Ochranné účinky Cistanche proti H2O2/UVB-indukovanej degradácii dermálneho fibroblastového kolagénu prostredníctvom Hsa-microRNA-4535-sprostredkovanej signalizácie TGF/Smad Ⅱ

DISKUSIA

V tejto štúdii sme zistili, žeochranná úloha cistancheje sprostredkovaný prostredníctvom zoslabenia hsa-miR- 4535, ktorý sa zameriava na Smad4, čím reguluje signalizáciu Smad2/3/4, ako aj syntézu kolagénu v koži vystavenej H2O2/UVB-indukované poškodenie kože in vitroain vivo. Naše zistenia možno zhrnúť do šiestich hlavných bodov: (1) cistanche zoslabený H2O2- indukovaná starnutie buniek HS68, ale nie apoptóza pri dávke 30 uM; (2) H2O2/indukované UVBintracelulárne a mitochondriel Tvorba ROS a nerovnováha MMP boli následne zvrátenécistanche liečba; (3) cistanche výrazne zlepšila signalizáciu TGF/Smad, ako aj aktiváciu komplexu Samd2/3/4 v H2O2-exponované bunky; (4) zvýšená regulácia hsa-miR-4535 H2O2/UVB bolo potlačené nasledovnecistanche liečba; (5) hsa-miR- 4535 sa podieľa na regulácii signalizácie TGF/Smadzacielenie Smad4 na zhoršenú syntézu kolagénu v H2O2/bunky vystavené UVB; (6)topická aplikácia cistanchenanahá koža na chrbtemyši významne znížili indukciu UVBfotostarnutie pokožky,tvorba vrások, hyperplázia kože, a oslabeniesignálnych dráh TGF/Smad.

Obrázok 10. Účinok cistanche na UVB-indukované C57BL6/J fotopoškodenie kože nahých myší. (A) Schematický postup pokusov na zvieratách. Chrbtová koža štvortýždňových nahých myší C57BL6/J (n=6) ​​bola vystavená UVB žiareniu a liečená cistanche raz za dva dni počas 8 týždňov (B) Fotografia zobrazujúca tvorbu vrások na dorzálnej koži nahých myšiam v dôsledku expozície UVB, po ktorej nasleduje lokálna aplikácia cistanche.

Kliknite sem, aby ste sa dozvedeli o liečbe Cistanche pre redukciu pokožky Photoškody

Obrázok 11. Lokálna aplikácia cistanche zoslabuje UVB indukciuhyperplázia kožea degradácia kolagénu v dorzálnej koži nahých myší C57BL6/J. Kožné tkanivá boli sériovo narezané a zafarbené H&E, Massonovým trichrómom a imunohistochemicky na p-Smad2/3 Smad4 a -gal. Farbenie H&E ukázalo hrúbku epidermy. Dvojité červené šípky označujú epidermálne zhrubnutie. Massonovo trichrómové farbenie ukázalo obsah kolagénových vlákien v dermálnych vrstvách. Kolagénové vlákna sú modré. LD, nízka dávka; HD, vysoká dávka.

cistancheúdajne vykazovali antiapoptotické a antioxidačné vlastnosti v rôznych bunkách, ako sú keratinocyty a kardiomyocyty [13, 39, 40]. Perorálne podávanie cistanche účinne potlačilo poškodenie pečene vyvolané streptozotocínom u diabetických potkanov znížením mitochondriálneho oxidačného poškodenia a zvýšením antioxidačnej signalizácie Nrf2 [13, 41]. Iné štúdie ukázali, že cistanche zlepšila hepatotoxicitu vyvolanú cyklofosfamidom a nefrotoxicitu vyvolanú cisplatinou zmiernením oxidačného stresu a zápalu [42, 43]. Expozícia dermálnych fibroblastov UVB alebo H2O2 vedie k akumulácii ROS v mitochondriách, čo vedie k fragmentácii mitochondrií a starnutiu buniek [44]. Predchádzajúca štúdia ukázala, že fragmentované mitochondrie zhoršujú produkciu kolagénu [45]. Naša štúdia ukázala, že cistanche má schopnosť zachytávať radikály, aby zabránila nerovnováhe potenciálu mitochondriálnej membrány vyvolanej ROS a akumulácii ROS v bunkách indukovaných UVB a H2O2-. (Obrázok 3A–3C). Nedávne štúdie uvádzajú, že dermálne fibroblasty sú zodpovedné za organizáciu prostredia bohatého na ECM,

Obrázok 12. Účinky cistanche na signalizáciu TGF/Smad a expresiu hsa-miR-4535 u myší ožiarených UVB. (A a B) Hladiny mRNA hsa-miR{5}} a Smad4 z dorzálnej kože myší vystavených UVB žiareniu sa detegovali pomocou qRT-PCR. (C) Hladiny proteínov TGF, p-smad2/3 a Smad4 v dorzálnych kožných tkanivách boli detegované westernovým prenosom. -tubulín sa použil ako kontrola zaťaženia. Údaje sú prezentované ako priemer ± SD. Kvantifikácia výsledkov je uvedená; *P < 0.05, **P < 0.01 verzus kontrolná skupina s vehikulom; #P < 0,05, ##P < 0,01 oproti skupine UVB plus vehikulum.

pozostáva prevažne z kolagénu typu I a III [46]. Homeostáza kolagénu typu I a III je v podstate zodpovedná za udržanie štrukturálnej a mechanickej podpory pokožky [47]. Objavujúce sa dôkazy naznačujú, že počas starnutia sa vytvára veľké množstvo ROS, čo vedie k progresívnej strate kolagénových zväzkov v dermálnych vrstvách, čo prispieva k tvorbe vrások v dôsledku narušenej dráhy TGF/Smad a zvýšenej expresie MMP [48, 49].cistanche sprostredkovanéaktivácia signalizácie TGF/Smad produkuje kolagén, ktorý udržuje integritu pokožky. V rakovinových bunkách má však rôzne účinky; pri rakovine pečene,cistanche-liečbainhibovali proliferáciu buniek HepG2 aktiváciou signalizácie TGF/Smad [50]. Na rozdiel od toho, cistanche inhiboval signalizáciu TGF/Smad, ako aj inaktivoval Smad3, čo viedlo k inhibícii rastu buniek rakoviny prostaty a pankreasu [51]. Avšak úloha cistanche pri signalizácii TGF/Smad vkožné dermálne fibroblastyzostal neznámy. Tu sme pozorovali, že cistanche upregulovala expresiu COL1A1 a COL3A1, ktorá bola downregulovaná v bunkách ošetrených H2O2 / UVB prostredníctvom aktivácie signalizácie TGF / Smad (obrázok 4A–4C, 8E, 9A). Navyše, indukcia MMP{11}} pomocou H202/UVB bola zvrátená po liečbe cistanche (obrázok 4A, 9A). Naše zistenia naznačujú, že cistanche chráni dermálne fibroblasty pred poškodením vyvolaným H2O2/UVB aktiváciou signalizácie TGF/Smad a indukciou produkcie kolagénu.

Vývoj kolagénu dermyje komplikovaný fyziologický proces a ukázalo sa, že regulácia sprostredkovaná mikroRNA prispieva k remodelácii a organizácii ECM [23, 52, 53]. Kolagén, elastín a kyselina hyalurónová (HA) sú tri hlavné proteíny, ktoré udržujú integritu pokožky. Hromadné dôkazy naznačujú, že niekoľko mikroRNA sa podieľa na starnutí pokožky prostredníctvom regulácie ECM. miR-181a bol upregulovaný v senescentných ľudských dermálnych fibroblastoch a umožnil kolagénu XVI modulovať komponenty ECM [54]. Je zaujímavé, že vysoká expresia miR-23a-3p by mohla vyvolať starnutie kože priamym potlačením hyalurónansyntázy 2, jedného z transmembránových izoenzýmov HA syntázy, ktoré syntetizujú HA [21]. Nedávno bolo hlásené, že rôzne prírodné zlúčeniny zmierňujú dermálne starnutie kože prostredníctvom regulácie mikroRNA [55–57]. Okrem toho sa cistanche údajne podieľal na regulácii mikroRNA pri cholangiokarcinóme a hepatocelulárnom karcinóme a spôsobil supresiu bunkového rastu a metastáz [58, 59]. Doteraz žiadna štúdia neidentifikovala molekulárny mechanizmus, ako je regulácia mikroRNAcistanche ošetrenébunky dermálnych fibroblastov ľudskej kože. Tu sme analyzovali profily mikroRNA polí, aby sme identifikovali niekoľko mikroRNA, ktoré sa líšili medzi kontrolou a 30 uMcistanche ošetrenéskupiny (obrázok 5A). Pomocou databáz miRDB a TargetScanHuman sme predpovedali Smad4 ako hsa-miR-4535mRNA cieľ (obrázok 5B). Expresia hsa-miR-4535 bola znížená po ošetrení cistanche v bunkách indukovaných H202/UVB (obrázok 6C, 9B). Na rozdiel od toho, expresia jeho cieľa, mRNA-Smad4, bola významne inhibovaná v bunkách vystavených H202/UVB a zvýšená po ošetrení cistanche (obrázok 6D, 9C). Rôzne štúdie ukázali, že ROS pôsobí ako medziprodukt stimulujúci stresom indukované transkripčné faktory, ako sú p53, NF-κB a HIF [60]. Preto sme usúdili, že určité miRNA by mohli byť modulované reguláciou týchto transkripčných faktorov. Použitím databázy väzbových miest transkripčného faktora (PROMO) sme identifikovali, že na promótore hsa-miR-4535 existuje jeden predpokladaný väzbový prvok p53. Naša budúca štúdia sa zameria na transkripčnú reguláciu p53 v promótore hsa-miR-4535. Okrem toho H2O2-indukovaná degradácia kolagénu nemohla byť oslabená v bunkách nadmerne exprimovaných hsa miR-4535 alebo transfekovaných si-Smad4 ani po ošetrení cistanche (obrázok 8C, 8E). Tieto zistenia ďalej potvrdzujú zapojenie hsa-miR- 4535 do regulácie syntézy kolagénu zacielením na Smad4.

Obrázok 13. Schematický diagram mechanizmu účinku cistanche. cistanche zlepšuje dráhy syntézy kolagénu TGF/Smad znížením H2O2-indukovanej has-mikroRNA-4535 na zlepšenie fotostarnutia v dermálnych fibroblastoch ľudskej kože. Skratky: ECM: extracelulárna matrica; TGF: transformujúci rastový faktor beta; TR: receptor TGF typu I; TRII: TGF receptor typu II.

Na záver naše zistenia ukázali, že cistanche chráni pred H2O2/UVB-indukovanou tvorbou ROS, nerovnováhou MMP, starnutím buniek a degradáciou kolagénu v ľudských dermálnych fibroblastoch. Dermo ochranné účinky cistanche boli spojené s inhibíciou hsa-miR-4535 a aktiváciou komplexu Smad2/3/4 na zvýšenie syntézy kolagénu. Aktivácia komplexu Smad2/3/4 bola regulovaná pomocou hsa-miR-4535 prostredníctvom väzby na Smad4-3′-UTR. Preto ochranný mechanizmus cistanche proti kožnému poškodeniu vyvolanému H2O2/UVB môže zahŕňať inhibíciu syntézy Smad4/kolagénu pomocou hsa-miR- 4535

MATERIÁLY A METÓDY

Bunkové kultúry a liečby

Ľudské dermálne fibroblasty HS68 boli získané z Bioresource Collection and Research Center (BCRC, Hsinchu, Taiwan) a uchovávané v Dulbeccovom modifikovanom základnom médiu (DMEM, Thermo Fisher Scientific, MA, USA) obsahujúcom 10 percent fetálneho hovädzieho séra (Invitrogen, CA, USA ), 2 mM L-glutamínu (Sigma-Aldrich, MO, USA), 100 U/ml penicilínu (Sigma-Aldrich) a 100 ug/ml streptomycínu (Sigma Aldrich) pri 37 stupňoch a 5 percentách CO2. Na vyhodnotenie účinku cistanche proti poškodeniu buniek vyvolanému H2O{12}} boli bunky HS68 ošetrené 200 uM H2O2 počas 1 hodiny a potom spoločne ošetrené cistanche (282200, Sigma-Aldrich) počas 23 hodín. Bunky sa premyli PBS a umiestnili sa do 1 ml čerstvého PBS pred vystavením UVB. Na UVB ožarovanie boli bunky vystavené zosieťovadlu (CX-2000, Upland, CA, USA) a UVB žiarovkám s intenzitou 40 mJ/cm2 a potom ošetrené cistanche.

MTT testy

Životaschopnosť buniek HS68 po ošetrení sa merala pomocou testu MTT. Bunky HS68 boli nasadené do 96-jamkových platní a ošetrené 200 μM H2O2 počas 1 hodiny alebo ožiarené 40 mJ/cm2 UVB a potom inkubované s rôznymi koncentráciami cistanche (10, 20, 30 uM) počas 23 hodín. Po 24 hodinách sa kultivačné médium nahradilo 100 μl MTT (3-(4,{17}}dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid) roztok (0,5 mg/ml; 5 mg/ml zásobný roztok v PBS sa zriedil kultivačným médiom na 0,5 mg/ml) počas 4 hodín pri 37 stupňoch. Potom sa fialovo sfarbený formazan solubilizoval v 100 ul dimetylsulfoxidu (DMSO) a pomocou spektrofotometra (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) sa merala optická hustota pri 570 nm.

Prechodná transfekcia

Microarray analýza

Luciferázový reportérový test

Bunky boli kotransfekované luciferázou divokého typu a mutantnou luciferázou Smad4-3′-UTR-WT alebo Smad4-3′-UTR-MT reportérovými konštruktmi, v danom poradí, a internými kontrolnými luciferázovými plazmidmi. Po transfekciách sa luciferázové aktivity detegovali pomocou Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega, Sunnyvale, CA, USA) podľa pokynov výrobcu. Doštičky sa odčítali na luminometri Reporter Microplate Luminometer (Turner Biosystems, Sunnyvale, CA, USA). Relatívne aktivity luciferázy boli normalizované na aktivitu luciferázy Renilla.

Western blot analýza

Bunky sa premyli s použitím 1x fyziologického roztoku pufrovaného fosfátom (PBS) a lyzovali v lyzovacom pufri (50 mM Tris-báza (pH 7,5), {{10}},5 M NaCl, 1 mM EDTA (pH 8,0), 1 mM -merkaptoetanol, 1 percento NP-40, 1 percento glycerol a koktailové tablety inhibítora proteázy (Roche Molecular Biochemicals, Horné Bavorsko, Nemecko) počas 30 minút na ľade a potom odstredené pri 12,000 x g počas 10 minút pri 4 stupňoch. Supernatanty sa odobrali do 1,5 ml mikrocentrifugačných skúmaviek. Koncentrácia proteínu v týchto supernatantoch sa stanovila Bradfordovou metódou (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). obsahujúce rovnaké množstvo proteínu (20 ug) sa separovali pomocou 6- až 12-percentnej gradientovej elektroforézy na dodecylsulfát-polyakrylamidovom géle sodnom (SDS-PAGE) a potom sa preniesli na polyvinylidéndifluoridové (PVDF) membrány (Millipore, Bedford, MA, USA). Membrány sa blokovali pomocou blokovacieho pufra (5 percent odtučneného sušeného mlieka, 20 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl a 0,1 percenta Tween 20) počas 1 hodiny pri teplote miestnosti. Potom sa membrány inkubovali s primárnymi protilátkami (1: 1,000 riedenie) proti TGF 1 (sc-31609, Santa Cruz, CA, USA), p-smad2/3 (sc{48}}, Santa Cruz), Smad4 (sc{{ 50}}, Santa Cruz),COL1A1 (sc-28657, Santa Cruz), COL3A1 (sc-271249,Santa Cruz), p16 (10883-1-AP, Proteintech), p21 (sc{ {60}}, Santa Cruz), MMP-1 (sc-1731, Santa Cruz), GAPDH (sc{63}}, Santa Cruz) a Histone H1 (sc-10806 , Santa Cruz) cez noc pri 4 stupňoch . Potom boli inkubované s vhodnými sekundárnymi protilátkami (1:80, {000 riedenie), antikráličím (A0545), antimyším (A9044) alebo antikozím (A5420) IgG (Santa Cruz Biotechnology) počas 1 hodiny pri teplote miestnosti. Imunobloty sa detegovali pomocou substrátu zosilnenej chemiluminiscencie (ECL) chrenovej peroxidázy (HRP) (Millipore) s použitím ImageQuant LAS4000 mini (GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, UK).

Extrakcia jadrového proteínu

Extrakcia RNA a qRT-PCR

Celková RNA bola extrahovaná pomocou komerčnej súpravy Direct-zol™ RNA MiniPrep (Zymo Research Corporation, CA, USA) podľa protokolu výrobcu [65, 66]. miRNA boli reverzne transkribované na cDNA pomocou súpravy na syntézu miRNA cDNA (Takara, Shiga, Japonsko), ako bolo opísané vyššie [16, 67]. Expresia hsa-miR-4535 a Smad4 bola detegovaná pomocou PCR v reálnom čase v systéme LightCycler 96 Systems (Roche, Basel, Švajčiarsko) s použitím štandardného protokolu LightCycler 480 SYBR Green I Master. 10 μl PCR reakcia zahŕňala 2 μl cDNA, 5 μl 2× SyberGreen PCR Mix, 0,5 μl dopredného primeru (10 μM), 0,5 μl reverzného primeru (10 μM) a 2 μl ddH2O. Všetky reakcie sa uskutočňovali trojmo. Na detekciu mRNA sa pre každý gén určil prahový cyklus (Ct) a expresia každého génu v porovnaní s GAPDH sa vypočítala ako 2ACt, kde ΔCt=(gén Cttarget – CtGAPDH). Na detekciu miRNA sa určilo Ct pre každý gén a expresia každého génu v porovnaní s expresiou U6 rRNA sa vypočítala ako 2ACt, kde ΔCt=(Cthsa-miR-4535 – CtU6 rRNA). Dopredné (F) a reverzné (R) priméry použité na detekciu expresie miRNA a mRNA boli: hsa-miR-4535 (3'-CAGGG TCGGUCCA5'); ľudský-Smad4 (F'-TGACCCAAA CATCACCTTCA, R'-ATACGTGGACCCTTCTG GA); ľudský-GAPDH (F'-ACCCAGAAGACTGTGGA TGG, R'-TTCAGCTCAGGGATGACCTT); myš-Smad4 ('-GTGGAAGCCACAGGAATGTT, R'-CCCA CTGAAGGACATTCGAT); myš-GAPDH (F'-CCTT CCACAATGCCAAAGTT, R'-GGGTGTGAACCA CGAGAAAT).

Imunofluorescenčná analýza