saiko-to (TJ-9) zvyšuje expresiu matricových metaloproteináz (MMP) so zníženou expresiou tkanivového inhibítora metaloproteináz (TIMP) v hviezdicovej bunke potkana. Life Sci. 2004, 74, 2251-2263. [CrossRef] [PubMed]
19. Chen, M.; Chen, J.; Tsai, C.; Wang, W.; Chang, D.; Tu, GR; Hsieh, HY Úloha TGF-01 a cytokínov v modulácii fibrózy pečene pomocou Sho-saiko-to v modeli ligovaného žlčovodu u potkanov. J. Ethnopharmacol. 2005, 97, 7-13. [CrossRef] [PubMed]
20. Bolarin, DM; Azinge, EC Biochemické markery, extracelulárne zložky pri fibróze pečene a cirhóze. Nig. QJ Hosp. Med. 2007, 17, 42-52. [CrossRef] [PubMed]
21. Kong, D.; Zheng, S.; Lu, Y. Zdroj a úloha myofibroblastov pri fibróze pečene. Brada. Pharmacol. Bull. 2011, 27, 297-300.
22. De Lavor, MSL; Binda, NS; Fukušima, FB; Caldeira, FMC; Da Silva, JF; Silva, CMO; de Oliveira, KM; Martins Bde, C.; Torres, BB; Rosado, IR; a kol. Ischemicko-reperfúzny model v mieche potkanov: Štúdia signalizácie bunkovej životaschopnosti a apoptózy. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2015, 8, 9941-9949. [PubMed]
23. Bahadar, H.; Maqbool, F.; Niaz, K.; Abdollahi, M. Toxicita nanočastíc a prehľad súčasných experimentálnych modelov. Iran Biomed. J. 2016, 20, 1-11. [PubMed]
