Ochranné účinky a mechanizmy prokyanidínov na Parkinsonovu chorobu in vivo a in vitro 1. časť

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPre viac informácií

Abstrakt:Tento výskum hodnotil molekulárny mechanizmus prokyanidínov (PC) proti neurotoxínu 1-metyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridínu (MPTP) a jeho metabolitu {{6 }}metyl-4-fenylpyridínium (MPP plus ) indukované modely Parkinsonovej choroby (PD). In vitro boli bunky PC12 inkubované s PC alebo deprenylom počas 24 hodín a potom vystavené 1,5 mM MPP plus počas 24 hodín. In vivo sa larvy zebričiek (kmeň AB) 3 dni po oplodnení (pdf) inkubovali s deprenylom alebo PC v 400 uM MPTP počas 4 dní. V porovnaní so samotným MPP*/MPTP PC významne zlepšili antioxidačné aktivity (napr. glutatiónperoxidáza (GSH-Px), superoxiddismutáza (SOD), kataláza (CAT)) a znížili hladiny reaktívnych foriem kyslíka (ROS) a malondialdehydu (MDA). ). Okrem toho PC významne zvýšili akumuláciu jadrového Nrf2 v bunkách PC12 a zvýšili expresiu NQ01, HO-1, GCLM a GCLC v bunkách PC12 aj zebrafish v porovnaní so samotným MPP*/MPTP. Súčasná štúdia ukazuje, že PC majú neuroprotektívne účinky, aktivujú dráhu nukleárny faktor-erytroidný 2-faktor 2 (Nrf2)/antioxidačný responzívny prvok (ARE) a zmierňujú oxidačné poškodenie v modeloch PD indukovaných MPP plus/MPTP.

Kľúčové slová:prokyanidíny; Parkinsonova choroba; bunky PC12; zebra ryba; Cesta Nrf2/ARE

Ak chcete vedieť viac, kliknite sem

1. Úvod

Parkinsonova choroba (PD) je progresívny neurodegeneratívny syndróm spôsobený absenciou dopaminergných neurónov v substantia nigra. Medzi jeho klinické prejavy patrí motorická retardácia, tremor, stuhnutosť a posturálna nestabilita [1-6]. Účinné metódy na prevenciu alebo zvrátenie neuronálnej degenerácie u pacientov s PD sú stále nejasné. Preto objav a vývoj nových antiparkinsoník zostáva hlavnou prioritou pri hľadaní liečby PD.

Hoci patogenéza PD zostáva nejasná, predchádzajúce štúdie preukázali, že oxidačný stres hrá kľúčovú úlohu pri strate dopaminergných neurónov [7,8]. Dopamín môže podliehať auto- alebo enzýmovo katalyzovanej oxidácii, ktorá vedie k produkcii reaktívnych foriem kyslíka (ROS) a elektrofilných molekúl chinónu [9], pričom oba procesy môžu byť základom zraniteľnosti dopamínergných neurónov voči oxidačnému a elektrofilnému stresu[10-12 ]. Preto možnou metódou prevencie alebo liečby PD môže byť doplnenie liečby antioxidantmi na odstránenie nadmerného ROS. Prírodné bioaktívne zlúčeniny sú skutočne výhodné v tom, že sú pre spotrebiteľov často bezpečné a majú veľmi málo (ak vôbec nejaké) nežiaduce reakcie [13]. Preto antioxidačné zlúčeniny z prírodných zdrojov môžu pomôcť pri liečbe PD.

Cistanche môže zlepšiť imunitu

Prokyanidíny (PC) sú prírodné fenolické zlúčeniny flavonoidov, vrátane oligomérov monomérneho katechínu a epikatechínov [14]. PC sú prírodné živiny a antioxidanty s antioxidačnými účinkami silnejšími ako vitamín C a E [15]. Cesta Nrf2/ARE je významnou antioxidačnou cestou. Nrf2 sa uvoľňuje z Keap1 pomocou ROS alebo prostredníctvom elektrofilnej reakcie. Potom sa zlúčenina naviaže na prvok antioxidačnej odozvy (ARE) v jadre a sprostredkuje expresiu peroxiredoxínu a detoxikačných enzýmov fázy II (HO-1, GCLC, GCLM a NQO-1), ktoré pôsobia ako lapače ROS a chránia bunky pred oxidačným poškodením [16].

Embryonálny mozog zebričky obsahuje niekoľko zhlukov dopamínergných, noradrenergných a adrenergných neurónov na miestach podobných tým, ktoré sa nachádzajú v mozgu dospelých [17-19]. Do 3 dní po oplodnení (pdf) sa dopamínergné neuróny pozorujú vo ventrálnom diencefale, pretektu, locus coeruleus, bulbus olfactorius a sietnici [20]. V porovnaní s modelmi experimentálnych myší sú modely zebričiek spojené s kratšími experimentálnymi obdobiami, nižšími nákladmi a zníženou zložitosťou v génovej manipulácii [21. Potkanie feochromocytómové bunky (PC12 bunky) sú veľmi podobné neurónom v morfológii, štruktúre a funkcii [22]. Sú vysoko konzistentné s primárne kultivovanými nervovými bunkami a majú výhody ľahkej a stabilnej kultivácie [23]. Bunky PC12 sa široko používajú ako modely na štúdium nervových buniek [24-26].

Ukázalo sa, že neurotoxín 1-metyl-4-fenyl-1,2,3,{5}}tetrahydropyridín (MPTP) spôsobuje u ľudí syndróm, ktorý sa podobá Parkinsonovej chorobe. MPTP spôsobuje selektívnu degeneráciu dopaminergných neurónov v substantia nigra a pacienti vykazujú symptómy vrátane tras, nehybnosti a šouravej chôdze [27]. MPTP sa metabolizuje na 1-metyl-4-fenylpyridínium (MPP) v gliali bunky v mozgu. Po uvoľnení z glií je MPP plus transportovaný do dopamínergných neurónov cez dopamínový transportér (DAT)[28] a akumuluje sa v mitochondriách, kde sa predpokladá, že spôsobuje bunkovú smrť narušením respiračných enzýmov a spôsobuje oxidačné poškodenie [29,30]. . Predchádzajúce štúdie zistili, že PC zabraňujú niektorým procesom starnutia samíc potkanov [31] a majú určité ochranné účinky na nervy [32,33]. Či však PC môžu zabrániť alebo zvrátiť neuronálnu degeneráciu pri PD reguláciou dráhy Nrf2 / ARE, zostáva nejasné. V tejto štúdii sa použili bunky PC12 ošetrené MPP [34,35] a zebrafish ošetrené MPTP [36] na posúdenie ochranných účinkov a potenciálneho mechanizmu PC na modeli PD.

2. Výsledky

2.1. Účinky PC na cytotoxicitu buniek PC12 indukovanú MPP plus

Inkubácia buniek PC12 s 1,5 mM MPP plus počas 24 hodín viedla k životaschopnosti buniek 58,88 percent (obrázok la). Predbežné ošetrenie buniek pomocou PC chránilo bunky PC12 pred poškodením vyvolaným MPP plus zvýšením životaschopnosti buniek (obrázok 1b). Medzi skupinou s 4 ug/ml PC a skupinou s 30 μM deprenylu (pozitívna kontrolná skupina) nebol žiadny výrazný rozdiel v miere prežitia buniek (obrázok 1b).

2.2. PCs znížený MPP plus – indukovaný oxidačný stres a zvýšená aktivita antioxidačných enzýmov

Hladiny ROS a malondialdehydu (MDA) naznačujú závažnosť oxidačného poškodenia. Vystavenie buniek PC12 1,5 mM MMP plus počas 24 hodín zvýšilo hladiny ROS a MDA, ktoré boli inhibované PC pri 4 ug/ml (obrázok 2a-c). Na ďalšie vyhodnotenie účinku PC na antioxidačné schopnosti buniek PC12 ošetrených MPP plus sme merali aktivitu glutatiónperoxidázy (GSH-Px), katalázy (CAT) a superoxiddismutázy (SOD) a pozorovali sme, že liečba MPP plus potlačila GSH-Px , CAT a SOD aktivity. Tieto účinky MPP plus však boli zachránené expozíciou PC pri 4 ug/ml (obrázok 2d-f).

2.3. Účinky PC na dráhu Nrf2/ARE v bunkách PC12 indukovaných MPP plus

Expresia jadrového faktora-erytroidného 2-faktora 2 (Nrf2) bola zvýšená a hladina Keap1 bola znížená po liečbe PC (obrázok 3a-c). PC (4 ug/ml) uľahčili jadrovú lokalizáciu Nrf2 v podmienkach lézie MPP (obrázok 3d-f). Okrem toho údaje Western blot ukázali výraznú upreguláciu v expresii hemovej oxygenázy 1 (HO-1), chinónoxidoreduktázy 1 (NQO1), katalytickej podjednotky glutamát-cysteín ligázy (GCLC) a podjednotky modifikátora glutamát-cysteín ligázy (GCLM ) expresia po ošetrení PC (4 ug/ml) v porovnaní so samotnou expozíciou MPPt (obrázok 3g-k).

2.4. Signalizácia Nf2/ARE súvisí s neuroprotektívnymi a antioxidačnými účinkami sprostredkovanými PCS

Knockdown Nrf2 pomocou siRNA účinne zrušil expresiu Nrf2 (obrázok 4a, b). Ošetrenie Nrf2 siRNA skutočne zrušilo ochranné účinky PC proti oxidačnému poškodeniu ošetrenému MPP plus, čo dokazuje znížená životaschopnosť buniek v skupine transfekovanej Nrf2 siRNA (obrázok 4c). Okrem toho boli účinky PC na MDA a SOD zvrátené knockdownom Nrf2 za podmienok poškodenia MPP (obrázok 4d, e.

2.5. Účinky PC na motilitu Zebrafish Laroae pri liečbe MPTP

MPTP znížil celkovú vzdialenosť, ktorú zebrafish preplávala. Liečba PC (4, 8 a 16 ug/ml) zachránila lokomotívne deficity vyvolané MPTP a zvýšila celkovú prejdenú vzdialenosť v porovnaní so skupinou MPTP (obrázok 5a, b). Okrem toho sa zdá, že deprenyl ponúka ochranu pred poškodením vyvolaným MPTP a použil sa ako pozitívna kontrola. Predovšetkým samotné PC (16 ug/ml) a deprenyl (40 μM) neovplyvnili lokomočné správanie normálnych lariev zebričiek.

2.6. Účinky PC na MPTP-indukované poškodenie dopaminergných neurónov u Zebrafish

Embryá zebrafish inkubované s MPTP preukázali štatisticky významný pokles hustoty tyrozínhydroxylázy (TH) (obrázok 6a, b). Napriek tomu liečba 16 ug/ml PC významne zvrátila zníženie hustoty THt buniek (obrázok 6a, b).

Figure 2. PCs reduced MPP+-induced oxidative stress and increased antioxidant enzyme activity. (a) ROSlevels were measured by fluorescent microscopy and imaging analysis;(b)ROS levels were measured by imageJsoftware;(c)MDA levels;(d) GSH-Px activity;(e)CAT activity;(f) SOD activity. F and p values of the one-way analysis of variance are presented above each chart. The results of Tukey's post hoc test are presented for selected comparisons:ns, p>0.05;*,p<><0.01;,p><0.001; the="" error="" bars="" are="">

Figure 3. Effects of PCs on Nrf2/ARE pathway in MPP+-induced PC12 cells. (a)Protein levels of Nrf2 and Keep-1, as determined by Western blotting;(b)Nrf2/GAPDH protein relative expression (ratio to control);(c) Keap1/GAPDH protein relative expression (ratio to control);(d) protein expression levels of nuclear Nrf2 and cytoplasmic Nrf2, as determined by Western blotting; (e) nuclear Nrf2/LaminB protein relative expression (ratio to control); (f) cytoplasmic Nrf2/GAPDH protein relative expression (ratio to control);(g) protein levels of HO-1, NQO1, GCLCand GCLM, as determined by Western blotting;(h)HO-1/GAPDH protein relative expression (ratio to control);(i) NQO1/GAPDH protein relative expression (ratio to control);(j) GCLC/GAPDH protein relative expression (ratio to control);(k) GCLM/GAPDH protein relative expression (ratio to control). F and pvalues of the one-way analysis of variance are presented above each chart. The results of Tukey's post hoc test are presented for selected comparisons: ns,p>0.05;*,p<><0.01;the error="" bars="" are="">

Figure 4. Nrf2/ARE signaling is related to the neuroprotective and antioxidant effects mediated by PCs.(a) Knockout efficiency was detected by determination of Nrf2 protein expression using Western blotting;(b)Nrf2/GAPDH protein relative expression (ratio to control);(c) Cell viability;(d) MDA levels;(e) SODactivity. Find values of the one-way analysis of variance are presented above each chart. The results of Tukey's post hoc test are presented for selected comparisons: ns, p >0.05;*,p<0.05;**,p><0.01;**,p><0.001; the="" error="" bars="" are="">

Obrázok 5. Účinky PC na motilitu lariev zebričiek po ošetrení MPTP. a)Typické vzory stôp plávania lariev zebričiek v každej skupine;b)Priemerná celková vzdialenosť lariev zebričiek v každej skupine. Hodnoty F a p jednosmernej analýzy rozptylu sú uvedené nad grafom. Výsledky Tukeyho post hoc testu sú uvedené pre vybrané porovnania: **,s<0.001; the="" error="" bars="" are="">

Tento článok je extrahovaný Molecules 2021, 26, 5558. https://doi.org/10.3390/molecules26185558 https://www.mdpi.com/journal/molecules