Ako sa fosfoinozitid 3-kinázový inhibítor Alpelisib používa na Loweov syndróm/Dentovu chorobu?

Fosfoinozitid 3-inhibítor kinázy alpelisib obnovuje organizáciu aktínu a zlepšuje dysfunkciu proximálnych tubulov in vitro a na myšom modeli Loweovho syndrómu a Dentovej choroby

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Marine Berquez^1,5, Jonathan R. Gadsby^2,5, Beatrice Paola Festa^1,5, Richard Butler³ , Stephen P. Jackson², Valeria Berno⁴, Alessandro Luciani1 , Olivier Devuyst^1,6a Jennifer L. Gallop^2,6

KĽÚČOVÉ SLOVÁ: cytoskelet; endocytóza; lipidy; proximálny tubul; obličkový Fanconiho syndróm

Mutácie straty funkcie v géne OCRL, ktorý kóduje fosfatidylinozitol [PI] 4,5-bisfosfát [PI(4,5)P2] 5-fosfatázu OCRL, spôsobujú defektnú endocytózu a dysfunkciu proximálnych tubulov vLoweov syndróm a Dentova choroba2. Defekt je spôsobený zvýšenými hladinami PI(4,5)P2 a aberantnou polymerizáciou aktínu, ktorá blokuje endozomálny prenos. PI 3-fosfát [PI(3)P] bol nedávno identifikovaný ako koaktivátor s PI(4,5)P2 v aktínovej dráhe. Tu sme testovali hypotézu, žefosfoinozitid 3-kinázaInhibítory (PI3K) môžu zachrániť endocytický defekt spôsobený stratou OCRL opätovným vyvážením fosfoinozitidových signálov do aktínového mechanizmu. Široký rozsah PI3K(fosfoinozitid 3-kináza)inhibítor copanlisib a trieda IA ​​p110a PI3K(fosfoinozitid 3-kináza) inhibítor alpelisibznížená aberantná polymerizácia aktínu v ľudských obličkových bunkách s deficitom OCRL in vitro. Hladiny PI 3,4,5-trifosfátu, PI(4,5)P2 a PI(3)P boli všetky znížené liečbou alpelisibom a siRNA knockdown PI3K katalytickej podjednotky p110a fenotypoval aktínový fenotyp. V humanizovanom modeli myší OcrlY/- alpelisib redukoval farbenie endozomálneho aktínu a zároveň obnovoval architektúru stresových vlákien a hladiny megalínu na plazmatickej membráne buniek proximálneho tubulu, čo sa odráža v zlepšenom endocytickom vychytávaní proteínov s nízkou molekulovou hmotnosťou in vivo. Naše zistenia teda podporujú súvislosť medzi fosfoinozitidovými lipidmi, polymerizáciou aktínu a prenosom endocytov v proximálnom tubule a predstavujú dôkaz koncepcie opätovného použitia alpelisibu vLoweho syndróm/Dentova choroba2.

Prekladové vyhlásenie

Loweov syndróm a Dentova choroba2, spôsobené mutáciami vo fosfoinozitidovej lipidovej 5-fosfatáze OCRL, prejavujúce sa dysfunkciou proximálneho tubulu a nízkomolekulárnou proteinúriou, pričom je dostupná len podporná starostlivosť. Naše zistenia ukazujú, žefosfoinozitid 3-kináza inhibítor alpelisib, ktorý je v súčasnosti schválený na liečbu rakoviny, zmierňuje aberantnú fosfoinozitidovú rovnováhu a fenotyp aktínu spojený so stratou OCRL, čo spôsobuje podstatné zlepšenie endocytického aparátu a absorpčnej kapacity v bunkových systémoch a humanizovaný myšací model pre Loweov syndróm/Dentovu chorobu 2. Vzhľadom na svoj zdanlivý bezpečnostný profil je alpelisib sľubným kandidátom na opätovné použitie liekuLoweov syndróm a Dentova choroba.

Epitelové bunky vystielajúce proximálne tubuly (PT) obličiek majú účinnú receptorom sprostredkovanú endolyzozomálnu dráhu, ktorá obnovuje a spracováva základné látky, ktoré sú filtrované cez glomerulus. Vrodené poruchy postihujúce endolyzozómy spôsobujú dysfunkciu PT (renálny Fanconiho syndróm) so stratou rozpustených látok a proteínov s nízkou molekulovou hmotnosťou (LMW) močom, často komplikovanou metabolickými a rastovými komplikáciami a rozvojom chronického ochorenia obličiek.¹Inaktivačná mutácia v OCRL bola spojená s Dentovou chorobou 2 (MIM #300555), poruchou charakterizovanou dysfunkciou PT, obličkovými kameňmi a progresívnym zlyhaním obličiek a s okulocerebrorenálnym syndrómom Lowe (MIM #309000), ktorý sa okrem toho prejavuje k dysfunkcii PT a zlyhaniu obličiek, systémovým prejavom, ako sú vrodené katarakty, kognitívne poruchy a hypotónia.^2-4Súčasné liečby Dentovej choroby 2 a Loweho syndrómu sú len podporné.

Obrázok 1|PI3K(fosfoinozitid 3-kináza)inhibítory uvoľňujú aberantné zostavenie aktínu v endozómoch v OCRL-deficientnom modeli ľudskej obličky (HK2). (a) Kroky konverzie fosfoinozitidových lipidov relevantné pre túto štúdiu označujúce konverzie medzi PI(4,5)P2, PI(3,4,5)P2 a PI(3)P s najrelevantnejšími enzýmami tučne, najrelevantnejšie konverzie plnými čiarami a iné prerušovanými čiarami. PI(4,5)P2 je zvýšený pri Loweovom syndróme v dôsledku nedostatočnej 5-fosfatázovej aktivity z OCRL a je tvorený fosforyláciou PI fosfatidylinozitol 4-kinázami (PI4K) a PI(4) P 5-kináza (PIP5K). PI(4,5)P2 je fosforylovaný PI3K I. triedy za vzniku PI(3,4,5)P3. PI(3,4,5)P3 možno defosforylovať na PI(4,5)P2 pomocou PTEN alebo na PI(3,4)P2 pomocou SH-2-obsahujúcich polyfosfáty inozitol 50 (SHIP) 1 a 2, synaptojanin 1 a 2, a tiež OCRL, hoci toto je (pokračovanie)

Obrázok 1|(pokračovanie) považovaný za neplnoletý. PI(3,4)P2 je defosforylovaný na PI(3)P inozitolpolyfosfát-4-fosfatázou typu IA (INPP4A) a B. PI(3)P sa tiež vytvára v endozómoch fosforyláciou PI triedou III PI3K(fosfoinozitid 3-kináza), vakuolárny triediaci proteín Vps34. (b) Western bloty ilustrujúce stratu expresie OCRL v bunkovej línii HK2 OCRL CRISPR knockout (KO) v porovnaní s kontrolnými bunkami HK2 divokého typu (WT) s tubulínom ako kontrolou nanášania. (c – e) Reprezentatívne konfokálne mikrofotografie Airyscan a kvantifikácia skorého endozómového antigénu 1 (EEA1) / aktínového prekrytia (vyjadrené ako percento z celkového počtu detegovaných vezikúl EEA1þ) pre bunky HK2 WT alebo OCRL KO ošetrené buď dimetylsulfoxidom (DMSO) (d) alebo indikovaný inhibítor a fixovaný pomocou fixačného 4 percentného formaldehydu. Vo všetkých prípadoch obrázky ilustrujú jeden z-rez z konfokálneho zväzku buniek spracovaného Airyscanom imunoznačených pre EEA1 (žlté), faloidín (aktín, purpurový) a 40,6-diamidino{ {14}}fenylindol (DAPI) (azúrová). Pruhy=5 mm. Pri kvantifikácii čiary označujú priemer ± SEM a každý údajový bod je individuálna bunka. Vo všetkých experimentoch sa ošetrenie aplikovalo 16 hodín pred fixáciou. Vo všetkých kvantifikáciách bola štatistická významnosť hodnotená Kruskal-Wallisovou (KW) analýzou rozptylu s Dunnovým testom viacnásobného porovnávania. (c) Bunky WT alebo KO ošetrené buď DMSO alebo 100 nM kopanlisibu, čo dokazuje záchranu aktín-endozomálneho prekrytia. KW test: ***P < 0.0{{50}}1,="" viacnásobné="" porovnania;="" wt="" dmso="" versus="" ko="" dmso,="" ko="" dmso="" versus="" ko="" kopanlisib="" obe="" ***p="">< 0,001,="" wt="" kopanlisib="" versus="" ko="" kopanlisib="" p="0,44" (nevýznamné="" [ns]).="" n="52," 85,="" 67="" a="" 63="" buniek="" pre="" wt="" dmso,="" wt="" kopanlisib,="" ko="" dmso="" a="" ko="" kopanlisib.="" (d)="" bunky="" wt="" alebo="" ko="" ošetrené="" buď="" dmso="" alebo="" 10="" mm="" alpelisibu,="" čo="" dokazuje="" záchranu="" aktín-endozomálneho="" prekrytia.="" kw="" test:="" ***p="">< 0,001,="" viacnásobné="" porovnania;="" wt="" dmso="" verzus="" ko="" dmso,="" ko="" dmso="" verzus="" ko="" alpelisib="" obe="" ***p="">< 0,001,="" wt="" alpelisib="" verzus="" ko="" alpelisib.="" p=""> 0,99 (ns). N=31, 30, 43 a 41 buniek pre WT DMSO, WT alpelisib, KO DMSO a KO alpelisib, v danom poradí. (e) WT alebo KO bunky ošetrené buď DMSO, 10 mM GSK2636771 alebo 10 mM idelalisibu, čo dokazuje, že žiadna zlúčenina nie je schopná významne znížiť aktín-endozomálne prekrytie. KW test: ***P < 0,001,="" viacnásobné="" porovnania;="" wt="" dmso="" verzus="" ko="" dmso,="" ***p="">< 0,001,="" ko="" dmso="" verzus="" ko="" gsk,="" *p="0,04," ko="" dmso="" verzus="" ko="" idelalisib,="" p=""> 0,99 (ns). N=159, 130, 203, 122, 131 a 145 buniek pre WT DMSO, WT GSK2636771, WT idelalisib, KO DMSO, KO GSK2636771, respektíve KO idelalisib. Ak chcete optimalizovať zobrazovanie tohto obrázka, pozrite si online verziu tohto článku na adrese www.kidney-international.org

Ako sa fosfoinozitid 3-inhibítor kinázy alpelisib používa pri Loweovom syndróme/Dentovej chorobe?

LMW proteinúria je konzistentným znakom pozorovaným pri Loweovom syndróme/Dentovej chorobe 2, čo odhaľuje, že OCRL ovplyvňuje receptorom sprostredkovanú endocytózu.⁵OCRL kóduje fosfatidylinozitol (PI) 4,5-bisfosfát [PI(4,5)P2] 5- fosfatázu OCRL,⁶ktorý kontroluje identitu lipidov v endolyzozomálnej dráhe degradáciou PI(4,5)P2 (obrázok 1a). Nedostatočná degradácia PI(4,5)P2 prostredníctvom OCRL sa podieľa na zlyhaní odstránenia vezikúl potiahnutých klatrínom vo fibroblastoch, čo je sprevádzané tvorbou „kométových“ štruktúr polymerizovaného vláknitého aktínu z výsledných aberantných skorých organel podobných endozómom.^7-9V iných typoch buniek, najmä v PT bunkách obličiek, vedie nedostatok OCRL k štruktúram „koša“ F-aktínu obklopujúcich aberantné endolyzozomálne organely.¹⁰Nadbytok F-aktínu blokuje prenos membrány cez endocytickú a endolyzozomálnu dráhu a predpokladá sa, že znižuje recykláciu megalínu multiligandového receptora do apikálnej membrány, čím sa zhoršuje defekt v endolyzozomálnej dráhe.¹¹V súlade s hlavnou úlohou aberantného F-aktínu je defektné vychytávanie endocytov spôsobené mutáciami OCRL zmiernené zacielením aktínového aparátu latrunkulínom B alebo depléciou aktínových regulačných proteínov, ako aj malou, interferujúcou RNA (siRNA) sprostredkovanou depléciou PI(4)P 5-kinázy na úpravu syntézy PI(4,5)P2^7,10(Obrázok 1a).

Polymerizácia aktínu sa čoraz viac chápe ako vznikajúca nielen z PI(4,5)P2, ale aj z iných fosfoinozitidových lipidov. Napríklad PI(3,4,5)P3 aktivuje GTPázu Rho typu Rac a PI(3)P pôsobí v spojení s PI(4,5)P2 na stimuláciu polymerizácie aktínu po smere inej GTPázy Rho typu, Cdc42.^12-14Vzájomná konverzia týchto fosfoinozitídov je spojená s pohybom lipidov cez endocytickú a endozomálnu dráhu. PI(4,5)P2 je fosforylovaný fosfatidylinozitol- 30 -kinázou triedy I (PI3K) na PI(3,4,5)P3 na plazmatickej membráne a postupne sa defosforyluje na PI(3,4)P2 a PI (3)P alebo PI(4,5)P2.^14,15PI(3)P je obohatený na endozómoch, kde je nevyhnutný pre ich funkciu a vyrába sa prevažne priamou fosforyláciou PI triedou III PI3K(fosfoinozitid 3-kináza), Vps34¹⁶(Obrázok 1a). V OCRL-deficientnej retinálnej pigmentovej epiteliálnej (RPE) bunkovej línii sú generované aktínové kométy znížené pôsobením PI3K(fosfoinozitid 3-kináza)inhibítory wortmannín a Vps{0}}IN1, v súlade s biochemickými štúdiami, ktoré ukazujú koreguláciu aktínu prostredníctvom koincidencie PI(3)P a PI(4,5)P2.¹⁴

Záchrana endocytózy pozorovaná pri zacielení na aktínový mechanizmus u pacientov s OCRL a knockout (KO) buniek,^7,10spolu s upstream reguláciou aktínu pomocou PI3K(fosfoinozitid 3-kináza)činnosť¹⁴a vysoko prepojená povaha konverzie PI poskytuje zaujímavú možnosť, že trieda I PI3K(fosfoinozitid 3-kináza)inhibítory môžu byť užitočné pri Loweovom syndróme. Takéto inhibítory vyvinuté na terapiu rakoviny sú schválené na klinické použitie¹⁷a sú teda potenciálne prístupné pre opätovné použitie lieku. Hoci zlúčeniny ako copanlisib¹⁸majú širokú špecifickosť a vedľajšie účinky, nedávny úspech bol preukázaný pre špecifickejšie inhibítory. idelalisib,¹⁹ktorý sa zameriava na PI3K(fosfoinozitid 3-kináza)podjednotka p110d je schválená pre chronický lymfocytový lymfóm a alpelisib, ktorý sa zameriava na p110a, je schválený na použitie pri rakovine prsníka.^20,21Okrem toho alpelisib preukázal klinický prínos u detí so syndrómom PROS/CLOVES,²²zriedkavý syndróm prerastania, ktorý je výsledkom aktivácie PIK3A.

Tu sme testovali hypotézu, že trieda I PI3K(fosfoinozitid 3-kináza)inhibítory môžu zachrániť endocytický defekt v dôsledku straty OCRL pomocou zavedených bunkových a myších modelov.^10,11,23Ukazujeme, že inhibícia PI3K(fosfoinozitid 3-kináza)aktivita prostredníctvom copanlisibu alebo alpelisibu alebo deplécia alpelisib-cieľovej katalytickej podjednotky p110a sprostredkovaná siRNA znižuje nadmernú polymerizáciu aktínu v bunkách ľudskej obličky (HK2) s deficitom OCRL. Zamerajúc sa na alpelisib ako najšpecifickejšiu zlúčeninu na klinické použitie, ukazujeme, že znižuje polymerizáciu aktínu a zlepšuje absorpciu endolyzozomálnou dráhou v PT bunkách z humanizovaného Ocrl^Y/-myši in vitro. Okrem toho liečba alpelisibom in vivo zmierňuje proteinúriu, znižuje dysfunkciu PT a zachraňuje bunkové hladiny megalínu v humanizovanom Ocrl^Y/-myši. Tieto výsledky podporujú alpelisib ako kandidáta na opätovné použitie liekuLoweov syndróm a Dentova choroba 2.

Obrázok 2|Účinky Alpelisibu na aktín sú závislé od dávky a sú rekapitulované siRNA z PI3K (fosfoinozitid 3-kináza)p110a. (a) Reprezentatívne konfokálne mikrofotografie Airyscan (fixované pomocou 4-percentného formaldehydového fixu a imunoznačené pre skorý endozómový antigén 1 [EEA1], žltý; aktín [faloidín], purpurový; a 4{{40}}, {{ 5}}diamidino-2-fenylindol [DAPI], azúrová; stĺpce=5 mm) a kvantifikácia buniek ľudskej obličky divokého typu (WT) alebo knockout (KO) buniek (HK2) ošetrených dimetylsulfoxidom (DMSO) alebo indikované dávky alpelisibu počas 16 hodín, čo dokazuje záchranu aktín-endozomálneho prekrytia v závislosti od dávky. Vo všetkých prípadoch čiary označujú priemer ± SEM a body označujú jednotlivé bunky. N=31, 30, 71, 42, 90, 89, 41, 69, 66 a 67 buniek pre kontrolu WT, WT 10 mM, WT 50 mM, KO DMSO a KO 2,5, 5, 10, 15, 25 a 50 mM alpelisibu, v danom poradí. Štatistická významnosť hodnotená Kruskal-Wallisovým (KW) testom s Dunnovým testom viacnásobného porovnania: celkovo ***P < 0,001,="" viacnásobné="" porovnania;="" wt="" dmso="" verzus="" ko="" dmso,="" ko="" dmso="" verzus="" ko="" 5,="" 15,="" 25="" a="" 50="" mm="" alpelisib="" všetky="" ***p="">< 0,001,="" ko="" dmso="" verzus="" ko="" 2,5="" mm="" alpelisib="" *p="0,0131," ko="" 10dmso="" verzus="" mm="" alpelisib="" **p="0,0043," wt="" dmso="" oproti="" wt="" 10="" a="" 50="" mm="" alpelisibu="" p=""> 0,9999 (nevýznamné [ns]). (b) Western blot pre p110a a nanášanie kontrolného a-tubulínu buniek WT alebo KO ošetrených buď scramble (Scram.) alebo p110a siRNA. (c) Reprezentatívne konfokálne mikrofotografie Airyscan (fixované pomocou fixácie 4 percent formaldehydu a imunoznačené pre EEA1, žltá; aktín [faloidín], purpurová; a DAPI, azúrová; stĺpce=5 mm) a kvantifikácia ošetrených buniek WT alebo KO buď so scramble (S) alebo p110a siRNA, čo demonštruje redukciu prekrytia EEA1-aktínu pri deplécii p110a. KW test s Dunnovým testom viacnásobného porovnania: ***P < 0,001,="" viacnásobné="" porovnania;="" wt="" scramble="" versus="" ko="" scramble,="" ko="" scramble="" oproti="" ko="" p110a="" sirna="" obe="" ***p="">< 0,001.="" n="79," 108,="" 93="" a="" 131="" buniek,="" v="" tomto="" poradí.="" hk2,="" ľudská="" oblička;="" pi3k,="" fosfatidylinozitol-30="" -kináza;="" sirna,="" malá,="" interferujúca="" rna.="" ak="" chcete="" optimalizovať="" zobrazovanie="" tohto="" obrázka,="" pozrite="" si="" online="" verziu="" tohto="" článku="" na="" adrese="">

Obrázok 3|Hladiny fosfatidylinozitolu (PI) 4,5-bisfosfátu [PI(4,5)P2] sa zvyšujú s knockoutom OCRL (KO) a PI(3,4,5)P3, PI(4,5)P2 a PI(3)P sú potlačené liečbou alpelisibom. Vo všetkých experimentoch boli uvedené ošetrenia aplikované 16 hodín pred fixáciou. Pri kvantifikácii čiary označujú priemer ± SEM a každý údajový bod je výsledkom individuálnej bunky. Vo všetkých kvantifikáciách bola štatistická významnosť hodnotená Kruskal-Wallisovou (KW) analýzou rozptylu s Dunnovým testom viacnásobného porovnávania. Pruhy=20mm na všetkých obrázkoch. a ) Reprezentatívne širokopásmové mikrofotografie divokého typu (WT) alebo KO buniek ľudskej obličky (HK2) ošetrených dimetylsulfoxidom (DMSO) alebo 10 mM alpelisibu a potom fixované fixáciou plazmatickej membrány a imunoznačené na PI (3,4,5 )P3 (červená) a 40,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) (azúrová), s kvantifikáciou strednej intenzity bunkového značenia PI(3,4,5)P3, ktorá ukazuje účinnosť alpelisibu spracovanie na PI(3,4,5)P3 syntéze. N=96, 128 a 109 buniek pre WT DMSO, WT alpelisib, KO DMSO a KO alpelisib, v danom poradí. KW (pokračovanie)

Obrázok 3|(pokračovanie) test: celkovo ***P < 0.001,="" viacnásobné="" porovnania;="" wt="" dmso="" verzus="" ko="" dmso,="" wt="" dmso="" verzus="" wt="" alpelisib="" a="" ko="" dmso="" verzus="" ko="" alpelisib="" všetky="" ***p="">< 0.0{{70}}1.="" (b)="" reprezentatívne="" konfokálne="" mikrofotografie="" buniek="" wt="" alebo="" ko="" hk2="" ošetrených="" buď="" dmso,="" 10="" mm-="" alebo="" 50-mm="" alpelisibom="" počas="" 16="" hodín="" a="" potom="" fixované="" golgiho="" fixom="" a="" označené="" pomocou="" m="" ch="" {{10}}xfyve="" pi(3)p="" sonda="" (purpurová)="" a="" dapi="" (azúrová)="" s="" kvantifikáciou="" počtu="" pi(3)p-pozitívnych="" bodiek="" zistených="" v="" bunkách="" ošetrených="" rozsahom="" koncentrácií="" alpelisibu="" ,="" ako="" je="" uvedené,="" ukazuje,="" že="" pi(3)p-pozitívne="" bodky="" sú="" redukované="" spôsobom="" závislým="" od="" dávky.="" n="280," 254,="" 210,="" 287,="" 324,="" 239,="" 340,="" 250,="" 240="" a="" 215="" buniek="" pre="" kontrolu="" wt,="" wt="" 10="" mm,="" wt="" 50="" mm,="" ko="" dmso="" a="" ko="" 2,5,="" 5,="" 10,="" 25="" a="" 50="" mm="" alpelisibu,="" v="" danom="" poradí.="" kw="" test:="" celkovo="" ***p="">< 0,001,="" viacnásobné="" porovnania;="" wt="" dmso="" verzus="" ko="" dmso,="" wt="" dmso="" verzus="" wt="" 10="" a="" 50="" mm="" alpelisib,="" ko="" dmso="" verzus="" ko="" 50="" mm="" alpelisib="" všetky="" ***p="">< 0,001;="" ko="" dmso="" oproti="" ko="" 2,5="" a="" 5="" mm="" alpelisibu="" obe="" p=""> 0,9999 (nevýznamné [ns]); KO DMSO verzus KO 10 mM alpelisib **P=0,0049; KO DMSO verzus KO 25 mM alpelisib ***P=0.0002. (c) Reprezentatívne širokopásmové mikrofotografie buniek WT alebo KO HK2 ošetrených DMSO alebo 10 mM alpelisibu a potom fixované fixáciou plazmatickej membrány a imunoznačené pre PI (4,5) P2 (žltá) a DAPI (azúrová), s kvantifikáciou priemerná intenzita bunkového značenia PI(4,5)P2, ukazujúca zvýšený PI(4,5)P2 plazmatickej membrány v KO bunkách, ktorý je znížený liečbou alpelisibom, konkrétne v KO bunkách. N=126, 112, 85 a 116 buniek pre WT DMSO, WT alpelisib, KO DMSO a KO alpelisib, v danom poradí. KW test: celkovo ***P < 0,001,="" viacnásobné="" porovnania;="" wt="" dmso="" verzus="" ko="" dmso="" a="" ko="" dmso="" verzus="" ko="" alpelisib="" obe="" ***p="">< 0,001;="" wt="" dmso="" verzus="" wt="" alpelisib="" p="0.4752" (ns).="" (d)="" reprezentatívne="" širokopásmové="" mikrofotografie="" buniek="" wt="" alebo="" ko="" hk2="" ošetrených="" dmso="" alebo="" 10="" mm="" alpelisibu="" a="" potom="" fixované="" 4%="" formaldehydovou="" fixáciou="" a="" imunoznačené="" pre="" pi="" (4,5)="" p2="" (žltá)="" a="" dapi="" (azúrová),="" s="" kvantifikáciou="" počtu="" pi(4,5)p2-pozitívnych="" punktov,="" vykazujúcich="" zvýšený="" pi(4,5)p2="" punkt="" v="" ko="" bunkách,="" ktorý="" je="" znížený="" liečbou="" alpelisibom,="" konkrétne="" v="" ko="" bunkách.="" n="75," 65,="" 52="" a="" 69="" buniek="" pre="" wt="" dmso,="" wt="" alpelisib,="" ko="" dmso="" a="" ko="" alpelisib,="" v="" danom="" poradí.="" kw="" test:="" celkovo="" ***p="">< 0,001,="" viacnásobné="" porovnania;="" wt="" dmso="" verzus="" ko="" dmso="" a="" ko="" dmso="" verzus="" ko="" alpelisib="" obe="" ***p="">< 0,001;="" wt="" dmso="" verzus="" wt="" alpelisib="" p=""> 0,99 (ns). au, ľubovoľné jednotky. Ak chcete optimalizovať zobrazovanie tohto obrázka, pozrite si online verziu tohto článku na adrese www.kidney-international.org.

Ako sa fosfoinozitid 3-inhibítor kinázy alpelisib používa pri Loweovom syndróme/Dentovej chorobe?

1. VÝSLEDKY

1.1 Inhibítory PI3K triedy I znižujú agregáciu aktínu v bunkách OCRL-KO HK2

Použili sme úpravu génu CRISPR-Cas9 na knockout (KO) OCRL v bunkovej línii HK2, aby sme umožnili testovanie triedy I PI3K (fosfoinozitid 3-kináza)inhibítory charakteristickej agregácie aktínu v endolyzozomálnych kompartmentoch.^7,9,10,14Western blot overil 98.0 ± 0,7 percentné zníženie expresie OCRL v lyzátoch z buniek KO HK2 (obrázok 1b). OCRL KO rekapituloval fenotyp aktínového koša v bunkách HK2, ako naznačuje zvýšené prekrývanie medzi F-aktínom a skorým endozómovým antigénom 1 (EEA1), kvantifikovaným na konfokálnych mikroskopických z-stakoch Airyscan (obrázok 1c–e). Toto zvýšené prekrývanie pozorované v bunkách OCRL KO bolo zvrátené liečbou copanlisibom (C), širokospektrálnym PI3K (fosfoinozitid 3-kináza)inhibítor, ktorý sa zameriava na p110a a d a v menšej miere na izoformy p110b a g (obrázok 1c). Westernovým prenosom celobunkových extraktov HK2 sme zistili, že PI3K(fosfoinozitid 3-kináza)Regulačné podjednotky p110 a, b a d boli všetky dobre exprimované v bunkách divokého typu (WT) aj KO, pričom boli prítomné iba stopové hladiny izoformy p110g (doplnkový obrázok S1A).

Rozlišovali sme PI3K(fosfoinozitid 3-kináza)špecifickosť inhibície F-aktínu pomocou alpelisibu (A), selektívneho inhibítora p110a, a GSK2636771 (G) a idelalisibu (I), selektívnych inhibítorov p110b a p110d (doplnkový obrázok S1A). Hoci liečba alpelisibom poskytla podobné zníženie polymerizácie endozomálneho aktínu v porovnaní s kopanlisibom (obrázok 1d), GSK2636771 a idelalisib mali malý vplyv na akumuláciu aktínu (obrázok 1e). Trieda I PI3K(fosfoinozitid 3-kináza)inhibítory nemali žiadnu zvýšenú toxicitu na OCRL KO v porovnaní s nemodifikovanými bunkami na základe testu MTT (doplnkový obrázok S1B).

1.2 Knockdown Alpelisib a p110a zachraňujú aktínový fenotyp v bunkách HK2

Pre naše nasledujúce štúdie sme sa zamerali na alpelisib, pretože je to najselektívnejší a najmenej toxický PI3K(fosfoinozitid 3-kináza)doteraz vyvinutý inhibítor, ktorý sa v súčasnosti používa na liečbu mozaikovej nadmernej aktivácie PI3K triedy Ia u detí so syndrómom PROS/CLOVES.²²Alpelisib redukoval aktínové koše v bunkách OCRL KO HK2 spôsobom závislým od dávky (obrázok 2a). Účinky boli pozorované pri dávke 10 mM už 4 hodiny po liečbe, bez zjavnej toxicity (doplnkový obrázok S2). Ak chcete otestovať, či PI3K(fosfoinozitid 3-kináza)inhibícia alpelisibom bola zdrojom zníženého zafarbenia aktínu, špecificky sme znížili jeho cieľ, podjednotku p110a, pomocou siRNA (obrázok 2b). V porovnaní s liečbou kontrolnou (sekvenčne zmiešanou) siRNA, siRNA proti p110a poskytla 78,3 ± 4,8 percenta a 68,9 ± 7,7 percenta depléciu proteínu p110a v bunkách WT a OCRL KO HK2, čo sa odráža vo významnom znížení aktínových košov ( Obrázok 2c).

1.3 Znížené hladiny PI(3,4,5)P3, PI(4,5)P2 a PI(3)P v bunkách HK2 ošetrených alpelisibtom

Aby sme zistili, ako sú fosfoinozitidové lipidy ovplyvnené liečbou OCRL KO a alpelisibom, zafarbili sme bunky HK2 protilátkami alebo proteínovými doménami proti PI(3,4,5)P3, PI(3)P a PI(4,5)P2 pomocou optimalizované podmienky fixácie pre plazmatickú membránu alebo intracelulárne farbenie.^24,25PI(3,4,5)P3 má difúznu lokalizáciu na plazmatickej membráne a liečba alpelisibom (10 mM) vyvolala výrazné zníženie zafarbenia na PI(3,4,5)P3 v bunkách WT aj OCRL KO, ako očakáva sa od jeho mechanizmu účinku a špecifickosti pre triedu IA PI3K(fosfoinozitid 3-kináza)p110a (obrázok 3a). Očakáva sa, že PI(3,4,5)P3 bude progresívne defosforylovaný, pretože membrány sú endocytózované a transportované do endozómov.^14,26,27Fixáciou buniek tak, aby sa zachoval intracelulárny PI(3)P,²⁵zistili sme, že PI(3)P punctae boli tiež znížené liečbou alpelisibom (v závislosti od dávky zrejmým z koncentrácií tak nízkych ako 10 mm pre 16-hodinovú liečbu) v bunkách WT aj OCRL KO (obrázok 3b a doplnkový obrázok S2C). Ako sa očakávalo, KO OCRL v bunkách HK2 vyvolalo výrazné zvýšenie hladín PI (4, 5) P2 na plazmatickej membráne (obrázok 3c) aj intracelulárne (obrázok 3d) v porovnaní s bunkami WT.^10,28Liečba alpelisibom výrazne znížila zvýšenie PI(4,5)P2 generovaného OCRL KO v oboch kompartmentoch, zatiaľ čo nemalo žiadny účinok na bunky WT (obrázok 3c a d). Uvádza sa, že alelisib inhibuje PI 4-kinázu b s 50 percentnou inhibičnou koncentráciou 0,5 mM,¹⁹čo je možný zdroj zníženia PI(4,5)P2. Súhrnne naše údaje naznačujú, že alpelisib inhibuje zostavenie aktínu na endozómoch OCRL KO prostredníctvom bišpecifického účinku na hladiny PI (4, 5) P2 a PI (3) P.

Obrázok 4|Alpelisib zmierňuje aktínové defekty Oral v kultivovanom humanizovanom Ocrl^Y/-myšie PTC (m PTC). (a) Reprezentatívne snímky z konfokálneho mikrosnímku s maximálnou intenzitou Z-projekcie OcrlY/þ alebo Ocrl^Y/-m PTC ošetrené dimetylsulfoxidom (DMSO) alebo 10 mM alpelisibu počas 16 hodín a potom fixované 4-percentným formaldehydovým fixom a imunoznačené na aktín (faloidín) (biely) a 40,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) (modrá), s kvantifikáciou stupňa, v akom sú stresové vlákna prítomné v každom stave, čo ukazuje, že stresové vlákna sa stratili v Ocrl^Y/-m PTC sú zachránené liečbou alpelisibom. Čiary označujú priemer ± SEM a dátové body označujú každú oblasť zobrazenia: N=5 oblastí zobrazenia na stav (každá obsahuje približne 15–20 buniek). Významnosť bola hodnotená bežným 1-spôsobom analýzy rozptylu (ANOVA) s Holm-Sidakovým testom viacnásobného porovnania, **P=0.001, viacnásobné porovnania; Ocrl Y/þ DMSO verzus Ocrl^Y/-DMSO **

P=0.002, Ocrl^Y/-DMSO verzus Ocrl^Y/-alpelisib **P=0.004, OcrlY/þ DMSO versus Ocrl^Y/- alpelisib P=0.50 (nevýznamné [ns]). Pruhy=20 mm. (b) Reprezentatívne 3D povrchové vykreslenia Ocrl m PTC s vysokým zväčšením ošetrené DMSO alebo 10 mM alpelisibu počas 16 hodín a potom fixované 4-percentným formaldehydovým fixom a imunoznačené pre skorý endozómový antigén 1 (EEA1) (fialový), aktín ( faloidín, žltá) a DAPI (modrá) a kvantifikácia ilustrujúca záchranu aktín-endozomálneho prekrytia alpelisibom. Pohľady s menším zväčšením označujúce prehľady (pokračovanie)

Obrázok 4|(pokračovanie) tieto oblasti sú zobrazené na doplnkovom obrázku S4B a doplnkových filmoch S1 – S3. Čiary označujú priemer ± SEM. N=42, 47 a 45 náhodne vybraných polí pre OcrlY/þ þ DMSO, Ocrl^Y/-þ DMSO a Ocrl^Y/-þ stavy alpelisibu, v tomto poradí, v každom prípade spojené zo 4 myších obličiek na stav. Významnosť bola testovaná pomocou Kruskal-Wallis (KW) ANOVA s Dunnovým testom viacnásobného porovnania: celkovo ***P < 0,001,="" viacnásobné="" porovnania;="" ocrly/þ="" dmso="" verzus="">^Y/-DMSO a Ocrl^Y/-DMSO verzus Ocrl^Y/-alpelisib ***P < 0.001;="" ocrly/þ="" dmso="" verzus="">^Y/-alpelisib P > 0,99 (ns). Pruhy=1 mm. c) Reprezentatívne konfokálne mikrofotografie OcrlY/þ alebo Ocrl^Y/-m PTC ošetrené DMSO alebo 10-mM alpelisib a potom fixované Golgiho fixom a označené pomocou m Ch-2xFYVE PI(3)P sondy (purpurová) a DAPI (azúrová), s kvantifikáciou počet PI(3)P-pozitívnych bodov detegovaných v bunkách. N=188, 177, 246 a 206 buniek z OcrlY/þ þ DMSO, OcrlY/þ þ alpelisib, Ocrl^Y/-þ DMSO a Ocrl^Y/-þ alpelisib, v tomto poradí; bunky boli spojené z 3 orálnych obličiek na skupinu. KW test: celkovo ***P < 0.001,="" viacnásobné="" porovnania;="" ocrly/þ="" dmso="" verzus="">^Y/-DMSO, OcrlY/þ DMSO verzus OcrlY/þ alpelisib a Ocrl^Y/-DMSO verzus Ocrl^Y/-alpelisib, všetky ***P < 0.001.="" pruhy="20" mm.="" (d)="" reprezentatívne="" konfokálne="" mikrofotografie="" ocrly/þ="" alebo="">^Y/-m PTC ošetrené DMSO alebo 10 mM alpelisibu počas 16 hodín, potom fixované 4-percentným formaldehydovým fixom a imunoznačené na fosfatidylinozitol (PI) 4, 5-bisfosfát [PI(4,5) P2] (žltý) a DAPI (azúrová), s kvantifikáciou počtu PI(4,5)P2-pozitívnych bodiek, vykazujúcich zvýšený bod PI(4,5)P2 v Ocrl^Y/-buniek, ktorý je znížený liečbou alpelisibom. N=477, 444, 423 a 494 z OcrlY/þ þ DMSO, OcrlY/þ þ alpelisib, Ocrl^Y/-þ DMSO a Ocrl^Y/-þ alpelisib, v tomto poradí; bunky boli spojené z 3 orálnych obličiek na skupinu. KW test: celkovo ***P < 0.001,="" viacnásobné="" porovnania;="" ocrly/þ="" dmso="" verzus="">^Y/-DMSO, OcrlY/þ DMSO verzus OcrlY/þ alpelisib a Ocrl^Y/-DMSO verzus Ocrl^Y/-alpelisib, všetky ***P < 0.001.="" pruhy="20" mm.="" ak="" chcete="" optimalizovať="" zobrazovanie="" tohto="" obrázka,="" pozrite="" si="" online="" verziu="" tohto="" článku="" na="" adrese="">

1.4 Alpelisib znižuje intracelulárne fosfoinozitidy a zmierňuje cytoskeletálne defekty pri Ocrl^Y/-m PTC

Ďalej sme testovali, či mal alpelisib rovnaké účinky v primárnych bunkách PT buniek odvodených z humanizovaného modelu Ocrldefificient myší (Ocrl^Y/-), ktorý rekapituluje abnormálnu polymerizáciu aktínu a endocytický defekt pozorovaný v bunkách získaných od pacienta.^10,11Myšie PTC (m PTC) exprimované podobne ako trieda I PI3K (fosfoinozitid 3-kináza) regulačné podjednotky k bunkám HK2 vo WT aj Ocrl^Y/-myši a pri hodnotení pomocou testov MTT (doplnkový obrázok S3) vykazovali podobný profil toxicity voči alpelisibu. Zobrazovanie konfokálnou mikroskopiou odhalilo výrazné narušenie normálnej architektúry F-aktínových stresových vlákien v m PTC od Ocrl^Y/-v porovnaní s myšami OcrlY/þ, pravdepodobne v dôsledku premiestnenia aktínových regulačných proteínov z ich normálnych bunkových umiestnení do endozómov, pretože tieto organely obklopujú veľké zostavy aktínu a predpokladá sa, že sú pôvodom defektu obchodovania.^10,29Liečba Ocrl^Y/- m PTC s alpelisibom (10 mM) obnovili architektúru stresového vlákna (obrázok 4a).

Ako sa fosfoinozitid 3-inhibítor kinázy alpelisib používa pri Loweovom syndróme/Dentovej chorobe?

Ako hlavný problém vLoweov syndróm a Dentova choroba2 je znížený endozomálny prenos a následná degradácia megalínu, snažili sme sa odlíšiť endozomálny aktín od stresových vlákien. Zhromaždili sme konfokálne z-zásobníky laserového skenovania v bunkách, zrekonštruovali sme vzor farbenia v 3D vykresľovaní povrchu a použili sme tvar / parametre veľkosti na identifikáciu bodových aktínových štruktúr a miery, do akej sa prekrývajú s endozomálnymi štruktúrami (doplnkový obrázok S4 a filmy S1 -S3). Táto analýza odhalila, že ošetrenie alpelisibom znížilo aberantnú polymerizáciu F-aktínu v endozómoch zafarbených EEA1, na rozdiel od architektúry stresového vlákna (obrázok 4b). m PTC odvodené od Ocrl^Y/-myši vykazovali významné zmeny v intracelulárnom farbení pre PI(3)P (znížené) a PI(4,5)P2 (zvýšené) v porovnaní s m PTC z myší WT OcrlY/þ (obrázok 4c a d). Liečba m PTC z Ocrl^Y/- myši s alpelisibom viedlo k významnému zníženiu intracelulárneho farbenia PI(3)P a PI(4,5)P2 (obrázok 4c a d).

1,5 Alpelisib zlepšuje vychytávanie endocytmi v Ocrl^Y/-m PTC

Ďalej sme hodnotili, či účinok alpelisibu na cytoskeletálne a vezikulárne defekty pozorované v m PTC viedol k zmenám v kapacite endocytového vychytávania. Aby sa rozlíšil účinok alpelisibu na väzbu a/alebo internalizáciu ligandu, m PTC sa najprv inkubovali so značeným hovädzím sérovým albumínom (BSA), aby sa indukovala väzba sondy na endocytické receptory, a potom sa inkubovali s rastovým médiom, aby sledovať internalizáciu albumínu (obrázok 5a). The Ocrl^Y/-bunky vykazovali nižšiu plazmatickú membránovú väzbu Alexa 488-hovädzieho sérového albumínu spolu so zhoršenou internalizáciou albumínu v porovnaní s bunkami OcrlY/þ. Liečba alpelisibom zachránila väzbu aj vychytávanie albumínu v Ocrl^Y/-bunky, s 50-percentnou celkovou záchranou endocytickej absorpcie (obrázok 5b a c). Tieto údaje boli podporené meraním celkového vychytávania albumínu (doplnkové obrázky S5a a b). Zaznamenali sme, že pomer internalizovaného / viazaného Alexa 488- hovädzieho sérového albumínu zostal podobný medzi rôznymi stavmi (obrázok 5d), čo naznačuje, že znížené vychytávanie albumínu je spôsobené skôr zhoršenou väzbou ako chybným procesom internalizácie.

1.6 Alpelisib zlepšuje dysfunkciu PT a receptorom sprostredkovanú endocytózu u Ocrl^Y/- myši

Testovali sme potenciálny terapeutický účinok alpelisibu na dysfunkciu PT in vivo. Orálnym myšiam sa podávalo buď vehikulum alebo alpelisib (50 mg/kg telesnej hmotnosti na deň) orálnou sondou počas 6 týždňov (obrázok 6a). Tento režim bol vybraný podľa predchádzajúcich štúdií in vivo preukazujúcich účinnosť a bezpečnosť.^22,30V súlade s tým, že je známe, že podávanie alpelisibu spôsobuje inzulínovú rezistenciu a hyperglykémiu,²²liečba alpelisibom viedla k významnému zvýšeniu glykozúrie u Ocrl Y/þ aj pri perorálnom podaní^Y/-myši, ktoré by sa mohli považovať za biomarker na dávkovanie lieku (doplnková tabuľka S1). Po 6 týždňoch liečby alpelisibom sa Ocrl^Y/-myši vykazovali významné zníženie vylučovania LMW proteínov CC16 (-34 percent) a albumínu (-38 percent) močom v porovnaní s kontrolami ošetrenými vehikulom (obrázok 6b a c), zatiaľ čo objem moč a ďalšie parametre neboli ovplyvnené (doplnková tabuľka S1). Myši oboch genotypov liečené Alpelisibom vykazovali podobné zníženie rýchlosti rastu v porovnaní s kontrolnými myšami, ako bolo opísané vyššie.²²Napriek tomu vehikulum aj liečené myši získali telesnú hmotnosť, čo naznačuje, že liek vážne neovplyvňuje postnatálny vývoj (obrázok 6d a doplnková tabuľka S1).

Aby sme otestovali, či účinok alpelisibu na proteinúriu LMW odrážal obnovenie receptorom sprostredkovanej endocytózy v PT bunkách, sledovali sme in vivo príjem b-laktoglobulínu značeného Cy5- v obličkách myši. Alpelisibom liečený Ocrl^Y/-myši vykazovali významnú záchranu vychytávania b-laktoglobulínu značeného Cy5-, blízko rozsahu internalizácie pozorovaného u myší OcrlY/þ liečených vehikulom (obrázok 6e). Toto sa odrážalo vo významnej záchrane pri expresii endocytického receptorového megalínu v PT bunkách, ako sa pozorovalo imunoznačením a westernovým prenosom obličkových lyzátov Ocrl liečených alpelisibom^Y/-myši; všimnite si, že nedošlo k žiadnej zmene v expresii PT markera AQP1 (obrázok 6f a g a doplnkový obrázok S5C a D). Tieto údaje ukazujú, že PI3K(fosfoinozitid 3-kináza)inhibítor alpelisibindukuje podstatné zlepšenie PT endocytického aparátu a znižuje LMW proteinúriu v humanizovanom myšom modeli pre Loweov syndróm.

Obrázok 5|Alpelisib zlepšuje endocytické vychytávanie humanizovaného Ocrl^Y/-myšie PTC (m PTC). (a) Schéma znázorňujúca experiment pulzného prenasledovania, ktorý sa používa na skúmanie väzby a internalizácie Alexa 488-hovädzieho sérového albumínu (BSA) do m PTC. Bunky sa vystavili pôsobeniu Alexa 488-BSA (0,2 mg/ml) počas 1 hodiny pri 4 stupňoch, aby sa BSA umožnilo naviazať sa na receptory bunkového povrchu (pulz) a potom sa zahriali na 37 stupňov v bunkovom médiu 20 minút pred fixáciou, aby sa umožnila internalizácia ligandu (chase). b) Reprezentatívne konfokálne mikrofotografie OcrlY/þ alebo Ocrl^Y/-m PTC ošetrené dimetylsulfoxidom (DMSO) alebo 10 mM alpelisibu počas 16 hodín a podrobené Alexa 488-BSA (zelenému) pulznému experimentu, predtým ako boli fixované a označené na 40,6-diamidino{ {6}}fenylindol (DAPI) (modrý). Pulzná fáza experimentu je zobrazená na hornom paneli pre každú podmienku, s chase nižšie. Pruhy=20 mm. (c) Kvantifikácia bunkového povrchu Alexa 488-BSA (i) a internalizovaného Alexa 488-BSA (ii), hodnotené ako priemerné intenzity fluorescencie FL na bunku. Alpelisib zachraňuje zachránenú väzbu a internalizáciu BSA pozorovanú v Ocrl^Y/-bunky. N=209, 228, 186 a 196 buniek pre OcrlY/þ DMSO, OcrlY/þ alpelisib, OcrlY/ DMSO a Ocrl^Y/-podmienky alpelisibu v (i) a N{0}}, 183, 199 a 233 buniek pre OcrlY/þ DMSO, OcrlY/þ alpelisib, Ocrl^Y/-DMSO a Ocrl^Y/-stavy alpelisibu, respektíve v (ii), v každom prípade spojené z 2 myších obličiek na stav; každý údajový bod predstavuje priemernú intenzitu fluorescencie FL v jednotlivej bunke. Významnosť bola testovaná Kruskal-Wallisovou (KW) analýzou rozptylu (ANOVA) s Dunnovým testom viacnásobného porovnávania: pre (i) BSA bunkového povrchu, celkovo ***P < 0,001,="" viacnásobné="" porovnania:="" ocrly/þ="" dmso="" verzus="">^Y/-DMSO a Ocrl^Y/-DMSO verzus Ocrl^Y/-alpelisib ***P < {{0}}.001;="" ocrly/þ="" dmso="" verzus="" ocrly/þ="" alpelisib="" p="0.60" (nevýznamné="" [ns]);="" pre="" (ii)="" internalizovaný="" bsa,="" celkovo="" ***p="">< 0,001,="" viacnásobné="" porovnania:="" ocrly/þ="" dmso="" versus="">^Y/-DMSO a Ocrl^Y/-DMSO verzus Ocrl^Y/-alpelisib ***P < 0.001;="" ocrly/þ="" dmso="" verzus="" ocrly/þ="" alpelisib="" p="0.66" (ns).="" (d)="" kvantifikácia="" pomeru="" medzi="" intenzitou="" fluorescencie="" alexa="" 488-="" bsa="" na="" povrchu="" bunky="" a="" intenzitou="" fluorescencie="" internalizovanej="" alexa="" 488–bsa="" fl,="" ktorá="" nevykazuje="" žiadne="" významné="" rozdiely="" v="" pomeroch="" medzi="" jednotlivými="" stavmi.="" každý="" bod="" predstavuje="" priemer="" pomeru="" v="" poli="" obsahujúcom="" približne="" 15–20="" buniek="" (n="13," 13,="" 10="" a="" 11="" náhodne="" vybraných="" polí="" pre="" ocrly/þ="" dmso,="" ocrly/þ="" alpelisib,="">^Y/-DMSO a Ocrl^Y/-stavy alpelisibu, v každom prípade zlúčené z 2 myších obličiek na stav). Významnosť testovala KW ANOVA s Dunnovými viacnásobnými porovnávacími testami: celková P=0.46 (ns), viacnásobné porovnania: OcrlY/þ DMSO versus Ocrl^Y/-DMSO a Ocrl^Y/-DMSO verzus Ocrl^Y/-alpelisib P > 0,99 (ns); OcrlY/þ DMSO verzus OcrlY/þ alpelisib P=0.84 (ns). Ak chcete optimalizovať zobrazovanie tohto obrázka, pozrite si online verziu tohto článku na adrese www.kidney-international.org.

Obrázok 6|Alpelisib zlepšuje funkciu proximálneho tubulu (PT) myší OcrlY/L, obnovuje vychytávanie ligandu a expresiu megalínu. (a) Experimentálne usporiadanie. Orálne myši boli liečené počas 6 týždňov dennou perorálnou dávkou buď karboxymetylcelulózy 1 percento (vehikulum) alebo alpelisibu (50 mg/kg telesnej hmotnosti). V posledný deň liečby bol myšiam injikovaný b-laktoglobulín značený Cy5- (N=6 Ocrl^Y/-, alebo 8 Ocrl^Y/-myši na skupinu). (b–d) Zobrazené hodnoty D označujú priemernú zmenu z BL na D42 pre stav ± SEM. (b) Clara bunkový proteín 16 (CC16), (c) močový výdaj albumínu (obe do 15 hodín) a (d) telesná hmotnosť sa merala u myší OcrlY/- liečených buď vehikulom alebo alpelisibom v uvedenom časovom bode. Každá bodka predstavuje 1 myš. Významnosť bola hodnotená 2-tailovým párovým Studentovým t-testom; v (b) CC16 (pokračovanie)

Obrázok 6|(pokračovanie) zmena výstupu vzhľadom na základnú čiaru; þ vozidlo, P=0.9802 (nevýznamné [ns]), þ alpelisib, *P=0.0334; in (c) zmena produkcie albumínu vzhľadom na východiskovú hodnotu; þ vozidlo, P=0.0502 (ns), þ alpelisib, ***P ¼ 0,0006; in (d) zmena telesnej hmotnosti vzhľadom na základnú líniu; þ vozidlo, ***P < 0,0001,="" þ="" alpelisib,="" **p="0,0083." (e)="" reprezentatívne="" konfokálne="" mikrofotografie="" zobrazujúce="" cy5-značený="" b-laktoglobulín="" (purpurový)="" 15="" minút="" po="" injekcii="" do="" chvostovej="" žily="" a="" označený="" ako="" 40,6-diamidino-2-fenylindol="" (dapi)="" (azúrová),="" plus="" kvantifikácia="" zodpovedajúcich="" fluorescenčných="" signálov="" fl="" z="" obličiek="" myší="" ocrl="" (n="412," 500="" a="" 588="" tubulov,="" v="" tomto="" poradí,="" pre="" vehikulum="" ocrly/þþ,="">^Y/-þ vozidlo a Ocrl^Y/-þ alpelisib) pre 3 myši na liečebnú skupinu. Vychytávanie b-laktoglobulínu je zachránené liečbou alpelisibom. Tyče ¼ 20 mm. V kvantifikácii každá bodka predstavuje intenzitu fluorescencie FL normalizovanú podľa plochy tubulov; vynesené dáta ukazujú priemer ± SEM. Významnosť bola hodnotená Kruskal-Wallisovým (KW) testom, po ktorom nasledoval Dunnov viacnásobný porovnávací test; ***P < 0,001,="" viacnásobné="" porovnania;="" ocrly/þþ="" vehikulum="" verzus="">^Y/-þ vozidlo a Ocrl^Y/-þ vozidlo verzus Ocrl^Y/-þ alpelisib, obe ***P < 0.001.="" (f)="" western="" blotting="" a="" denzitometrická="" analýza="" hladín="" megalínu="" v="" celých="" obličkových="" lyzátoch="" z="" orálnych="" myší.="" a-tubulín="" sa="" použil="" ako="" kontrola="" nanášania.="" znížená="" expresia="" megalínu="" v="">^Y/-je zachránený alpelisibom. Pri kvantifikácii denzitometrickej analýzy každá bodka predstavuje 1 myš (N=4 OcrlY/þþ vehikulum a Ocrl^Y/-þ vozidlo a N=3 Okrl^Y/-þ alpelisibové myši); čiary označujú priemer ± SEM. Významnosť bola hodnotená pomocou 2-nepárových Studentových t-testov: OcrlY/þþ vehikulum oproti Ocrl^Y/-þ vozidlo; **P ¼ 0.0057, Ocrl^Y/-þ vozidlo verzus Ocrl^Y/- þ alpelisib, *P=0.0246. (g) Reprezentatívne konfokálne mikrofotografie s vysoko zväčšenými vložkami a kvantifikáciou intenzity megalínu (žltá) v AQP1þ PT (purpurová) z orálnych obličiek boli tiež označené ako DAPI (azúrová), čo ilustruje záchranu hladín megalínu po liečbe alpelisibom. Pruhy=20 mm. V kvantifikácii každá bodka predstavuje intenzitu fluorescencie FL normalizovanú podľa plochy tubulov; vynesené dáta ukazujú priemer ± SEM; N=142, 191 a 266 tubulov pre vozidlo OcrlY/þþ, Ocrl^Y/-þ vozidlo a Ocrl^Y/-þ alpelisib pre 3 myši na liečebnú skupinu. Významnosť bola hodnotená KW analýzou rozptylu, po ktorej nasledoval Dunnov viacnásobný porovnávací test; celkovo ***P < 0.001,="" viacnásobné="" porovnania;="" ocrly/þþ="" vehikulum="" verzus="">^Y/-þ vozidlo a Ocrl^Y/-þ vozidlo verzus Ocrl^Y/-þ alpelisib, obe ***P < 0.001.="" ak="" chcete="" optimalizovať="" zobrazovanie="" tohto="" obrázka,="" pozrite="" si="" online="" verziu="" tohto="" článku="" na="" adrese="">

Ako sa fosfoinozitid 3-inhibítor kinázy alpelisib používa pri Loweovom syndróme/Dentovej chorobe?

2. DISKUSIA

V súčasnosti neexistuje žiadna liečba na zmiernenie defektnej endocytózy spôsobujúcej dysfunkciu PTLoweov syndróm a Dentova choroba2. Naše zistenia ukazujú, že alpelisib zmierňuje aberantný aktínový fenotyp znížením hladín PI(4,5)P2 a PI(3)P, čo spôsobuje podstatné zlepšenie endocytického aparátu a absorpčnej kapacity v bunkových systémoch a humanizovaný myšací model pre Loweov syndróm/Dentova choroba 2. Tieto výsledky podporujú spojenie medzi fosfoinozitidovými lipidmi, polymerizáciou aktínu a prenosom endocytov, s okamžitým významom pre vysoko aktívne epitelové bunky zapojené do kľúčových homeostatických procesov (obrázok 7). Vzhľadom na nedostatok účinných terapií a zjavnú bezpečnosť tejto triedy PI3K(fosfoinozitid 3-kináza)inhibítory, alpelisib je sľubným kandidátom na opätovné použitie liečivaLoweov syndróm a Dentova choroba.

LMW proteinúria je najkonzistentnejším znakom, s ktorým sa stretávame u pacientov sLoweov syndróm a Dentova choroba2 v dôsledku inaktivačných mutácií v OCRL.⁴Tieto LMW proteíny možno ľahko detegovať a kvantifikovať, čím ponúkajú verný biomarker defektnej receptorom sprostredkovanej endocytózy v PT bunkách.1 LMW proteinúria je obzvlášť dôležitá, pretože sa deteguje konzistentnejšie a často skôr ako iné rozpustené látky (napr. glukóza, fosfát, aminokyseliny), ktoré sú súčasťou klasického „renálneho Fanconiho syndrómu“ – aspoň pri vrodených poruchách endolyzozomálnej dráhy.¹Tu ukazujeme, že alpelisib zachraňuje apikálnu endocytickú absorpčnú kapacitu PT buniek in vitro a in vivo v dôsledku obnovených hladín megalínového receptora na plazmatickej membráne. Tento účinok sa odráža vo významnom znížení straty LMW proteínov (CC16 a albumínu) močom v Ocrl^Y/-myši liečené alpelisibom počas 6 týždňov. Tieto účinky alpelisibu boli pozorované u m PTC, ktoré si zachovávajú svoju apikálnu diferenciáciu a sú obzvlášť vhodné na skúmanie receptorom sprostredkovanej endocytózy vo fyziológii a chorobe.⁹ Konkrétne sme získali m PTC z humanizovaného myšacieho modelu exprimujúceho ľudský INPP5B v Ocrl^Y/-; Inpp5b^-/-pozadia, čo nám umožňuje skúmať konkrétne dôsledky straty aktivity OCRL.^11,23

Záchrana endocytózy alpelisibom sa vysvetľuje jeho účinkom na aktínový mechanizmus, ktorý je jasne dokázaný v bunkách OCRL KO HK2 a m PTC. Naše pozorovania tak potvrdzujú a rozširujú predchádzajúce štúdie ukazujúce súvislosť medzi kontrolou rovnováhy fosfoinozitidu a F-aktínom v skorej endozomálnej dráhe u pacientov s OCRL a KO bunkách.^7,10Funkčná strata aktivity OCRL zhoršuje degradáciu PI(4,5)P2, čo zase vedie k zlyhaniu odstránenia vezikúl potiahnutých klatrínom, čo vedie k aberantným endozomálnym organelám v rôznych typoch buniek vrátane PT buniek.^7-10Nedávno sme ukázali, že nadbytok F-aktínu znižuje recykláciu megalínu multiligandového receptora do apikálnej membrány PT buniek, čo spôsobuje defektnú endocytózu a proteinúriu LMW.¹¹

Naše údaje naznačujú, že mechanizmus účinku alpelisibu na endozomálny aktín vychádza z bišpecifického účinku inhibície alpelisibu: po prvé na produkciu PI(3,4,5)P3 a jeho konverziu na PI(3)P a po druhé na produkcia PI(4,5)P2. Zníženie hladín PI(4,5)P2 priamo pôsobí proti nedostatku OCRL a je v súlade s predchádzajúcou prácou zmierňujúcou nadbytok aktínu a zvyšovaním endocytického efluxu znížením hladín fosfatidylinozitol 4-fosfát 5-kinázy , enzým, ktorý generuje PI(4,5)P2.¹⁰Alpelisib má 0,5 mM 50-percentnú inhibičnú koncentráciu na PI(4,5)P2 generujúcu kinázu PI4Kb, ktorá môže byť zodpovedná, alebo by mohla byť výsledkom všeobecnejších účinkov na rovnováhu fosfoinozitídov vyplývajúcich z kombinácie OCRL KO a liečba alpelisibom. Identifikovali sme, že trieda IA ​​PI3K(fosfoinozitid 3-kináza)inhibícia alpelisibom je relevantná pre inhibíciu aktínu, pretože deplécia p110a sprostredkovaná siRNA inhibuje akumuláciu aktínu podobne ako liečba alpelisibom a kopanlisib (o ktorom sa neuvádza, že inhibuje PI4K). V bunkách RPE sme predtým pozorovali, že siRNA z INPP4A, ktorá konvertuje PI(3,4)P2 na PI(3)P, inhibuje zostavenie aktínu v bunkách OCRL KO, čím poskytuje cestu inhibície PI(3,4,5) produkcie P3 k zníženiu endozomálneho PI(3)P. Ukázali sme, že niektoré PI (3) P zostávajú, pravdepodobne súbor produkovaný na skorom endozóme triedou III PI3K, Vps34, pretože sme zistili, že endozomálne obchodovanie je skôr posilnené ako potlačené liečbou alpelisibom. Komplexná koregulácia metabolizmu PI a jej význam pre inaktiváciu OCRL bol tiež zdôraznený v nedávnej štúdii, kde nekatalytické funkcie fosfoinozitid 3- fosfatázy PTEN aktivujú degradáciu PI(4,5)P2 prostredníctvom PLCXD, čím sa zmierňujú bunkové fenotypy a absorpcia ligandy v modeli zebrafish.³¹

Zmiernenie aktínového fenotypu zníženými hladinami PI(4,5)P2 a PI(3)P liečbou alpelisibom súhlasí so synergickým účinkom PI(4,5)P2 a PI(3)P pri nábore SNX9 na aktiváciu aktínový mechanizmus v endozómoch Ocrl,¹⁴čo naznačuje veľmi účinnú zhodu špecificity alpelisibu na manipuláciu molekulárnej regulácie aktivácie aktínu v endozómoch. Na druhej strane, ako už bolo preukázané, znížená zostava endozomálneho aktínu vedie k zlepšeniu endocytózy PT v bunkách s deficitom OCRL.¹⁰Na lepšie pochopenie toho, či je regulácia aktínu prostredníctvom metabolizmu fosfoinozitidu skutočným zdrojom terapeutického účinku, ktorý pozorujeme pri alpelisibe v Ocrl, bude potrebná ďalšia charakterizácia.^Y/-model myši. Pretože trieda I PI3K(fosfoinozitid 3-kináza)regulujú dráhy, ktoré riadia bunkový rast, proliferáciu, prežitie, metabolizmus a autofágiu,³²nemôžeme vylúčiť, že endocytická záchrana je spôsobená priamymi účinkami na PI(3,4,5)P3 a kombinovaným účinkom na iné dráhy modulované PI3K triedy I. Viac práce je tiež potrebné na testovanie, či PI3K(fosfoinozitid 3-kináza)inhibítory môžu tiež zmierniť neurologické a iné klinické prejavy pacientov s mutáciami OCRL.⁴

Nedávne skúsenosti s alpelisibom u pediatrických pacientov so syndrómom PROS/CLOVES naznačujú, že liek má potenciál byť dobre tolerovaný. Alpelisib sa užíva perorálne, selektívne sa zameriava na izoformu PI3K (fosfoinozitid 3-kináza)triedy I a vykazuje malý profil toxicity v porovnaní s inhibítormi pan-PI3K. Keďže alpelisib úplne neblokuje PI3K (fosfoinozitid 3-kináza)aktivity, čím sa zachovávajú funkcie signálnej dráhy, môže byť obzvlášť vhodný na dlhodobé užívanie. Je zaujímavé, že hyperglykémia vznikajúca pri užívaní alpelisibu sa dá zvládnuť zmenami v stravovaní.²²Pretože dysfunkcia PT je prvým prejavom ochorenia obličiek pozorovaným u malých dojčiat s Dentovou chorobou 2 a Loweovým syndrómom, včasná liečba takejto dysfunkcie PT, ktorá vedie k zlepšeniu metabolického profilu a rastu, môže spomaliť progresiu do chronického ochorenia obličiek, a preto môže mať významný vplyv na životnosť a kvalitu života.³³Hoci prejavy ochorenia OCRL mutácie sú obzvlášť široké, nedávne štúdie založené na veľkých kohortách genotypovaných pacientov s Loweovým syndrómom Dentovej choroby 2 nepreukázali významné účinky typu mutácie alebo lokalizácie mutácie na prežívanie obličiek.³⁴Súhrnne naše údaje zdôrazňujú potenciál pre opätovné použitie alpelisibu na liečbu dysfunkcie PT pri Loweovom syndróme / Dentovej chorobe 2, čím poskytujú základ pre rýchle a nákladovo efektívne nasadenie v klinických štúdiách na ľuďoch.

3. METÓDY

3.1 Všetky podrobnosti nájdete v Doplnkových metódach.

Bunky HK2 boli ošetrené kopanlisibom, alpelisibom, GSK2636771 alebo idelalisibom v uvedených koncentráciách počas 16 hodín, pokiaľ nie je uvedené inak. Proteíny sa extrahovali pomocou štandardných metód z buniek alebo tkanív obličiek a uskutočnil sa western blotting s použitím publikovaných alebo komerčne dostupných protilátok. Knockdown siRNA sa uskutočnil pomocou 2 transfekcií 72 a 24 hodín pred analýzou. Použili sme OcrlY/þ podľa veku a pohlavia; Inpp5b^{- /-}; a Ocrl^Y/-; Inpp5b^-/- myšie súrodence s expresiou BAC-INPP5B. Primárne kultúry m PTC boli generované z obličiek odobraných od 8 týždňov starých myší Ocrl a endocytická kapacita orálnych m PTC bola hodnotená meraním absorpcie albumínu. Ošetrenia Alpelisibom boli 10 mM počas 16 hodín, pokiaľ nie je uvedené inak. Absorpcia albumínu v m PTC bola hodnotená pomocou protokolu "pulse-chase" na vyhodnotenie apikálnej väzby a výslednej absorpcie. m PTC boli zafarbené cez noc vhodnou primárnou protilátkou a 45 minút vhodnými sekundárnymi protilátkami konjugovanými s FL fluorofórom a/alebo Alexa-488 faloidínom. Farbenie PI(3)P na m PTC sa uskutočnilo pomocou sondy domény FYVE. Analýza obrazu sa uskutočnila pomocou CellProfifiler, s použitím vlastných potrubí na meranie prekrytia aktínu / EEA1 a počtu bodiek a pomocou ImageJ na meranie intenzity imunofluorescencie a detekovaných hrán na výpočet skóre stresového vlákna. Kvantitatívne údaje boli vyjadrené ako priemer ± štandardná chyba priemeru. Pre in vivo experimenty boli myši vo veku 6 týždňov liečené vehikulom alebo alpelisibom 50 mg/kg telesnej hmotnosti. Moč sa odoberal každých 14 dní a zvieratá sa usmrtili po 42 dňoch liečby, pričom sa odobrala krv a obličky. PT endocytická kapacita orálnych myší sa skúmala meraním príjmu b-laktoglobulínu.

4. ZVEREJNENIE

JLG má finančné prostriedky od AstraZeneca na štipendium vo svojom laboratóriu. SPJ je v poradných orgánoch a má majetkovú účasť v spoločnostiach Mission Therapeutics, Carrick Therapeutics a Adrestia Therapeutics a je vedeckým partnerom spoločnosti Ahren Innovation Capital. Všetci ostatní autori nedeklarovali žiadne konkurenčné záujmy.

5. POĎAKOVANIE

Túto prácu podporil grant Európskej výskumnej rady 281971, štipendium Wellcome Trust Research Career Development Fellowship WT095829AIA, štipendium Wellcome Senior Research Fellowship 219482/Z/19/Z, fond Wellcome Trust Developing Concept Fund 209749/Z/17/Z, Isaac 18 Trust Trust2 Research Grant (j) JLG a Wellcome Investigator Award 206388/Z/17/Z SPJ a uznávame financovanie inštitútu Gurdon od Wellcome Trust (092096) a CRUK (C6946/A14492). Sme vďační Nadácii pre výskum cystinózy (Irvine, CA), Švajčiarskej národnej vedeckej nadácii (projektový grant 310030_189044), prioritnému programu klinického výskumu (KFSP) RADIZ (Iniciatíva pre zriedkavé choroby Zurich) UZH, Švajčiarsko

National Center of Competence in Research (NCCR) Kidney Control of Homeostasis (Kidney.CH) za podporu a NIDDK/NIH a Lowe Syndrome Trust/UK za podporu vývoja orálnych myší. Oceňujeme Roberta L. Nussbauma (Invitae Corporation a UCSF, San Francisco, CA) a Mariu Antoniettu De Matteis (Telethon Institute of Genetic and Medicine, University Federico II Neapol, Neapol, Taliansko) za poskytnutie zakladateľov kolónie Oral myší;

a Eric Olinger (UZH, Zurich) za plodné diskusie. Ďakujeme Nadine Näegele a Daniele Nieri za poskytnutie technickej pomoci počas odberu a analýzy moču; Guillaume Canaud (Hôpital Necker-Enfants Malades, Paríž) za zdieľanie podrobného protokolu na prípravu Alpelisibu na liečbu in vivo; a Renate Kozyraki a Pierrovi Verroustovi za poskytnutie činidiel. Ďakujeme tiež Centru pre mikroskopiu a analýzu obrazu Univerzity v Zürichu (Zurich, Švajčiarsko) a zariadeniu integračnej fyziológie hlodavcov v Zürichu (ZIRP) za poskytnutie vybavenia na získavanie zobrazovania a technickú podporu počas experimentov in vivo.

Ako sa fosfoinozitid 3-inhibítor kinázy alpelisib používa pri Loweovom syndróme/Dentovej chorobe?

6. DOPLNKOVÝ MATERIÁL

Doplnkový súbor (PDF)

Doplnkové metódy a odkazy.

Tabuľka S1. Telesná hmotnosť, parametre moču a krvi v priebehu času u perorálnych myší liečených alpelisibom alebo vehikulom.

Obrázok S1. Expresia izoformy p110 a testy cytotoxicity odozvy na dávku v HK2 bunkách.

Obrázok 2. PI3Kinhibítor alpelisibobnovuje aktín-endozomálne prekrytie a znižuje hladiny PI(3)P spôsobom závislým od dávky 4 hodiny po liečbe liekom v bunkách HK2.

Obrázok S3. Expresia izoformy p110 a toxicita alpelisibu v Ocrl mPTC.

Obrázok S4. Pracovný postup analýzy prekrývania EEA1/aktín v Ocrl mPTC.

Obrázok S5. Alpelisib obnovuje vychytávanie albumínu v Ocrl^Y/-mPTC. Expresia Aqp1 nie je ovplyvnená. Doplnkový súbor (filmy)

Film S1. Imaris 3D vykresľovanie prekrytia EEA1/aktín v OcrlY/þ mPTC ošetrených DMSO. Reprezentatívne 3D povrchové vykreslenie konfokálnej vrstvy OcrlY/þ mPTC ošetrených DMSO počas 16 hodín, potom fixované 4-percentným formaldehydovým fixom a imunoznačené pre EEA1 (fialové), aktín (faloidín; žltá) a DAPI (modrá), čo ilustruje málo aktín/endozomálna asociácia. Pruh=5 mm.

Film S2. Imaris 3D vykresľovanie prekrytia EEA1/aktín v Ocrl^Y/-mPTC ošetrené DMSO. Reprezentatívne 3D povrchové vykreslenie konfokálnej vrstvy OcrlY/– mPTC ošetrených DMSO počas 16 hodín, potom fixované 4-percentným formaldehydovým fixom a imunoznačené pre EEA1 (fialové), aktín (faloidín; žltá) a DAPI (modrá), ilustrujúce bodkované aktín asociujúci blízko endozomálnych štruktúr. Bar=5 mm.

Film S3. Imaris 3D vykresľovanie prekrytia EEA1/aktín v Ocrl^Y/- mPTC liečených alpelisibom. Reprezentatívne 3D vykresľovanie povrchu konfokálnej vrstvy OcrlY/– mPTC ošetrených 10 mM alpelisibu počas 16 hodín, potom fixované 4-percentným formaldehydovým fixom a imunoznačené pre EEA1 (fialové), aktín (faloidín; žltý) a DAPI (modrý) , ilustrujúce záchranu aktínových bodkovaných štruktúr okolo endozómov. Pruh=5 mm.

LITERATÚRA

1. van der Wijst J, Belge H, Bindels RJM, Devuyst O. Fyziológia učenia sa z dedičných porúch obličiek. Physiol Rev. 2019;99:1575–1653.

2. Loi M. Lowe syndróm. Orphanet J Rare Dis. 2006;1:16.

3. Lewis RA, Nussbaum RL, Brewer ED. Loweho syndróm. In: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, et al., eds. GeneReviews® [internet]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993-2020. Dostupné na: HTTPS:// www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1480/. Publikované 24. júla 2001; Aktualizované 18. apríla 2019. Prístupné 8. augusta 2019.

4. De Matteis MA, Staiano L, Emma F, Devuyst O. 5-fosfatáza OCRL vLoweov syndróm a Dentova choroba2. Nat Rev Nephrol. 2017;13: 455–470.

5. Devuyst O, Luciani A. Transportéry chloridov a receptorom sprostredkovaná endocytóza v proximálnom tubule obličiek. J Physiol. 2015;593:4151–4164.

6. Zhang X, Jefferson AB, Auethavekiat V, Majerus PW. Proteín s deficitom Loweovho syndrómu je fosfatidylinozitol-4,5-bisfosfát 5- fosfatáza. Proc Natl Acad Sci USA 1995;92:4853–4856.

7. Nández R, Balkin DM, Messa M, et al. Štúdie buniek Loweovho syndrómu odhalili úlohu OCRL v dynamike jamiek potiahnutých klatrínom a odizolovaní. eLife. 2014;3:e02975.

8. Mehta ZB, Pietka G, Lowe M. Bunkové a fyziologické funkcie proteínu Loweovho syndrómu OCRL1. Doprava. 2014;15:471–487.

9. De Leo MG, Staiano L, Vicinanza M, a kol. Fúzia autofagozóm-lyzozóm spúšťa lyzozomálnu odpoveď sprostredkovanú TLR9 a kontrolovanú OCRL. Nat Cell Biol. 2016;18:839–850.

10. Vicinanza M, Di Campli A, Polishchuk E, a kol. OCRL riadi prenos cez skoré endozómy prostredníctvom PtdIns4,5P(2) závislej regulácie endozomálneho aktínu. EMBO J. 2011;30:4970–4985.

11. Festa BP, Borquez M., Gassama A. a kol. Nedostatok OCRL zhoršuje endolyzozomálnu funkciu v humanizovanom myšom modeliLoweov syndróm a Dentova choroba. Hum Mol Genet. 2019;28:1931–1946.

12. Welch HC, Coldwell WJ, Ellson CD, a kol. P-Rex1, PtdIns(3,4,5)P3- a Gbetagamma-regulovaný guanín-nukleotidový výmenný faktor pre Rac. Bunka. 2002;108:809-821.

13. Cval JL, Walrant A, Cantley LC, Kirschner MW. Fosfoinozitidy a zakrivenie membrány menia spôsob polymerizácie aktínu prostredníctvom selektívneho získavania Toca{1}} a Snx9. Proc Natl Acad Sci US A. 2013;110:7193–7198.

14. Daste F, Warrant A, Holst MR, et al. Kontrola polymerizácie aktínu prostredníctvom koincidencie fosfoinozitídov a vysokého zakrivenia membrány. J Cell Biol. 2017;216:3745–3765.

15. Malek M, Kielkowska A, Chessa T, a kol. PTEN reguluje signalizáciu PI(3,4)P2 po prúde od triedy I PI3K(fosfoinozitid 3-kináza). Mol Cell. 2017;68:566–580.e510.

16. Gillooly DJ, Morrow IC, Lindsay M a kol. Lokalizácia fosfatidylinozitol 3-fosfátu v bunkách kvasiniek a cicavcov. EMBO J. 2000;19:4577–4588.

17. Fruman DA, Chiu H, Hopkins BD, a kol. PI3K(fosfoinozitid 3-kináza)cesta v ľudskom ochorení. Bunka. 2017;170:605–635.

18. Liu N, Rowley BR, Bull CO, a kol. BAY 80-6946 je vysoko selektívny intravenózny PI3K(fosfoinozitid 3-kináza)inhibítor so silnými aktivitami p110alfa a p110delta v nádorových bunkových líniách a xenoimplantátových modeloch. Mol Cancer Ther. 2013;12:2319–2330.

19. Fritsch C, Huang A, Chatenay-Rivauday C, a kol. Charakterizácia nového a špecifického PI3K(fosfoinozitid 3-kináza)alfa inhibítor NVP-BYL719 a vývoj stratégie stratifikácie pacientov pre klinické štúdie. Mol Cancer Ther. 2014;13:1117–1129.

20. Furet P, Guagnano V, Fairhurst RA a kol. Objav NVP-BYL719, silného a selektívneho inhibítora fosfatidylinozitol-3 kinázy alfa vybraného na klinické hodnotenie. Bioorg Med Chem Lett. 2013;23:3741–3748.

21. Andre F, Ciruelos E, Rubovszky G, et al. Alpelisib pre PIK3CA-mutovaný, hormonálny receptor-pozitívny pokročilý karcinóm prsníka. N Engl J Med. 2019;380:1929–1940.

22. Venot Q, Blanc T, Rabia SH a kol. Cielená liečba u pacientov so syndrómom prerastania súvisiacim s PIK3CA. Príroda. 2018;558:540–546.

23. Bothwell SP, Chan E, Bernardini IM, a kol. Myší model pre Loweov syndróm/Dentovu chorobu 2 renálnu tubulopatiu. J Am Soc Nephrol. 2011;22: 443–448.

24. Chen R, Kang VH, Chen J, a kol. Monoklonálna protilátka na vizualizáciu PtdIns(3,4,5)P(3) v bunkách. J Histochem Cytochem. 2002;50:697–708.

25. Hammond GR, Schiavo G, Irvine RF. Imunocytochemické techniky odhaľujú viacnásobné odlišné bunkové zásoby PtdIns4P a PtdIns(4,5)P(2). Biochem J. 2009;422:23–35.

26. He K, Marsland R III, Upadhyayula S, a kol. Dynamika konverzie fosfoinozitidu v endocytickom prenose sprostredkovanom klatrínom. Príroda. 2017;552:410–414.

27. Bilanges B, Chudák Y, Vanhaesebroeck B. PI3K(fosfoinozitid 3-kináza)izoformy v bunkovej signalizácii a prenose vezikúl. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019;20:515–534.

28. Montjean R, Aoidi R, Desbois P a kol. OCRL-mutované fibroblasty od pacientov s Dent-2 chorobou vykazujú fenotypovú variabilitu nezávislú od INPP5B relatívne k bunkám Loweovho syndrómu. Hum Mol Genet. 2015;24: 994–1006.

29. Suchý SF, Nussbaum RL. Nedostatok PIP2 5-fosfatázy pri Loweovom syndróme ovplyvňuje polymerizáciu aktínu. Am J Hum Genet. 2002;71:1420–1427.

30. Mizrachi A, Shamay Y, Shah J, et al. Nádorovo špecifický PI3K(fosfoinozitid 3-kináza)inhibícia prostredníctvom dodávania cieleného na nanočastice v spinocelulárnom karcinóme hlavy a krku. Nat Commun. 2017;8:14292.

31. Mondin VE, Ben El Kadhi K, Cauvin C, a kol. PTEN redukuje endozomálne PtdIns(4,5)P2 spôsobom nezávislým od fosfatázy prostredníctvom PLC dráhy. J Cell Biol. 2019;218:2198–2214.

32. Jean S, Kiger AA. Koordinácia medzi reguláciou a funkciami RAB GTPázy a fosfoinozitidu. Nat Rev Mol Cell Biol. 2012;13: 463–470. 33. Devuyst O, Knoers NV, Remuzzi G, a kol. Zriedkavé dedičné ochorenia obličiek: výzvy, príležitosti a perspektívy. Lancet. 2014;383: 1844–1859. 34. Zanies M, Bokenkamp A, Kolb M, et al. Dlhodobý renálny výsledok u detí s mutáciami OCRL: retrospektívna analýza veľkej medzinárodnej kohorty. Transplantácia nefrolového číselníka. 2018;33:85–94.

Z: Kidney International (2020) 98, 883–896; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2020.05.040

Copyright ª 2020, International Society of Nefrology. Vydal Elsevier Inc. Toto je článok s otvoreným prístupom pod licenciou CC BY (HTTP:// creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

Inštitút, University of Cambridge, Tennis Court Road, Cambridge CB2 1QN, Spojené kráľovstvo. E-mail: j.gallop@gurdon.cam.ac.uk; alebo Olivier Devuyst, Inštitút fyziológie, Univerzita v Zürichu, Zurich, Švajčiarsko. E-mail: olivier.devuyst@uzh.ch⁵ Títo autori prispeli k tejto práci rovnakou mierou.⁶Títo autori spoluriadili štúdiu. Prijaté 8. augusta 2019; revidované 1. mája 2020; prijaté 15. mája 2020; zverejnené online 9. septembra 2020