Poly- And Oligosacharid Ulva Sp. Frakcie z extrakcie za pomoci enzýmov modulujú metabolizmus extracelulárnej matrice

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPre viac informácií

Abstrakt:Ulva sp. je známe, že je zdrojom bioaktívnych zlúčenín, ako sú napríklad dodávkové automobily, ale ich biologická aktivita na extracelulárnu matricu ľudských dermálnych fibroblastov (ECM) je málo uvádzaná. V tejto práci bola po prvýkrát skúmaná regulácia ECM na proteomických aj transkriptomických úrovniach v normálnych dermálnych fibroblastoch ľudskej kože, po 48 hodinách inkubácie s poly- a oligosacharidovými frakciami z Ulva sp. získané po extrakcii a depolymerizácii s pomocou enzýmov. Zvýšenie bunkovej proliferácie (až do plus 68 percent) bez prejavenia akéhokoľvek cytotoxického účinku na fibroblasty bolo preukázané pri 50 a 1000 ug/ml pri oboch frakciách. Na proteomickej úrovni polysacharidové frakcie v koncentrácii 1000 ug/ml najviac zvýšili syntézu glykozaminoglykánov (GAG, až o 57 percent), celkového kolagénu, najmä typov I (až o 217 percent) a Ⅲ, ako aj syntézu a aktivita MMP-1 (Matrixová metaloproteináza{10}} až do plusu 309 percent). Naproti tomu oligosacharidové frakcie nemali žiadny vplyv na syntézu GAG, ale vykazovali podobnosti s reguláciou kolagénov a MMP{12}}.puritans vitamín CNa transkriptomickej úrovni zníženie expresie COL1A1 a COL1A2 a zvýšenie expresie COL3A1 a MMP-1 potvrdilo moduláciu metabolizmu ECM oboma frakciami. Náš výskum zdôrazňuje, že poly- a oligosacharid Ulva sp. Frakcie vykazujú zaujímavé biologické aktivity a podporujú ich potenciálne využitie v oblasti obnovy pokožky pre anti-aging dermo-kozmetické aplikácie.

kliknite sem a dozviete sa viac

Kľúčové slová:kolagén; extracelulárnej matrix; ľudský dermálny fibroblast; matricová metaloproteináza; morské riasy; Ulva sp.

1. Úvod

Veľkoplošné zelené prílivy spôsobené Uloa sp. sa v Bretónsku (Francúzsko) opakujú v dôsledku eutrofizácie morí. Vlákna zelených morských rias majú vážne nepriaznivé ekologické dopady vrátane zmeny štruktúry ekosystému, zníženia pôvodnej biodiverzity a ekonomických strát [1,2]. Okrem využitia na úpravu pôdy, krmivo pre zvieratá alebo jednoduchú degradáciu rozkladom alebo spaľovaním z uviaznutia je o zhodnotení Uloa sp. v ľudskom zdraví [1]. Avšak Ulloa sp. je dôležitým zdrojom zlúčenín, ako sú ulvany. Evans, vo vode rozpustné sulfátované polysacharidy bunkovej steny, zložené hlavne z ramnózy, urónových kyselín a xylózy, môžu predstavovať až 36 percent suchej hmotnosti Ulloa [3]. Dve hlavné opakujúce sa disacharidové jednotky ulvanu sú kyseliny aldobiurónové (kyseliny ulvanobiurónové), typ A: kyselina -D-glukurónová (1,4)-naviazaná na -L-ramnóza 3-sulfát, a typ B: -L- kyselina idurónová (1,4) viazaná na -L-ramnóza 3-sulfát. Menšie disacharidy aldózy, označované ako ulvanobiózy (typ U), možno nájsť aj v ulvane[3.4]. Extrakcia ulvanov z hľadiska kvantitatívneho výťažku a kvality sa môže výrazne líšiť v závislosti od metód extrakcie a frakcionácie použitých na biomasu. Ulvany sa bežne extrahujú vo vodnom roztoku pri vysokých teplotách (80-90 stupeň), ktoré sa označujú ako proces macerácie. Evans je však možné získať novou zelenou technológiou s názvom Enzyme-Assisted Extraction (EAE)[5]. EAE umožňuje extrakciu požadovaných zlúčenín bez použitia denaturačných podmienok, ako sú rozpúšťadlá alebo vysoké extrakčné teploty, a vykazuje rôzne výhody, ako napr. vysoká katalytická účinnosť, vysoká špecifickosť, mierne reakčné podmienky a zachovanie biologických aktivít zlúčenín. EAE tiež zlepšuje výnos a znižuje náklady a spotrebu energie v porovnaní s klasickým procesom macerácie [6-9]. Po vodnej extrakcii z macerácie alebo po novom procese, akým je EAE, sa ulvanové obohatenie často uskutočňuje etanolovým zrážacím postupom [3]. Ulvans preukázali in vitro a in vivo niekoľko biologických aktivít, ako sú imunomodulačné, antioxidačné, protirakovinové, antikoagulačné, antihyperlipidemické alebo antivírusové [3,5,10-14].sistancheŠtrukturálna vlastnosť Evansa (stupeň sulfatácie, vzor sulfatácie, zloženie monosacharidov, glykozidické väzby, stupeň vetvenia, ako aj molekulová hmotnosť) ovplyvňuje jeho biologickú aktivitu [3].

Starnutie pokožky je komplexný proces s dvoma komplementárnymi procesmi: vnútorným (genetický, bunkový metabolizmus atď.) a vonkajším (vystavenie UV žiareniu, znečistenie, fajčenie tabaku atď.)[15-17]

Cistanche môže proti starnutiu

Novo sa objavilo využitie bioaktívnych látok z morských rias ako zdrojov produktov s vysokou pridanou hodnotou pre dermokozmetický priemysel. Medzi týmito bioaktívnymi zlúčeninami majú vysoký potenciál ulvany. Požiadavky spotrebiteľov na prírodné produkty sa v posledných rokoch skutočne zvyšujú, vďaka čomu sú morské produkty a najmä morské riasy zaujímavým zdrojom prírodných zložiek zameraných na krásu a zdravie pokožky [18-22]. Koža, ktorá je cieľom kozmetických produktov, pozostáva z troch hlavných odlišných prekrývajúcich sa vrstiev: epidermis, dermis a hypodermis.čo je cistancheDermis podporuje epidermis a ukrýva dôležité kožné bunky známe ako fibroblasty. Fibroblasty, hlavné bunky papilárnej dermis nachádzajúce sa priamo pod epidermou, v podstate syntetizujú a organizujú extracelulárnu matricu (ECM). ECM sa skladá z rôznych makromolekúl vrátane kolagénov (70 percent suchej hmotnosti), najmä typu I a III, elastínu (2-4 percent), glykoproteínov (fibronektín, laminín atď.), glykozaminoglykánov (GAG) buď sulfátovaných (heparan sulfát, dermatansulfát, keratánsulfát, chondroitínsulfát) a nesulfátované (kyselina hyalurónová), proteoglykány a degradačné zložky, ako sú MMP (Matrix metaloproteinázy)[23,24]. Kolagén typu I predstavuje až 80 percent celkového kolagénu [25] a je jednou z hlavných zložiek kožnej dermis ECM; podieľa sa na elasticite, pružnosti a napätí pokožky. Kolagén typu I je heterotrimér, proteín trojitej špirály, zložený z dvoch reťazcov cl a jedného reťazca c2 kódovaných génmi COL1Al a COL1A2 [26]. Fibrilárne kolagény typu I a II predstavujú viac ako 90 percent celkového kolagénu a sú úzko spojené s pokožkou [27,28]. Kolagén typu II je bežnejší v mladej koži ako v staršej pokožke a podieľa sa najmä na hojení rán [29,30]. Aby sa vytvorila molekulárna sieť na zostavenie ECM, GAG sú spojené s proteínmi a tvoria proteoglykány (napr. dekorín alebo versican), ktoré interagujú s kolagénom typu I [31]V rámci ECM sú MMP, ktoré sú enzýmami katabolickej dráhy ECM, sú v latentnej alebo aktívnej forme spojené s ich tkanivovým inhibítorom metaloproteináz známym ako TIMP, ktoré regulujú ich aktivitu [32]. MMP-1(kolagenáza-1) je hlavný enzým zodpovedný za degradáciu kolagénu typu I a TIMP-1 je jeho príslušný inhibítor [334]. Fibroblasty sú kľúčovými regulátormi homeostázy ECM. Rovnováha a spojenie syntézy medzi zložkami ECM kože podieľajúcimi sa na anabolizme, ako sú kolagény typu I a II, GAG alebo TIMP, a na katabolizme, ako sú MMP, umožňujú obnovu a pokračujúcu remodeláciu tohto ECM[25]. Pri starnutí pokožky , hlavným dôsledkom je nerovnováha regulácie ECM so znížením proliferácie fibroblastov, modulácia hladín zložiek ECM s dôležitým poklesom syntézy kolagénu typu I, sekrécie GAG ​​a syntézy TIMP-1 a zvýšenie úroveň MMP-1 [24,35].

Zatiaľ len niekoľko štúdií skúmalo účinok Ulva sp. frakcií na metabolizmus fibroblastových kožných buniek na proteomickej aj transkriptomickej úrovni[36-39] a doteraz sa neuskutočnila žiadna úplná štúdia na proteomickej a transkriptomickej úrovni na poly- a oligosacharidových frakciách Ulua odvodených z procesu EAE.Čistota proti starnutiuZ tohto hľadiska táto štúdia skúma in vitro účinky poly- a oligosacharidových frakcií z Ulva sp. odvodené z novej zelenej technológie EAE o metabolizme ľudských dermálnych fibroblastov. Študovali sa ich účinky na proliferáciu a životaschopnosť fibroblastov a na anabolizmus a katabolizmus ECM na proteomickej a transkriptomickej úrovni, aby sa zdôraznil ich potenciál v starostlivosti o pleť (napr. proti starnutiu).

2. Výsledky

2.1. Poly- a oligosacharidové frakcie Ulva sp.

z EAE vykazujú odlišné biochemické zloženie a distribúciu molekulovej hmotnosti

Mechanizmy produkcie poly- a oligosacharidových frakcií sú podrobne uvedené v časti Materiál a metódy: "4.2 Výroba a charakterizácia poly- a oligosacharidových frakcií". Predchádzajúce podrobné biochemické analýzy (sacharidy, urónové kyseliny, sulfátové skupiny a proteíny) a molekulárne hmotnostné rozloženie poly- a oligosacharidových frakcií z Ulloa sp. odvodené z EAE boli vykonané [36]. Údaje sú skombinované v tabuľke 1.

Stručne povedané, polysacharidové frakcie surových ulvanov (UE) a dialyzovaných ulvanov (DS-UE) pozostávajú z vysokomolekulárnych ulvanov (surových van) s 23.5-37,4 percentami sacharidov,18.5-37. 0 percent urónových kyselín, 29.9-49,1 percent sulfátových skupín a 10.5-12,8 percent bielkovín. Zloženie sacharidov bolo hlavne ramnóza (50 percent) a kyselina glukurónová (11 percent). Frakcia DS-UE je výrazne bohatšia na ulvanov ako frakcia UE. Oligosacharidové frakcie, depolymerizované dodávky z HzO2 (DEP-HD PP-UE) a depolymerizované dodávky z Amberlitovej živice (DEP-AD PP-UE), sú zložené z nízkomolekulárnych dodávok s 24.4-30,4 percentami sacharidov ( ramnóza 44.9-55,4 percent a kyselina glukurónová 7.5-11,0 percent ), 21.6-30,8 percent urónových kyselín a 12.8-16,8 percent bielkoviny.

Proces depolymerizácie však viedol k čiastočnej strate síranov (nezistených v DEP-ADPP a iba 6,6 percenta v DEP-HD PP-UE). Distribúcia molekulovej hmotnosti (Mw) oligosacharidových frakcií ukázala priemerne nízku Mw 8 kDa pre DEP-HD PP-UE a nižšiu pre DEP-AD PP-U s 1,5 kDa.

2.2. Poly- a oligosacharidové frakcie Ulva sp. Stimulujte metabolickú aktivitu, ale neovplyvňujte životaschopnosť fibroblastov

Metabolická aktivita normálnych ľudských dermálnych fibroblastov (NHDF), 48 hodín vystavených poly- a oligosacharidovým Ulloa frakciám (50 a 100 ug/ml počas 48 hodín), bola hodnotená pomocou WST-1 (obrázok 1). V týchto experimentoch (n=9) ​​frakcie Ullva z EAE zvýšili proliferáciu fibroblastov až o 68 percent v porovnaní s kontrolou.cistanche benefíciosVýznamné zvýšenie metabolickej aktivity (s<0.001)were observed="" for="" both="" ue="" and="" ds-ue="" at="" 50="" and="" 1000="" ug/ml.="" oligosaccharide="" fractions="" exhibited="" a="" higher="" and="" more="" significant="" rise="" of="" metabolic="" activity="" at="" 100="" ug/ml="" (p=""><0.001) than="" at="" 50="" ug/ml(no="" significance="" for="" dep-hd="" pp-ue="" and="" lower="" significance,=""><0.05, for="" dep-ad="">

Aby sa určilo, či tieto účinky nesúviseli so žiadnou bunkovou toxicitou, životaschopnosť buniek ošetrených extraktom Ulou sa hodnotila meraním uvoľňovania LDH (laktátdehydrogenázy) pomocou testu CytoTox96 stupňov po 48 hodinách inkubácie (n{3}}) (obrázok 2). Test cytotoxicity ukázal, že všetky frakcie nevykazovali žiadnu významnú cytotoxicitu v porovnaní s kontrolou.

2.3. Poly- a oligosacharidové frakcie Ulva sp. Stimulujte metabolizmus extracelulárnej matrice vo fibroblastoch

Účinok poly- a oligosacharidových frakcií Ulloa na syntézu sulfátovaných a nesulfátovaných glykozaminoglykánov (GAG) fibroblastami sa hodnotil farbením Alciánovou modrou po 48 hodinách inkubácie (n=4) (obrázok 3). Významné zvýšenia syntézy boli pozorované len pre UE a DS-UE pri 100 ug/ml vzhľadom na obe sulfatované (p<0.01,+39% and="" +51%,respectively)="" and="" non-sulfated="" gags=""><0.05,+44% and="" +57%="">

Je zaujímavé poznamenať, že DS-UE, najbohatšia frakcia ulvanov, najviac zlepšila syntézu GAG. Pri 50 ug/ml UE a DS-UE zvýšili syntézu nesulfátovaných GAG, ale nie významne (plus 14,2 percenta a plus 22,7 percenta). Oligosacharidové frakcie DEP-AD PP-UE pri 1000 ug/ml mierne znížili syntézu nesulfátovaných GAG, ale nie významne (-3 percent), a DEP-HD PP-UE mierne zvýšili, ale nie významne syntézu GAG pri 100 ug/ ml (plus 4,1 percenta pre sulfátovaný a plus 10,9 percenta pre nesulfátovaný).

Celková syntéza kolagénu (obrázok 4) bola hodnotená testom Red Sirius po 48-hodinovom vystavení fibroblastov poly- a oligosacharidovým frakciám Ulloa（n=7 pri 100 ug/ml a n=6 pri 50 ug/ml） .

Všetky frakcie vykazovali zvýšenie syntézy kolagénu závislé od koncentrácie. Okrajový a nevýznamný pokles syntézy kolagénu bol zaznamenaný pre všetky frakcie pri 50 ug/ml v porovnaní s kontrolou. Naproti tomu pri 1000 ug/ml všetky frakcie zvýšili celkovú syntézu kolagénu a významným spôsobom pre UE (plus 22 percent, p<><0.01),and dep-hd=""><>

Vplyv poly- a oligosacharidovej frakcie EAE na syntézu kolagénu typu I (n=6) a syntézu MMP-1(n=4) sa hodnotil pomocou testov ELISA (obrázok 5).

Všetky frakcie zlepšili syntézu kolagénu typu I a syntézu MP-1, ale nie vždy významne. Zvýšenie syntézy kolagénu typu I bolo závislé od koncentrácie. Zistilo sa, že polysacharidové frakcie, UE a DS-UE, pri 1000 ug/ml, významne （p<05）increase type="" i="" collagen="" synthesis="" (+122%,="" and="" +217%="" respectively)="" and="" mmp-1="" synthesis="" (+309%="" and="" +169%="">

Účinky poly- a oligosacharidových frakcií Ulloa pri 100 ug/ml, po 48 hodinách expozície fibroblastom, na syntézu kolagénu typu I(n=5) a typu Ⅲ(n=4) na produkcia MMP-1(n=6) a TIMP-1(n=5) ​​boli hodnotené analýzou Western blot (WB) s normalizačnou metódou s použitím metódy celkového pruhu proteínov ( Obrázok 6).

Na obrázku 6a, e a WB je zvýraznené zvýšenie syntézy zrelého kolagénu typu I (~130 kDa) a zrelého kolagénu typu III (~ 190 kDa) pre všetky frakcie. Kvantifikácia proteínov na obrázku 6c kolagénu typu I a obrázku 6g kolagénu typu III odhalila NS (štatisticky nevýznamné) zvýšenie ich syntézy v prítomnosti poly- aj oligosacharidov Ulloa sp. zlomky. Medzitým nám WB na obrázku 6b, d umožnil kvantifikovať významné （p<05）increase of="" mmp-1="" production="" （≈50kda）for="" polysaccharide="" fractions="" and="" not="" significant="" for="" oligosaccharide="" ulloa="" eae-derived="" fractions="" dep-ad="" pp.="" ue="" and="" dep-hd="" pp-ue.="" wb="" quantification="" of="" timp-1="" production="" （≈20kda）,="" available="" in="" figure="" 6f,h,="" showed="" only="" a="" significant="" increase="" in="" presence="" of="" the="" dep-hd="" pp-ue="" fraction=""><0.05), while="" other="" fractions="" had="" no="" significant="">

Aktivita MMP-1 kolagenázy sa stanovila zymografickým testom v prítomnosti poly- a oligosacharidových frakcií Ulloa pri 100 ug/ml (obrázok 7a), kvantifikovala sa a porovnala s kontrolou (obrázok 7b), po 48 hodinách vystavenia fibroblastom (n =4).

Výsledky ukázali, že poly- aj oligosacharid Ulva sp. frakcie nezvýšili signifikantne aktivitu MMP-1 fibroblastov.

2.4. Poly- a oligosacharidové frakcie Ulva sp. Diferenciálne modulujte ECM génovú expresiu fibroblastov

Účinok frakcií odvodených od poly- a oligosacharidu Ulloa EAE bol študovaný na mRNA v ustálenom stave niekoľkých zložiek extracelulárnej matrice (COL1A1, COL1A2, COL3A1, MMP-1 a TIMP-1)(n =4)(obrázok 8).

Všimli sme si, že všetky frakcie pri 1000 ug/ml sa významne znížili (str<0.01 and=""><05)col1a1 mrna="" steady-state="" levels="" (figure="" 8a).="" in="" contrast,="" we="" noted="" that="" all="" fractions="" increased="" mmp-1="" mrna="" level="" expression="" significantly="" (p="" <="" 0.05)="" for="" ue="" at="" both="" concentrations="" and="" ds-ue="" at="" 50="" ug/ml="" only="" (figure="" 8c).="" timp-1="" mrna="" steady-state="" level="" was="" not="" significantly="" changed,="" but="" dep-hd="" pp-ue="" and="" dep-ad="" pp-ue="" reduced="" it="" not="" significantly="" at="" 50="" ug/ml="" (figure="" 8e).="" the="" col1a2="" mrna="" steady-state="" level="" (figure="" 8b)="" is="" enhanced="" (ns)="" for="" both="" ue="" concentrations="" and="" ds-ue="" at="" 50="" ug/ml.="" however,="" it="" is="" lower="" at="" 1000="" ug/ml="" for="" ds-ue="" (ns),="" dep-hd="" pp-ue,="" and="" dep-ad="" pp-ue="" (only="" significant="" at="" 1000="" ug/ml="" for="" the=""><0.05). polysaccharide="" fractions,="" ue="" and="" ds-ue,="" raised="" col3a1="" mrna="" level="" expression="" significantly=""><0.05) at="" 1000="" ug/ml="" and="" at="" 50="" ug/ml="" for="" ue="" (ns="" for="" ds-ue)(figure="" 8d).="" oligosaccharide="" fractions,="" dep-hd="" pp-ue,="" and="" dep-ad="" pp-ue,="" at="" 1000="" ug/ml="" raised="" not="" significantly="" col3a1="" mrna="" level="" expression="" and="" reduced="" it="" at="" 50="" μg/ml（significant="" only="" for="" dep-ad=""><>

Tabuľka 2 ukazuje kombinované výsledky na úrovni rovnovážneho stavu génovej mRNA po expozícii fibroblastov frakciám pri 1000 ug/ml.

Tabuľka 2 ukazuje, že UE sa výrazne znížilo (s<0.01)col1al and="" increased="" signifi-cantly=""><0.05) mmp-1="" and="" col3a1,="" and="" not="" significantly="" col1a2mrna="" steady-state="" levels.="" for="" ds-ue,="" dep-hd="" pp-ue,="" and="" dep-ad="" pp-ue,="" similar="" mrna="" steady-state="" levels="" with="" a="" decrease="" in="" col1a1=""><0.01), in="" col1a2(only="" significant=""><0.05 for="" dep-ad="" pp-ue),="" increase="" in="" col3a1="" (only="" significant=""><0.05 for="" ds-ue),="" increase="" in="" mmp-1(ns),="" and="" no="" significant="" change="" in="" timp-1="" mrna="" expression="" were="">

Tento článok Mar. Drugs 2021, 19, 156. https://doi.org/10.3390/md19030156 https://www.mdpi.com/journal/marinedrugs