Preparatívna izolácia a čistenie štyroch zlúčenín z Cistanches Deserticola YC Ma pomocou vysokorýchlostnej protiprúdovej chromatografie

1. Úvod

Cistanches deserticolaYC Ma, druhCistanchesktorá patrí kOrobanchaceaerodina, je známa tradičná čínska medicína na liečbu nedostatku obličiek, ženskej neplodnosti, chorobnej leukorey, neurapraxie a senilnej zápchy [1]. Je to parazitická rastlina, ktorá je široko rozšírená na severozápade Číny. Doteraz niekoľko zlúčenín, vrátanefenyletanoidové glykozidy (PhGs), iridoidy a lignany boli izolované z tohto druhu [2]. Uvádza sa, že niektoré z PhG majú antioxidačnú, hepatoprotektívnu a neuroprotektívnu aktivitu [3–6]. Postup izolácie a čistenia PhG je však náročný a časovo náročný. Okrem toho klasické viacnásobné chromatografické metódy využívajú nielen veľké množstvo organických rozpúšťadiel, ale poskytujú aj nižšiu výťažnosť vzorky. Vysokorýchlostná protiprúdová chromatografia (HSCCC), rozdeľovacia chromatografická technika kvapalina-kvapalina bez nosiča, ponúka vynikajúcu regeneráciu vzorky v porovnaní s niektorými konvenčnými metódami a je široko používaná na separáciu a čistenie rôznych prírodných produktov [7–9]. . Hoci niekoľko PhG bolo purifikovaných zCistanchesrodu a ďalších HSCCC [10–14], žiadna práca neuvádza čistenie akteozidu, izoakteozidu, syringalidu A 3'- -L-ramnopyranozid a 2'-acetylakteozid v jednom dvojfázovom systéme.

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA NA ZLEPŠENIE SEXUÁLNEJ FUNKCIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

V tomto článku uvádzame jednoduchý spôsob separácie a purifikácie štyroch PhG z C. deserticola. Nakoniec sa jednostupňovou separáciou získalo 30,9 mg akteozidu, 13,0 mg izoakteozidu, 12,5 mg syringalidu A 3'- -L-ramnopyranozidu a 7,2 mg 2'-acetylakteozidu z 297 mg frakcie s čistotou 99 %, 95 %, 99 % a 98 %. Ich štruktúry boli charakterizované na základe 1H- a 13C-NMR spektrálnych údajov a HR-MS spektier. Štruktúry štyroch PhG identifikovaných v tomto výskume sú znázornené na obrázku 1.

2. Výsledky a diskusia

2.1. HPLC analýza surového extraktu

Frakcia obohatená o zložky n-butanolového extraktu z C. deserticola sa analyzovala pomocou HPLC-UV. Použitá kolóna bola Accurasil C18 (250 mm x 4,6 mm, vnútorný priemer 5 μm) (Thermo-Fisher Scientific Instruments, mesto, štátna skratka, USA), mobilná fáza bola metanol-voda (30:70, obj./obj.). Prietok bol 1 ml/min. Vlnová dĺžka detektora bola nastavená na 254 nm. HPLC chromatogram je znázornený na obrázku 2. Píky 1 až 4 zodpovedajú akteozidu (1), izoakteozidu (2), syringalidu A 3'- -L-ramnopyranozidu (3) a 2'-acetylakteozidu (4). .

2.2. Výber dvojfázového rozpúšťadlového systému

Úspešná separácia pomocou HSCCC do značnej miery závisí od výberu vhodného dvojfázového rozpúšťadlového systému, dvojfázový rozpúšťadlový systém bol vybraný podľa hodnôt rozdeľovacieho koeficientu (K) každej cieľovej zložky a optimálny rozsah K by mal byť od {{ 2}}.5 až 2.

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA NA ZLEPŠENIE IMUNITY PHGS75% ECH 30% ACT 12%

V experimente sú hodnoty K pre cieľové zložky niekoľkých dvojfázových rozpúšťadlových systémov uvedené v tabuľke 1 (hoci o niečo vyššie pre vrchol 4, výsledky sa ukázali ako prijateľné). Medzi nimi zmes etylacetát-n-butanol-etanol-voda (40:6:6:50, v/v/v/v) poskytla vhodné rozdeľovacie koeficienty pre cieľové zlúčeniny. Nakoniec sa systém rozpúšťadiel zložený z etylacetátu-n-butanolu-etanolu-vody (40:6:6:50, v/v/v/v) použil na izoláciu a čistenie štyroch zlúčenín C. deserticola, ako je znázornené na Obrázok 3. Ako je znázornené na obrázku 2, HPLC analýza každej frakcie HSCCC odhalila, že štyri čisté PhG (akteozid, 99 %; izoakteozid, 95 %; syringalid A 3'- -L-ramnopyranozid 99 % a 2'- zo surovej frakcie možno získať acetylakteozid 98 %).

3. Experimentálne

3.1. Prístroje HSCCC

zariadením použitým v tejto štúdii bol vysokorýchlostný protiprúdový chromatografický systém TBE{{0}}B (Shanghai Tauto Biotech Co., Shanghai, Čína) s tromi preparatívnymi viacvrstvovými cievkovými separačnými kolónami zapojenými do série (priemer skúmavky=2,6 mm, celkový objem=300 ml) a 2{{10}} ml slučku na vzorky. Polomer otáčania alebo vzdialenosť medzi osou držiaka a stredovou osou odstredivky (R) bola 5 cm a hodnota sa menila od 0,5 na internom termináli do 0,8 na externom termináli (=r/R, kde r je vzdialenosť od cievky k hriadeľu držiaka). Na reguláciu teploty v experimente sa použil prístroj HX 105 s konštantnou teplotou cirkulácie (Beijing Changliu Lab Instrument Company, Peking, Čína). Systém HSCCC bol vybavený modelovým stredotlakovým čerpadlom s konštantným prietokom TBP{15}}, modelovým UV detektorom TBP{18}} pracujúcim pri 254 nm a modelovou pracovnou stanicou V4.0 (Jinda Bio-chemistry Instrument spoločnosť, Šanghaj, Čína).

Ako zariadenie na vysokoúčinnú kvapalinovú chromatografiu (HPLC) sa použil systém Agilent 1200, ktorý pozostáva z binárneho čerpadla G1312A, autosamplera G1329A, detektora s premenlivou vlnovou dĺžkou (VWD) G1314A, termostatovanej kolóny G1316A, odplyňovača G1379B a pracovného zariadenia Agilent LC. . Na detekciu čistoty sa použil alltech 3300 ELSD. Na štrukturálnu identifikáciu zlúčenín sa použili 500-NMR spektrometre Agilent 6520 Q-TOF a Bruker AVANCE III. 'H a13C-NMR spektrá (pri 500 a 125 MHz, v danom poradí) boli merané pri teplote miestnosti (22 stupňov /295,1 K).

3.2. Činidlá a materiály

Etylacetát, n-butanol a etanol boli analytickej kvality a metanol bol čistoty pre HPLC. Všetky rozpúšťadlá boli zakúpené od Tianjin Concord Technology Company (Tianjin, Čína). Pre všetky roztoky a riedenia bola použitá voda Milli-Q (18,2 MΩ) (Millipore, Bedford, MA, USA). Oddenok C. deserticola bol zozbieraný z provincie Vnútorné Mongolsko, Čínska ľudová republika, v júni 2009. Rastlinu identifikoval prof. Lijuan Zhang a do nášho laboratória bola uložená vzorka kupónu (č. 20091001).

3.3. Príprava surovej vzorky

Dusité stonky C. deserticola (1 kg) sušené na vzduchu v prášku sa refluxovali dvakrát s vodným etanolom (8 1, 60 % obj./obj.) zakaždým 2 hodiny. Extrakt sa odparil za zníženého tlaku a pri teplote 60 °C až do úplného odparenia etanolu. Zvyšok sa suspenduje vo vode a extrahuje sa postupne trikrát chloroformom, etylacetátom a n-butanolom, čím sa po odparení do sucha za zníženého tlaku získa 5,16 g n-butanolového extraktu. n-butánový extrakt sa potom oddelil na silikagélovej kolóne (200 až 300 mesh) s použitím progresívnej gradientovej elúcie (CHCl3-MeOH, 10:1—>1:1), čím sa získalo osem frakcií. Frakcia 6 (297 mg) sa použila na ďalšiu izoláciu a separáciu HSCCC.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA TRADIČNÉ ČÍNSKE LIEKY PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.4. Výber dvojfázových rozpúšťadlových systémov

Dvojfázové rozpúšťadlové systémy boli vybrané podľa rozdeľovacieho koeficientu (K) cieľových zložiek vo frakcii C. deserticola. Hodnoty K sa stanovili LC analýzou nasledovne: Vhodné množstvo surového práškového extraktu (frakcia 6) sa rozpustilo v spodnej fáze systému rozpúšťadiel a analyzovalo sa pomocou HPLC. Plochy píkov boli zaznamenané ako A1. Potom sa k roztoku pridal rovnaký objem hornej fázy a dôkladne sa premiešal, aby sa dosiahla rovnováha rozdelenia. Spodná fáza sa potom znova analyzovala pomocou HPLC. Posledné oblasti píkov boli zaznamenané ako A2. K-hodnoty boli vypočítané podľa nasledujúcej rovnice: K=(A1 − A2)/A2 [15,16].

3.5. Príprava dvojfázového systému rozpúšťadiel a roztoku vzorky

V tejto štúdii sa na separáciu HSCCC použil dvojfázový rozpúšťadlový systém zložený z etylacetátu-n-butanolu-etanolu-vody (40:6:6:50, v/v/v/v). Každé rozpúšťadlo sa pridalo do oddeľovacieho lievika a dôkladne sa ekvilibrovalo pri teplote miestnosti. Horná fáza a spodná fáza boli oddelené a odplynené sonikáciou počas 30 minút krátko pred použitím. Roztok vzorky sa pripravil rozpustením 297 mg frakcie 6 v 15 ml spodnej fázy etylacetát-n-butanol-etanol-voda (40:6:6:50, obj./obj./obj.).

3.6. Postup separácie HSCCC

HSCCC sa uskutočnilo nasledovne. Viacvrstvová špirálová kolóna sa najskôr naplnila hornou organickou stacionárnou fázou. Spodná vodná mobilná fáza sa potom čerpala do hlavy kolóny rýchlosťou prietoku 1,5 ml/min a súčasne sa zariadenie HSCCC spúšťalo pri rýchlosti otáčok 900 ot./min. Potom, čo sa ustanovila hydrodynamická rovnováha, ako je indikované čírou mobilnou fázou eluujúcou na výstupe z chvosta (asi o dve hodiny neskôr), 15 ml roztoku vzorky obsahujúceho 297 mg surového extraktu (frakcia 6) sa vstreklo cez vstrekovací ventil. Výtok z kolóny bol kontinuálne monitorovaný pri 254 nm. Štyri vrcholové frakcie sa zhromaždili podľa chromatogramu a potom sa odparili za zníženého tlaku. Teplota zariadenia bola nastavená na 25 stupňov.

3.7. HPLC analýza a identifikácia vrcholových frakcií HSCCC

Frakcie píku z HSCCC sa analyzovali pomocou HPLC-ELSD. Použitá kolóna bola Accurasil C18 (250 mm x 4,6 mm, vnútorný priemer 5 μm) a mobilná fáza bola metanol-voda (30:70, obj./obj.). Prietok bol 1 ml/min. ELSD pracoval za nasledujúcich podmienok: teplota 45 stupňov, plyn 1,6 l/min. Štrukturálna identifikácia štyroch vrcholových frakcií HSCCC sa uskutočnila pomocou HR-ESI-MS,1H a13C-NMR spektroskopie.

3.8. Štrukturálna identifikácia

Frakcia I: HR-ESI-MS pozorovaná pri m/z 623,2001 (M-H)-, vypočítané pre C29H35015, 623,1981. 'H-NMR (500 MHz, CD3OD) 5 ppm: 1,09 (3H, d, J=6 Hz, CH3 ramnózy), 2,79 (2H, t, J=7,5 Hz, Ar- CH2-), 4,37 (1H, d, J=8 Hz, H-1 glukózy), 5,18 (1H, d, J=1 Hz, H{{34 }} ramnózy), 6,27 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 7,59 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 6,5 až 7,1 (6H, aromatický H). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) 5 ppm: 131,5 (C-1), 117,2 (C-2), 146,2 (C-3), 144,7 (C-4 ), 116,4 (C-5), 121,3 (C-6), 72,4 (C-), 36,6 (C-), 127,7 (Caf-1), 115,3 (Caf{{89 }}), 146,9 (Caf-3), 149,8 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf{101}}), 168,3 (Caf-), 114,8 (Caf-), 148,1 (Caf-), 104,3 (G-1), 76,1 (Glc-2), 81,7 (Glc-3), 70,5 (Glc{122}} ), 76,3 (Glc-5), 62,4 (Glc{128}}), 103,1 (Rha{131}}), 72,3 (Rha{134}}), 72,1 (Rha{137}} ), 73,9 (Rha{140}}), 70,7 (Rha{143}}), 18,5 (Rha{146}}). V porovnaní s údajmi uvedenými v literatúre [17] frakcia I zodpovedala akteozidom.

Frakcia II: HR-ESI-MS pozorovaná pri m/z 623,1987 (M-H)-, vypočítané pre C29H35015, 623,1981. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) 5 ppm: 1,25 (3H, d, J=6,5 Hz, CH3 ramnózy), 2,78 (2H, t, J=7 Hz, Ar-CH2-), 4,33 (1H, d, J=8 Hz, H-1 glukózy), 5,17 (1H, d, J { {33}} Hz, H-1 ramnózy), 6,28 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 7,56 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 6,5–7,0 (6H, aromatické H). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) 5 ppm: 131,5 (C-1), 117,2 (C-2), 146,2 (C-3), 144,7 (C-4 ), 116,5 (C-5), 121,3 (C-6), 72,4 (C-), 36,7 (C-), 127,8 (Caf-1), 115,2 (Caf{{89 }}), 146,8 (Caf-3), 149,7 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf{101}}), 169,2 (Caf-), 115,0 (Caf-), 147,3 (Caf-), 104,5 (G-1), 75,5 (Glc-2), 84,2 (Glc-3), 70,1 (Glc{122}} ), 75,7 (Glc-5), 64,7 (Glc{128}}), 102,8 (Rha{131}}), 72,4 (Rha{134}}), 72,4 (Rha{137}} ), 74,1 (Rha{140}}), 70,5 (Rha{143}}), 17,9 (Rha{146}}). 'H-NMR a 13C-NMR spektrálne údaje boli v súlade s údajmi izoakteozidu, ako sa uvádza v literatúre [18].

Frakcia III: HR-ESI-MS pozorovaná pri m/z 6{{10}8}}7,2032 (M-H)-, vypočítané pre C29H35014, 607,2032. 'H-NMR (500 MHz, CD3OD) 5 ppm: 1,09 (3H, d, J=6 Hz, CH3 ramnózy), 2,84 (2H, t, J=7,5 Hz, Ar- CH2-), 4,37 (1H, d, J=8 Hz, H-1 glukózy), 5,19 (1H, d, J=1,5 Hz, H{ {35}} ramnózy), 6,27 (1H, d, J=16 Hz, Ar-CH=CH-), 7,59 (1H, d, J=16 Hz, Ar- CH=CH-), 6,6 až 7,1 (7H, aromatické H). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) 5 ppm: 130,8 (C-1), 116,2 (C-2), 130,9 (C-3), 156,8 (C-4 ), 130,8 (C-5), 116,2 (C-6), 72,4 (C-), 36,4 (C-), 127,8 (Caf-1), 114,8 (Caf{{88 }}), 149,8 (Caf-3), 146,9 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf{100}}), 168,3 (Caf-), 115,4 (Caf-), 148,0 (Caf-), 104,3 (G-1), 76,3 (Glc-2), 81,7 (Glc-3), 70,4 (Glc{121} ), 76,1 (Glc{124}}), 62,5 (Glc{127}}), 103,0 (Rha{130}}), 72,3 (Rha{133}}), 72,2 (Rha{136}} ), 73,9 (Rha{139}}), 70,7 (Rha{142}}), 18,4 (Rha{145}}). Podľa literatúry [18] frakcia III zodpovedala syringalidu A 3'- -L-ramnopyranozidu.

Frakcia IV: HR-ESI-MS pozorovaná pri m/z 665,21 {{20}} (M-H)-, vypočítané pre C31H37016, 665,2087. 'H-NMR (500 MHz, CD3OD) 5 ppm: 1,09 (3H, d, J=6,5 Hz, CH3 ramnózy), 2,00 (3H, s, OAc), 2,72 (2H, t, J=7,5 Hz, Ar-CH2-), 4,55 (1H, d, J=8 Hz, H-1 glukózy), 4,90 (1H, d, J=1 Hz, H-1 ramnózy), 6,29 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 7,62 (1H, d , J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 6,5–7,0 (6H, aromatické H). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) 5 ppm: 131,9 (C-1), 117,3 (C-2), 146,1 (C-3), 144,7 (C-4 ), 116,4 (C-5), 121,4 (C-6), 72,7 (C-), 36,4 (C-), 127,7 (Caf-1), 115,4 (Caf{{93) }}), 146,9 (Caf-3), 149,9 (Caf-4), 116,6 (Caf{102}}), 123,2 (Caf{105}}), 168,1 (Caf-), 114,7 (Caf-), 148,2 (Caf-), 101,8 (G-1), 75,3 (Glc-2), 80,3 (Glc-3), 70,8 (Glc{126}} ), 76,2 (Glc-5), 62,3 (Glc{132}}), 103,3 (Rha{135}}), 72,0 (Rha{138}}), 71,8 (Rha{141}} ), 73,7 (Rha{144}}), 70,8 (Rha{147}}), 18,5 (Rha{150}}), 171,5 (C=O), 20,9 (OAC). 'H-NMR a 13C-NMR spektrálne údaje boli v súlade s údajmi pre 2'-acetylakteozid [17].

4. Závery

Bola zavedená metóda HSCCC na preparatívnu separáciu a čistenie akteozidu, izoakteozidu, syringalidu A 3'- -L-ramnopyranozidu a 2'-acetylakteozidu z Cistanches deserticola YC Ma. Táto štúdia naznačuje, že HSCCC je veľmi výkonná technika na preparatívnu separáciu a čistenie bioaktívnych zložiek z rastlinných materiálov. Zlúčeniny môžu byť tiež izolované v dostatočne veľkom meradle s vysokou čistotou a potom môžu byť použité ako referenčné látky pre chromatografické štúdie alebo štúdie bioaktivity. Metóda je realizovateľná, ekonomická a účinná technika na rýchlu preparatívnu izoláciu komplikovaných prírodných produktov.

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA NA ZLEPŠENIE SEXUÁLNEJ FUNKCIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%