Floretín potláča neurozápal aktiváciou Nrf2 sprostredkovanou autofágiou v makrofágoch

Kontakt:tina.xiang@wecistanche.com

Abstraktné

Pozadie: Makrofágy hrajú dvojakú úlohu pri neurozápalových poruchách, ako je roztrúsená skleróza (MS). Podieľajú sa na vzniku a progresii lézie, ale môžu tiež podporiť vyriešeniezápala opravu poškodeného tkaniva. V tejto štúdii skúmame, či a akofloretínflavonoid, ktorý je hojne prítomný v jablkách a jahodách, znižuje zápalový fenotyp makrofágov a potláčaneurozápal.

Metódy: Transkripčné zmeny v makrofágoch odvodených z kostnej drene myší po expozícii floretínu boli hodnotené hromadným sekvenovaním RNA. Základné dráhy súvisiace so zápalom, reakciou na oxidačný stres a autofágiou boli overené kvantitatívnou PCR, fluorescenčnými a absorbančnými testami, knockoutom myší s nukleárnym faktorom erytroidným 2-faktorom 2 (Nrf2), western blotom a imunofluorescenciou. Experimentálny model autoimunitnej encefalomyelitídy (EAE) sa použil na štúdium vplyvu floretínu na neurozápal in vivo a na potvrdenie základných mechanizmov.

Výsledky: Ukazujeme, že floretín znižuje zápalový fenotyp makrofágov a výrazne potláča neurozápal pri EAE. Floretín sprostredkováva svoj účinok aktiváciou signálnej dráhy Nr2. Aktivácia Nrf2 bola pripísaná aktivácii autofágie závislej od 5'AMP-aktivovanej proteínkinázy (AMPK) a následnej degradácii proteínu 1 (Keap1) spojeného s ECH podobným Kelchovi.

Závery: Táto štúdia otvára budúce perspektívy pre floretín ako terapeutickú stratégiu pre neurozápalové poruchy, ako je MS.

Skúšobná registrácia: Nepoužiteľné.

Kľúčové slová: floretín, makrofágy, neurozápal, roztrúsená skleróza, autoimunita

Kliknutím sem získate ďalšie informácie

Pozadie

Aktívne lézie roztrúsenej sklerózy (MS) sú charakterizované prítomnosťou mnohýchmakrofágy[1-5]. Skoré štúdie ukázali, že makrofágy prijímajú prozápalový fenotyp v léziách MS, čím podporujúneurozápaldemyelinizácia a neurodegenerácia. Efektorové funkcie podporujúce ochorenie zahŕňajú prezentáciu antigénov odvodených z centrálneho nervového systému (CNS) autoreaktívnym T bunkám a produkciu zápalových mediátorov, ako sú prozápalové cytokíny, reaktívne formy kyslíka (ROS) a oxid dusnatý (NO)[ 6,7]. Nedávno sa zistilo, že makrofágy majú tiež prospešné funkcie v léziách MS, pretože môžu pretvoriť svoj fenotyp na taký, ktorý je typicky spojený s imunosupresiou a opravou CNS. Tento ochranný fenotyp je charakterizovaný zníženou produkciou prozápalových mediátorov, produkciou protizápalových mediátorov a rastových faktorov a aktiváciou antioxidačných dráh, ako je dráha nukleárneho faktora erytroidného 2-faktora 2 (Nrf2). [8-14]. Keďže zápalový stav makrofágov je spojený s progresiou SM a rozvojom chronických aktívnych lézií, riadenie makrofágov k prospešnému fenotypu sa považuje za sľubnú stratégiu na obmedzenie progresie SM [15].

Diétne zložky riadia funkciu makrofágov a neurozápal [16]. Najmä rodina flavonoidov sa čoraz viac uznáva, že obsahuje sľubné zlúčeniny, ktoré ovplyvňujú patogénne dráhy a modulujú fenotyp imunitných buniek, ako sú makrofágy [17,18]. Flavonoidy tvoria jednu z najväčších rodín fytonutrientov, ktoré obsahujú viac ako 8000 fenolových zlúčenín s rôznou bioaktivitou. Niekoľko členov rodiny flavonoidov vykazuje protizápalové a antioxidačné účinky na makrofágy [19-21]. Flavonoid floretín je členom dihydrochalkónov a je prítomný v bežne konzumovanom ovocí, ako sú jablká a jahody. O floretíne je známe, že má imunomodulačné vlastnosti a vďaka svojim antioxidačným vlastnostiam sa široko používa na starostlivosť o pleť [22-24]. Okrem toho je floretín inhibítorom glukózového transportéra (GLUT), čo je vlastnosť, ktorá ovplyvňuje fenotyp makrofágov, pretože aktiváciu makrofágov poháňa GLUT [25, 26]. Celkovo tieto vlastnosti robia z floretínu sľubnú zlúčeninu na moduláciu fenotypu makrofágov a neurozápalu. V tejto štúdii sme ukázali, že floretín poháňa makrofágy smerom k menej zápalovému fenotypu a zmierňuje neurozápal v modeli experimentálnej autoimunitnej encefalomyelitídy (EAE). Sekvenovanie RNA a funkčné experimenty identifikovali dráhu Nrf2 ako centrum a hnaciu silu tohto ochranného makrofágového fenotypu indukovaného floretínom. Zistilo sa, že aktivácia autofagického aparátu závislá od AMPK a následná SQSTMl/p{14}}sprostredkovaná (ďalej označovaná ako p62) degradácia Keapl, adaptéra, ktorý uľahčuje proteazomálnu degradáciu Nrf2, je základom aktivácie Nrf2 v makrofágoch. Tieto zistenia ukazujú, že floretín má potenciál byť použitý v terapeutických stratégiách pre neurozápalové poruchy.

Metódy

Protilátky a chemické činidlá

Phloretin(Sigma Aldrich) sa rozpustil v 50 mM KOH na 15 mM zásobný roztok a skladoval pri -20 stupňoch. Ďalšie riedenia sa uskutočnili v médiu RPMI1640 (Gibco). Na ošetrenie in vivo sa floretín rozpustil v 1 N NaOH, potom sa pH upravilo na 7,2 pomocou 1 N HCL a roztok sa ďalej zriedil vo fyziologickej vode, aby sa získala koncentrácia 50 mg/kg. BML-275（1 μM, Santa Cruz Biotechnology） sa pridal 1 hodinu pred liečbou floretínom, aby sa inhibovala aktivácia AMPK. Bafilomycín A1 (BAF, 0, 1 μM, InvivoGen) sa pridal 2 hodiny pred odberom, aby sa zablokovala fúzia autofagozómov a lyzozómov. Lipopolysacharid (LPS, 100 ng/ml, Sigma-Aldrich) sa použil na stimuláciu buniek pre zápalovú fenotypizáciu. Forbol 12-myristát 13-acetát (PMA, 100 ng/ml, Sigma-Aldrich) sa použil na vyvolanie produkcie ROS. Pre western blot boli použité nasledujúce protilátky: myšací anti- -aktín (1:10,000;sc-47778, Santa Cruz Biotechnology), myšací anti-GAPDH (1:{{29 }};AB_2537659, Invitrogen), králičia anti-AMPK (1:1000;5831S, technológia bunkovej signalizácie), králičia antifosforylovaná AMPK (1:1000; 2535S, technológia bunkovej signalizácie),králičia anti-LC3 (1:1000; L7543, Sigma-Aldrich), králičia anti-p62 (1:1000; 23214, Cell Signaling Technology). Na imunofluorescenciu boli použité nasledujúce protilátky: potkanie anti-CD3 (1:150; MCA500G, Bio-Rad), potkanie anti-F4/80 (1:100; MCA497G, Bio-Rad), králičie anti-LC3 (1:1000 ;L7543, Sigma-Aldrich), králičia anti-p62 (1:500;23214,Cell Signaling Technology), králičia anti-Keap1 (1:500;60027-1-Ig,Proteintech Europa), králičia anti-TMEM119(1 :100, ab209064, Abcam). Vhodné sekundárne protilátky boli zakúpené od Invitrogen.

Myši

Myši divokého typu (WT) C57BL/6JOlaHsd boli zakúpené od Envigo. Zvieratá boli kŕmené pravidelnou stravou a umiestnené v zariadení pre zvieratá Biomedicínskeho výskumného ústavu Hasselt University. Všetky experimenty boli vykonané podľa inštitucionálnych smerníc a boli schválené etickou komisiou pre pokusy na zvieratách Hasselt University.

Bunková kultúra

Pochádza z kostnej drenemakrofágy(BMDM) boli izolované z WT a Nrf2 knockout (KO) myší C57BL/6JOlaHsd, zakúpených od Envigo a poskytnutých RIEN BRC podľa MTA prof. S. Kerdine-Römerovi [27,28]. BMDM boli získané tak, ako bolo opísané vyššie [29]. Bunky krátkej tibiálnej a stehennej kostnej drene od 12-týždňových myší WT a Nrf2 KO C57BL/6JOlaHsd boli kultivované na 10-cm Petriho platniach v koncentrácii 10×106 buniek/ dosku v médiu RPMI1640 doplnenom 10 percentami fetálneho teľacieho séra (FCS, Gibco), 50 U/ml penicilínu (Invitro-gen), 50 U/ml streptomycínov (Invitrogen) a 15 percentami L929-kondicionovaného média (LCM ). Po diferenciácii boli BMDM oddelené pri 37 stupňoch s 10 mM EDTA v PBS (Gibco) a kultivované (0,5 x 10 stupňov buniek/ml) v RPM1640 doplnenom 10 percentami FCS, 50 U/ml penicilínu, 50 U/ml streptomycínu a 5 percent LCM ( 37 stupňov C, 5 percent CO2). Kultúry mikroglií boli izolované z mozgu postnatálnych mláďat P1-3 C57BL/6/OlaHsd. Po odstránení mozgového kmeňa, choroidného plexu a mozgových blán boli mozgy mechanicky disociované a enzymaticky štiepené 15 minút s 1 x trypsínom (Gibco) pri 37 stupňoch. Potom sa bunková suspenzia naočkovala do DMEM, média s vysokým obsahom glukózy (Sigma) doplneného 30 percentami LCM, 10 percent FCS, 50 U/ml penicilínu a 50 U/ml streptomycínu do kultivačných fliaš T75. O dva až 3 dni neskôr sa uskutočnila úplná výmena média. Zmiešané gliové kultúry sa pretrepávali (230 ot./min, 3 hodiny, 37 stupňov) po 6-7 dňoch, aby sa získali čisté kultúry mikroglií.

Sekvenovanie RNA

Bunky boli vopred ošetrené floretínom (50 μM) počas 20 hodín a stimulované LPS (100 ng/ml) počas 6 hodín. Bunková lýza sa uskutočnila s použitím činidla Qiazol Lysis (Qiagen). RNA bola extrahovaná z buniek pomocou RNeasy mini kit (Qiagen). Vzorky potom spracoval Genomics Core Leuven (Belgicko). Príprava knižnice sa uskutočnila pomocou súpravy Lexogen's QuantSeq na vytvorenie knižníc kompatibilných s Illumina. Knižnice boli sekvenované na sekvenčnom systéme Illumina HiSeq4000. Zarovnanie s ohľadom na zostrih sa uskutočnilo pomocou STAR v2.6.1b[30]. Kvantifikácia čítaní na gén sa uskutočnila pomocou HT-seq Count v2.7.14. Analýza diferenciálnej expresie založená na počte bola vykonaná pomocou R-based (The R Foundation for Statistical Computing, Viedeň, Rakúsko) Bioconductor balíkom DESeq2. Zoznam odlišne exprimovaných génov bol vybraný na ap<0.05 and="" used="" as="" an="" input="" for="" the="" core="" analysis="" by="" qiagen's="" ingenuity="" pathway="" analysis="" (ipa).="" all="" rna="" sequencing="" (rna-seq)="" data="" discussed="" in="" this="" publication="" have="" been="" deposited="" in="" ncbi's="" gene="" expression="" omnibus(edgar="" et="" al,="" 2002)="" and="" are="" accessible="" through="" geo="" series="" accession="" number="">

Kvantitatívna reverzná transkripčná PCR

Bunky boli vopred ošetrené floretínom (50 μM) počas 20 hodín a stimulované LPS (100 ng/ml) počas 6 hodín. Lýza sa uskutočnila s použitím činidla Qiazol Lysis (Qiagen). RNA sa extrahovala pomocou mini súpravy RNeasy (Qiagen). Koncentrácia a kvalita RNA sa stanovili pomocou spektrofotometra Nano-drop (Isogen Life Science). Syntéza cDNA sa uskutočnila s použitím Quanta qScript cDNA SuperMix (Quanta Biosciences) podľa pokynov výrobcu. qPCR sa uskutočnilo na StepOne-Plus" Real-Time PCR systéme (Applied Biosystems) s použitím zelenej zmesi SYBR obsahujúcej 1 x SYBR green (Applied Biosystems), 0,3 μM primery (Integrated DNA Technologies), 12,5 ng cDNA a vodu bez nukleázy Na kvantifikáciu génovej expresie bola použitá komparatívna Ct metóda Údaje boli normalizované na najstabilnejšie referenčné gény cyklín A a hypoxantín fosforibozyltransferázu 1. Sekvencie primérov sú dostupné na požiadanie.

Stanovenie reaktívnych foriem kyslíka

Bunky boli vopred ošetrené floretínom (50 uM) počas 2 hodín. Potom sa bunky stimulovali PMA (15 minút, 100 ng/ml) a produkcia ROS sa merala použitím fluorescenčnej sondy 2',7'-dichlórdihydrofluoresceín diacetátu pri 10 uM v PBS počas 30 minút. Fluorescencia sa merala pomocou fluorescenčnej čítačky mikrodoštičiek FLUOstar optima (BMG Labtech, Ortenberg, Nemecko) (excitácia: 495 nm, emisia: 529 nm).

Merania oxidu dusnatého

Bunky boli vopred ošetrené floretínom (50 μM) počas 2 hodín. Potom boli bunky stimulované LPS (24 hodín, 100 ng/ml). NO bol nepriamo monitorovaný pomocou Griessovho reagentu na meranie dusitanov (Abcam). Stručne povedané, dusičnan reaguje so sulfanilamidom a dihydrochloridom N-(1-naftyl)etyléndiamínu za vzniku ružového azofarbiva. Absorbancia tohto azoderivátu sa potom merala pri 540 nm pomocou čítačky mikrodoštičiek (iMark, Bio-Rad).

Western blot

Bunky boli ošetrené floretínom (5{{1{18}}}} μM) a LPS (100 ng/ml) počas 1 hodiny alebo 24 hodín, aby sa určila aktivácia AMPK alebo hladiny proteínov p62, LC3 a Keapl. Bunky boli lyzované s použitím RIPA-tlmivého roztoku (150 mM NaCl, 1 % Triton X-100, 0,5 % deoxycholát sodný, 1 % SDS, 50 mM Tris) a separované elektroforézou na polyakrylamidovom géli s dodecylsulfátom sodným. Gély sa preniesli na PVDF-membránu (VWR) a bloty sa blokovali počas 1 hodiny v 5 percentách hovädzieho sérového albumínu v Tris-pufrovanom fyziologickom roztoku obsahujúcom 0,1 percenta Tween-20 (TBS-T). Membrány boli sondované primárnymi protilátkami cez noc pri 4 °C, premyté TBS-T a inkubované so zodpovedajúcou sekundárnou chrenovou peroxidázou značenou protilátkou počas 1 hodiny pri izbovej teplote (RT). Imunoreaktívne signály boli detegované zvýšenou chemiluminiscenciou (ECL Plus, Thermo Fisher) s použitím prístroja Amersham Imager 680 (GE Healthcare Life Sciences) Hustoty pásov boli stanovené pomocou ImageJ.

Imunofluorescencia

Kryorezy miechy boli vysušené na vzduchu a fixované v ľadovo studenom acetóne počas 10 minút pri - 20 stupňoch. Myšie BMDM boli kultivované na sklenených krycích sklíčkach a fixované v ľadovo studenom metanole počas 10 minút pri -20 stupňoch. Rezy a BMDM boli blokované počas 30 minút pomocou proteínového bloku Dako (Agi-lent). Potom boli inkubované cez noc pri 4 °C s primárnymi protilátkami, premyté a inkubované s vhodnými sekundárnymi protilátkami počas 1 hodiny pri teplote miestnosti. Snímky tkaniva miechy boli urobené pomocou mikroskopu Nikon Eclipse 80i (10× objektív) a NIS Softvér Elements BR 3.10 (Nikon). Snímky BMDM zafarbené na p62, LC3 a Keapl boli urobené pomocou konfokálneho mikroskopu Zeiss LSM 880 a boli korigované Airyscan (63× objektív).P62-a LC3- pozitívne bodky boli určené poloautomatickou analýzou obrazu J. Stručne povedané, po vytvorení binárneho obrazu a ručnom výbere buniek sa bodky analyzovali na bunku. Kolokalizácia P62 a Keapl sa uskutočnila pomocou kolokalizačného potrubia v softvéri CellProfiler [31 ]. Obrázky zobrazené na obrázkoch sú digitálne vylepšené.

Experimental autoimmune encephalomyelitis model Eleven-week-old C57BL/6JOlaHsd mice were immunized subcutaneously with 200 ng of myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide(MOG35-55)emulsified in 100 ul complete Freund's supplemented with 4 mg/ml of Mycobacterium tuberculosis(EK2110, Hooke Laboratories). Im-mediately after MOG immunization and after 24 h, mice were intraperitoneally injected with 50 ng pertussis toxin (EK2110 kit, Hooke Laboratories) to induce EAE.EAE animals were treated daily with phloretin or vehicle(50 mg/kg, intraperitoneal (ip)) after 6 days of immunization (prophylactic setup)or after disease onset(clinical score>1, terapeutické nastavenie). Myši sa denne vážili a hodnotili na neurologické príznaky choroby podľa návodu výrobcu na hodnotenie EAE u myší:0:žiadne klinické príznaky,0.5:koniec chvosta je ochabnutý, 1:ochabnutý chvost , 1.5: ochabnutý chvost a inhibícia zadných končatín 2: ochabnutý chvost a slabosť zadných končatín, 2.5: ochabnutý chvost a ťahanie zadných končatín, 3: krívanie chvosta a úplná paralýza zadných končatín, 3.5: ochabnutý chvost a úplná paralýza zadných končatín nohy a myš nie sú schopné narovnať sa, keď sú umiestnené na boku, 4: paralýza bránice, 5: smrť v dôsledku EAE.

Štatistická analýza

GraphPad Prism sa použil na štatistickú analýzu údajov, ktoré sú reprezentované ako priemer ± sem D'Agostino a test omnibusovej normality Pear-son sa použil na testovanie normálnej distribúcie. Pre normálne rozložené dáta sa použil dvojstranný nepárový Studentov t-test (v prípade potreby s Welchovou korekciou). Mann-Whitney analýza bola použitá pre dáta, ktoré neprešli testom normality.p-hodnoty<0.05 were="" considered="" to="" demonstrate="" significant=""><><0.01,><0.001 and="" *p=""><>

Výsledky

Transkripčné zmeny spojené s liečbou makrofágov floretínom

Na stanovenie potenciálnych protizápalových účinkov a identifikáciu základných mechanizmov liečby floretínom na makrofágoch sme vykonali hromadné sekvenovanie RNA (doplnkový obrázok 1). Analýza dráhy aktivovaných makrofágov liečených floretínom ukázala, že rozdielne exprimované gény boli nadmerne zastúpené v kanonických dráhach súvisiacich szápal, ako napríklad iNOS(z-skóre:-2.449), mýtny receptor (z-skóre:-2.236), interferónová signalizácia (z-skóre:- 2), a dráha odozvy akútnej fázy (z-skóre:{10}}.633) (obr. 1A, B). Podobne ako pri analýze kanonickej dráhy, predchádzajúca analýza údajov RNA-seq predpovedala, že floretín znižuje aktiváciu kľúčových prozápalových regulátorov transkripcie, ako sú IRF7 (z-skóre: 2,229), IRF1 (z-skóre:-2. 025) a STAT1(z-skóre:-2.022)(obr. 1D). Okrem downregulácie makrofágových prozápalových dráh, analýza RNA-seq makrofágov liečených floretínom ukázala, že okrem iných dráh floretín silne aktivoval dráhu Nrf2 (z-skóre: 1,897), čo dokazuje upregulácia spojená s Nrf{35}} gény ako mafG a proxy (obr. 1A, C). Ešte viac, Nrf2 (NFE2L2) bol identifikovaný ako najviac aktivovaný upstream transkripčný regulátor (z-skóre: 2,801) a regulácia hladín ROS bola identifikovaná ako jedna z najviac upregulovaných biologických funkcií v BMDM liečených floretínom (z-skóre: 2,008 ) (obr. 1D, E). Súhrnne zistenia ukazujú, že floretín aktivuje Nrf2 a potláča zápalový fenotyp makrofágov.

Dráha Nrf2 riadi fenotyp makrofágov ošetrených floretínom

Ďalej sme potvrdili protizápalový účinok floretínu a určili sme, či moduluje zápalový fenotyp makrofágov pôsobením na Nrf2. Znížené hladiny ROS boli pozorované u floretínom ošetrených WT BMDM stimulovaných PMA (obr. 2A). Okrem toho sa pozorovala znížená produkcia NO a hladiny mRNA prozápalových génov NOS2, I-6, COX2 a I-12 u WT BMDM liečených floretínom stimulovaných LPS (obr. 2B, C). v súvislosti s kľúčovou úlohou Nrf2 pri indukcii menej zápalového fenotypu naše údaje ukazujú, že floretín aktivuje gény odozvy Nrf{13}} HO1 a NQO1 vo WT, ale nie Nrf2 KO BMDM stimulované LPS (obr. 2D). Okrem toho liečba floretínom znížila produkciu ROS vo WT, ale nie v Nrf2 KO BMDM (obr. 2E). Okrem kontroly antioxidačných reakcií sa uvádza, že Nrf2 potláča zápalový fenotyp makrofágov [12]. Na podporu posledného uvedeného, ​​floretín nedokázal znížiť expresiu prozápalových génov NOS2, IL-6, COX2 a IL-12 v aktivovaných Nrf2-deficientných BMDM (obr. 2F). Celkovo tieto výsledky naznačujú, že Nrf2 riadi floretínom sprostredkovaný zápalový fenotyp makrofágov.

Floretín podporuje aktiváciu AMPK

Phloretin je dobre definovaný inhibítor GLUT a nedávne štúdie zdôrazňujú dôležitosť vychytávania glukózy sprostredkovaného GLUT pre aktiváciu makrofágov [26,32]. Preto sme určili, či floretín môže aktivovať energetický senzor AMPK, ktorý sa aktivuje pri nízkych hladinách energie / glukózy. Naše výsledky ukazujú, že liečba floretínom vedie k fosforylácii a aktivácii AMPK (obr. 3A, B). Okrem toho pridanie inhibítora AMPK BML-275 do značnej miery zabraňuje aktivácii AMPK u BMDM liečených floretínom (obr. 3A, B). Ešte viac, naše zistenia ukazujú, že aktivácia AMPK je nevyhnutná pre floretín na potlačenie produkcie ROS, ako ukazujú vyššie hladiny ROS v BMDM liečených floretínom aj inhibítorom AMPK v porovnaní s BMDM liečenými samotným floretínom (obr. 3C). Celkovo naše údaje naznačujú, že aktivácia AMPK vyvolaná florénom je rozhodujúca pre riadenie makrofágov smerom k menej zápalovému fenotypu.

Floretín stimuluje autofágiu spôsobom závislým od AMPK

Keďže aktivácia AMPK súvisí s aktiváciou katabolických procesov v reakcii na nedostatok živín [33], ďalej sme skúmali, či floretín môže aktivovať autofágiu. Autofágia je konzervovaný katabolický proces, ktorý je indukovaný hladovaním a inými stresovými reakciami, čo podporuje lyzozomálnu degradáciu intracelulárneho nákladu sekvestrovaného vo vezikulách nazývaných autofagozómy. Analýza RNA-seq predpovedala autofágiu ako jeden z následných biologických procesov vykazujúcich zvýšenú aktivitu v BMDM liečených floretínom (z-skóre: 0,779) (obr. 4A). Okrem toho imunocytochemická analýza BMDM liečených floretínom a autofágovým inhibítorom bafilomycínom Al vykazovala zvýšenú akumuláciu autofágových markerov MAP1LC3/LC3 (ľahký reťazec 3 proteínu asociovaného s mikrotubulami 1) a p62 v porovnaní s BMDM liečenými bafilomycínom A1- (obr. 4B-D), čo naznačuje zvýšený autofagický tok po liečbe floretínom [34]. Po indukcii autofágie sa LC3 premení z formy LC3I na lipidovanú formu LC3I, ktorá koreluje s počtom autofagozómov. V súlade s tým boli stanovené vyššie hladiny proteínov LC3II a p62 vo floretínom stimulovaných BMDM pomocou western blotu (obr. 4E, F). Je zaujímavé, že tomuto zvýšeniu p62 a LC3II floretínom sa zabránilo liečbou BMDM inhibítorom AMPK BML-275 (obr. 4E-F). Súhrnne naše údaje ukazujú, že floretín stimuluje autofágiu spôsobom závislým od AMPK.

Phloretin aktivuje dráhu Nrf2 prostredníctvom autofágie sprostredkovanej degradácie Keap1

Naše údaje ukazujú, že floretín aktivuje Nrf2 a stimuluje autofágiu v makrofágoch. Je zaujímavé, že autofagický receptor p62 môže súťažiť s Nrf2 o väzbu na Keapl, adaptér, ktorý za normálnych podmienok uľahčuje ubikvitináciu a degradáciu Nrf2. Táto p62-sprostredkovaná disociácia Keap1/Nrf2 preto zabráni degradácii Nrf2 a nakoniec povedie k aktivácii Nrf2 [35]. Z tohto dôvodu sme určili, či floretín podporuje interakciu p62 / Keapl, čím aktivuje dráhu Nrf2. Tu ukazujeme, že floretín aktivuje dráhu Nrf2 prostredníctvom p62-sprostredkovanej degradácie Keapl v makrofágoch. Použitím konfokálnej mikroskopie Airyscan s vysokým rozlíšením v kombinácii s kolokalizačnou analýzou sme ukázali, že floretín stimuluje interakciu p62 a Keapl, čo dokazuje zvýšená hodnota kolokalizačného parametra (Pearsonov koeficient) u BMDM liečených floretínom (obr. 5A , B). Naše zistenia navyše ukazujú, že nižšie hladiny proteínu Keapl sú prítomné v BMDM liečených floretínom, čo potvrdzuje degradáciu Keapl (obr. 5C). Aby sme potvrdili, že degradácia je závislá od autofágie, pridali sme inhibítor autofágie bafilomycín A1 do liečeného floretínom. BMDM. Je zaujímavé, že toto zníženie Keapl bolo zvrátené ošetrením bafilomycínom Al (obr. 5C). Tieto výsledky boli potvrdené westernovým prenosom, ukazujúcim zníženie hladín proteínu Keapl v BMDM ošetrených floretínom, ktorému zabránil bafilomycín Al (obr. 5D, E).

Phloretin reduces neuroinflammation in the EAE model To validate our findings in vivo, we investigated the impact of phloretin on the EAE model, the most commonly used animal model of MS, that is characterized by a pronounced macrophage-mediated inflammatory response in the CNS 5]. EAE animals treated with phloretin before disease onset showed reduced clinical scores compared to vehicle-treated animals (Fig. 6A). Importantly, even in a therapeutic setup, in which phloretin treatment was started after disease onset (clinical score>1), floretín znížil závažnosť ochorenia (obr. 6B). Znížená závažnosť ochorenia u zvierat liečených floretínom bola paralelná so zníženou expresiou zápalových génov MHCI,

CD86,Nos2,TNFa,IL-6,CCL4, CCL5 a CXCL2 v mieche (obr. 6C). Okrem toho sa v mieche zvierat liečených floretínom zistilo znížené množstvo F4/80t buniek (obr. 6E, F). Keďže makrofágy F4/80*mikroglie aj F4/80* prispievajú k neurozápalu, hlbšia analýza ukázala, že floretín výrazne znížil množstvo F480 plus TMEMl19-

makrofágov u EAE myší (doplnkový obrázok 2 DF), pričom sa pozoroval nevýznamný trend smerom k redukcii F480 plus TMEMl19 plus mikroglie. V súlade s týmto zistením floretín potláčal produkciu zápalových mediátorov v mikrogliách, ale toto potlačenie bolo menej výrazné v porovnaní s makrofágmi (doplnkový obrázok 2 AC). Tieto zistenia naznačujú, že zlepšenie EAE floretínom je riadené najmä makrofágmi. Okrem zníženia expresie zápalových génov zvýšil floretín expresiu protizápalových a neurotrofických faktorov, tj IL-4, CNTF a IGF-1 v mieche zvierat s EAE (obr. 6D ). Tieto zistenia silne naznačujú, že floretín znižuje závažnosť ochorenia EAE tým, že vedie makrofágy k fenotypu, ktorý rieši ochorenie. V súlade s našimi predchádzajúcimi zisteniami in vitro sme tiež detegovali zvýšenú signalizáciu Nrf2 v CNS zvierat s EAE liečených floretínom, ako naznačuje zvýšená expresia mRNA Nrf2 a jeho downstream cieľov NQO1 a GPX1 (obr. 6G). Celkovo tieto údaje ukazujú, že floretín potláča neurozápal v profylaktickom aj terapeutickom prostredí. Okrem toho naše zistenia naznačujú, že floretín môže znížiť neurozápal potlačením zápalových vlastností makrofágov prostredníctvom aktivácie Nrf2.

Diskusia

V tejto štúdii demonštrujeme, že floretín poháňa makrofágy smerom k menej zápalovému fenotypu spôsobom závislým od Nrf{1}}. Zistilo sa, že aktivácia autofágie závislá od AMPK a následná degradácia Keapl je základom aktivácie Nrf2 floretínom. Okrem toho potvrdzujeme protizápalové účinky floretínu v modeli EAE, kde znižuje závažnosť ochorenia a zmierňuje závislosť od makrofágovneurozápal.

Ukazujeme, že floretín potláča zápalový fenotyp makrofágov. To je v súlade so zisteniami Wei-Tien Changa a kol. ktorý preukázal, že floretín má protizápalové vlastnosti v makrofágovej bunkovej línii [36]. Ukazujeme, že indukcia tohto posunu fenotypu závisí od Nrf2. Nrf2 je hlavný regulátor antioxidačných reakcií a je známe, že jeho aktivácia poháňa makrofágy smerom k protizápalovému fenotypu [1l, 12, 37]. Okrem toho niekoľko štúdií definovalo, že aktivácia Nrf2 tlmí neurozápal a neurodegeneráciu pri poruchách CNS [{{10 }}]. Aj keď naše zistenia ukazujú, že Nrf2 je základom fenotypového posunu makrofágov ošetrených floretínom, údaje o sekvenovaní RNA ilustrovali, že medzi aktiváciou Nrf2 boli upregulované aj iné dráhy. Najmä upregulácia dráhy PPAR je zaujímavá kvôli jej protizápalovým vlastnostiam a krížovej komunikácii s Nrf2 [41-45]. Okrem toho, keďže floretín je dobre definovaný inhibítor GLUT a prechod na glykolýzu je kľúčovou metabolickou udalosťou pre aktiváciu makrofágov, zmeny fenotypu môžu byť čiastočne indukované aj priamymi metabolickými účinkami floretínu na tieto glukózové transportéry [46,47]. Je potrebný ďalší výskum, aby sa definoval význam PPAR pri aktivácii Nrf2 indukovanej florénom a do akej miery je imunomodulácia indukovaná florénom ovplyvnená priamymi metabolickými zmenami. Celkovo naše zistenia jasne ukazujú, že aktivácia Nrf2 hrá zásadnú úlohu pri zmene fenotypu sprostredkovanej floretínom.

Naše zistenia naznačujú, že aktivácia Nrf2 floretínom je sprostredkovaná aktiváciou AMPK. AMPK hrá kľúčovú úlohu pri obnove bunkovej energetickej homeostázy v prípade stresov, ktoré vyčerpávajú ATP, čo vedie k zvýšenému pomeru ADP: ATP, čím sa zapínajú alternatívne katabolické cesty, ktoré generujú ATP, pričom sa vypínajú anabolické cesty, ktoré spotrebúvajú ATP [48]. V súlade s tým je floretín dobre známym inhibítorom GLUT a znižuje hladiny glukózy v bunkách [49-51]. Niekoľko štúdií preukázalo, že aktivácia AMPK v makrofágoch indukuje imunosupresívny fenotyp, čo potvrdzuje naše výsledky ukazujúce, že aktivácia AMPK je nevyhnutná pre floretín na zníženie zápalu (52, 53). Naše údaje sú tiež v súlade s predchádzajúcimi štúdiami, v ktorých sa preukázalo, že floretín aktivuje AMPK v iných typoch buniek vrátane adipocytov a endotelových buniek [50, 54-56]. Floretín môže aktivovať AMPK nepriamo zvýšením AMP a znížením hladín ATP, pretože AMP a ATP alostericky stimulujú alebo inhibujú aktiváciu AMPK [48, 57]. Napriek tomu CaMKK, čo je kináza upstream od AMPK, môže podporovať aktiváciu AMPK v reakcii na zvýšené hladiny bunkového Ca2 plus bez akejkoľvek zmeny hladín AMP/ATP [58]. Okrem toho, vzhľadom na širokú sieť súhry medzi AMPK a up- a downstream dráhami, je potrebný ďalší výskum na objasnenie základného mechanizmu aktivácie AMPK vyvolanej floretínom.

Naše údaje naznačujú, že aktivácia AMPK sprostredkovaná floretínom stimuluje autofágiu v makrofágoch. Ako bolo uvedené vyššie, aktivácia AMPK je sebaochranný proces, ktorého cieľom je obnoviť energetickú rovnováhu bunky [48]. Hoci žiadna štúdia nikdy nepreukázala, že floretín bol schopný stimulovať fenotyp makrofágov podporou autofágie, niektoré štúdie napriek tomu preukázali účinok floretínu na autofágne dráhy v rakovinových bunkách a hepatocytoch [59-61]. Rôzne štúdie navyše ukazujú, že následné katabolické procesy aktivácie AMPK môžu aktivovať autofágiu [60, 62, 63]. Je zaujímavé, že v reakcii na hladovanie glukózy je autofágia sprostredkovaná AMPK indukovaná fosforyláciou dôležitého iniciátora autofágie unc-51, ako je autofágia aktivujúca kináza [64,65]. Vzhľadom na to predpokladáme, že AMPK stimuluje autofágiu na obnovenie ATP z bunkových zložiek v reakcii na depléciu glukózy vyvolanú florénom. Hladovanie glukózy však môže tiež aktivovať autofágiu spôsobom nezávislým od AMPK [66-68]. Preto je potrebný ďalší výskum, aby sa zistilo, či k aktivácii autofágy floretínom dochádza aj čiastočne nezávisle od AMPK.

Nedávne štúdie ukázali dôležitosť autofágie pri riadení funkčného makrofágového fenotypu. V tomto kontexte bola dysregulácia autofágie v makrofágoch spojená najmä s nástupom aterosklerózy a neurologických ochorení [69-72]. Tu uvádzame spojenie medzi liečbou floretínom, indukciou autofágie a aktiváciou Nrf2 tým, že ukazujeme, že floretín podporuje aktiváciu Nrf2 prostredníctvom p62-sprostredkovanej degradácie Keap1. Až donedávna sa zvýšenie p62 puncta považovalo za znak zníženej autofágie, pretože p62 je degradovaný v autofagozómoch po aktivácii autofágy [34]. V súvislosti s tým je akumulácia p62 spojená s autofagickou dysfunkciou v aterosklerotických léziách [73]. Táto predstava však bola v posledných rokoch spochybnená a teraz sa predpokladá, že p62 je nevyhnutný na tvorbu autofagozómov a že zvýšenie hladín p62 paralelne so zvýšením LC3Il puncta môže byť znakom indukcie autofágie [74]. Preto, spolu so schopnosťou floretínu aktivovať AMPK a jeho známou úlohou pri aktivácii autofágie, naše výsledky naznačujú, že akumulácia P62 a LC3 po liečbe bafilomycínom A1 vo floretínom stimulovaných makrofágoch je spôsobená zvýšeným autofagickým tokom a nie narušeným autofágia. Zaujímavé je, že Lee Y a spol. nedávno ukázali, že okrem aktivácie Nrf2 sa na tvorbe autofagozómov podieľa aj väzba p62 na Keapl, čo naznačuje, že aktivácia autofágy sprostredkovaná floretínom je priamo spojená so zvýšenou aktivitou p62 na jednej strane, ale aj s väčšou interakciou Keapl-p62 na strane druhej [ 75]. Keapl je adaptér ubikvitín ligázy na báze Cullin{27}}, ktorý tvorí homodimér s Nrf2 za homeostatických podmienok, čím podporuje ubikvitináciu Nrf2 a degradáciu proteazómov [76]. Narušenie komplexu Keapl-Nrf2 vedie k stabilizácii Nrf2 a translokácii do jadra [77, 78]. Je dobre zdokumentované, že k narušeniu tohto komplexu dochádza buď modifikáciou cysteínových zvyškov Keapl elektrofilnými molekulami, priamou interakciou malých molekúl s Keapl alebo p62-sprostredkovanou degradáciou Keapl [35]. Ying Y et al. navrhujú priamu interakciu floretínu a Keapl na základe experimentov in silico, čo potom vedie k aktivácii dráhy Nrf2 v bunkovej línii kardiomyocytov [79]. Tu sme vytvorili ďalší mechanizmus súvisiaci s autofágiou, ktorým floretín aktivuje Nrf2.

Použitím modelu EAE sme zistili, že floretín zmierňuje neurozápal in vivo. Naše údaje silne naznačujú, že floretín zlepšuje EAE potlačením zápalovej reakcie sprostredkovanej makrofágmi a aktiváciou dráhy Nrf2. V iných modeloch chorôb sa tiež uvádza, že floretín vykazuje neuroprotektívne a imunomodulačné vlastnosti. Konkrétne sa zistilo, že floretín aktivuje dráhu Nrf2 v mozgu po cerebrálnej ischémii a znižuje akumuláciu amyloidu beta v modeli Alzheimerovej choroby potkanov [80-84]. Floretín môže tiež ovplyvniť iné imunitné bunky in vivo, pretože sa zistilo, že táto zlúčenina inhibuje aktiváciu T buniek a dendritických buniek in vitro [85, 86]. Vzhľadom na to, že neurozápal v modeli EAE nie je čisto závislý od makrofágov, bolo by zaujímavé definovať, do akej miery je zníženie neurozápalu sprostredkované inými imunitnými bunkami. Vzhľadom na to, hoci naše údaje naznačujú, že zlepšenie EAE je riadené hlavne makrofágmi a je menej závislé od modulácie mikroglií, sú potrebné ďalšie experimenty na objasnenie, do akej miery floretín ovplyvňuje mikroglie pri neurozápalových ochoreniach. Celkovo naše zistenia ukazujú, že floretín znižuje neurozápal ovplyvnením fenotypu makrofágov, čo ukazuje terapeutický potenciál floretínu pre neurozápalové poruchy.

Závery

Naša štúdia ukazuje, že floretín je silné imunomodulačné činidlo, ktoré moduluje zápalové vlastnosti makrofágov pri neurozápalových poruchách. Aktivácia dráhy Nrf2, sprostredkovaná aktiváciou autofágy závislou od AMPK a následnou degradáciou Keapl, bola založená na riadení tohto posunu fenotypu. Preto je floretín sľubné prirodzene sa vyskytujúce činidlo, ktoré možno použiť na zníženie zápalovej záťaže neurozápalových ochorení, ako je MS.

Referencie

1. Zeng Y, Peng Y, Tang K, Wang YQ, Zhao ZY, Wei XY a kol. Dihydromyricetín zlepšuje tvorbu penových buniek prostredníctvom LXRalpha-ABCA1/ABCG1-závislého odtoku cholesterolu v makrofágoch. Biomed Pharmacother. 2018;101:543–52. https://doi.org/10.1016/j.biopha.2018.02.124.

2. Xia M, Hou M, Zhu H, Ma J, Tang Z, Wang Q a kol. Antokyány indukujú eflux cholesterolu z myších peritoneálnych makrofágov: úloha dráhy receptora aktivovaného peroxizómovým proliferátorom {gama}-pečeň X receptora {alfa}-ABCA1. J Biol Chem. 2005;280(44):36792–801. https://doi.org/10.{11}}/jbc.M505047200.

3. Chang YC, Lee TS, Chiang AN. Kvercetín zvyšuje expresiu ABCA1 a eflux cholesterolu prostredníctvom ap38-závislej dráhy v makrofágoch. J Lipid Res. 2012;53(9):1840–50. https://doi.org/10.1194/jlr.M024471.

4. Grajchen E, Hendriks JJA, Bogie JFJ. Fyziológia penových fagocytov pri roztrúsenej skleróze. Acta Neuropathol Commun. 2018;6(1):124. https://doi. org/10.1186/s40478-018-0628-8.

5. Podvozok JF, Stinissen P, Hendriks JJ. Podskupiny makrofágov a mikroglie pri roztrúsenej skleróze. Acta Neuropathol. 2014;128(2):191–213. https://doi.org/1 0.1007/s00401-014-1310-2.

6. Baecher-Allan C, Kaskow BJ, Weiner HL. Skleróza multiplex: mechanizmy a imunoterapia. Neuron. 2018;97(4):742–68. https://doi.org/10.1016/j. neurón.2018.01.021.

7. Bogie JFJ, Grajchen E, Wouters E, Corrales AG, Dierckx T, Vanherle S, et al. Stearoyl-CoA desaturáza-1 zhoršuje reparačné vlastnosti makrofágov a mikroglií v mozgu. J Exp Med. 2020; 217(5).

8. Bogie JF, Stinissen P, Hellings N, Hendriks JJ. Makrofágy fagocytujúce myelín modulujú autoreaktívnu proliferáciu T buniek. J Neurozápal. 2011;8(1):85. https://doi.org/10.1186/1742-2094-8-85.

9. Bogie JF, Timmermans S, Huynh-Thu VA, Irrthum A, Smeets HJ, Gustafsson JA, et al. Lipidy odvodené od myelínu modulujú aktivitu makrofágov aktiváciou X receptora v pečeni. PLoS One. 2012;7(9):e44998. https://doi.org/10.1371/ journal.pone.0044998.

10. Bogie JF, Jorissen W, Mailleux J, Nijland PG, Zelcer N, Vanmierlo T a kol. Myelín mení zápalový fenotyp makrofágov aktiváciou PPAR. Acta Neuropathol Commun. 2013; 1 (1): 43. https://doi.org/10.1186/2 051-5960-1-43.