Kvercetín ako nefroprotektor po teplej ischémii: histomorfometrické hodnotenie v modeli hlodavcov

Gabriela F. Kupuje Gonçalvesa¹, Mária Eduarda M. Silva², Francisco JB Sampaio¹, Marco A. Pereira-Sampaio^{1, 3}, Diogo Benchimol de Souza¹

ABSTRAKT

Účel:Kvantitatívne zhodnotiť možné dlhodobé ochranné účinky kvercetínu počas renálnej teplej ischémie.

Materiály a metódy:Samce potkanov boli rozdelené do 4 skupín: falošný (S), falošný kvercetín (SQ), ischémia (I) a ischemický kvercetín (IQ). Skupiny SQ a IQ dostávali kvercetín (50 mg/kg) pred a po operácii. Skupiny I a IQ mali ľavé obličkové cievy upnuté na 60 minút. Všetky zvieratá boli usmrtené štyri týždne po zákroku a merali sa hladiny močoviny a kreatinínu v sére. Hmotnosť a objem obličiek, pomer plochy kôry a mimo kôry (C-NC), objem kôry (CV), objemová hustota glomerulov (Vv[glom]), objemovo vážený objem glomerulov (VWGV) a počet glomerulov naobličky(N[glom]) boli vyhodnotené stereologickými metódami. Výsledky sa považovali za štatisticky významné, keď p<>

Výsledky:Hladiny močoviny v sére v skupine I sa zvýšili o 10,4 percenta v porovnaní so skupinou S, ale medzi ostatnými skupinami neboli pozorované žiadne rozdiely. C-NC skupiny I bola nižšia ako u všetkých ostatných skupín a IQ skupiny malo podobné výsledky ako falošné skupiny. Vv[glom] a N[glom] skupiny I boli nižšie ako hodnoty v skupine S (33,7 percent a 28,3 percent, v uvedenom poradí) a IQ skupiny nemal žiadny významný rozdiel v porovnaní so skupinou S.

Závery:Kvercetín bol účinný ako nefroprotektívne činidlo pri prevencii glomerulárnej straty pozorovanej priobličkybol vystavený teplej ischémii. To naznačuje, že tento flavonoid možno použiť preventívneobličkychirurgia, keď je potrebná teplá ischémia, ako je čiastočná nefrektómia.

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com

cistanche mužské výhody

ÚVOD

Čiastočná nefrektómia sa považuje za zlatý štandard liečby lokalizovaných malých obličkových útvarov (1, 2) a stále častejšie sa vykonáva v dôsledku vývoja diagnostických techník (3). Napriek neustálemu výskumu a vývoju nových chirurgických techník, ktoré zahŕňajú studenú ischémiu a nulovú ischémiu (4, 5), renálna teplá ischémia sa stále väčšinou používa na získanie bezkrvného operačného poľa pri parciálnej nefrektómii (6).

Naproti tomu ischémia obličiek počas operácie šetriacej nefróny je spojená s pooperačnou glomerulárnou stratou a funkčným poklesom zostávajúceho parenchýmu (7, 8), čo môže viesť k zlyhaniu obličiek. Preto lieky, ktoré môžu mať ochranné účinky naobličkyv predoperačnom, perioperačnom a pooperačnom období je opodstatnené (9, 10).

Kvercetín preukázal pozitívne výsledky v rôznych experimentálnych podmienkach, ktoré sa pripisujú najmä jeho antioxidačným a protizápalovým vlastnostiam (11-14). Tento flavonoid sa tiež ukázal ako sľubný, keď je spojený s teplou ischémiou v rôznych orgánoch a tkanivách (15-17) a konkrétnejšie vobličky(18-20). Podľa našich najlepších vedomostí však kvercetín ešte nebol skúmaný na prevenciu glomerulárnej straty po teplej ischémii.

Hypotézou tejto štúdie je, že kvercetín môže zlepšiť poškodenie obličiek spôsobené ischémiou-reperfúziou. Cieľom je kvantitatívne zhodnotiť možné dlhodobé ochranné účinky kvercetínu počas renálnej teplej ischémie na modeli hlodavcov.

MATERIÁLY A METÓDY

Všetky experimenty boli vykonané v súlade s národnými a medzinárodnými zákonmi pre vedecké využitie zvierat a tento projekt bol formálne schválený Inštitucionálnym etickým výborom pre experimentovanie na zvieratách (CEUA 040/2017).

Použilo sa 40 samcov potkanov Wistar vo veku 9 týždňov. Zvieratá boli náhodne rozdelené do 4 skupín: Sham (S) - skupina podrobená laparotómii a disekcii obličkového pediklu (n=10); Sham Quercetin (SQ) - skupina liečená kvercetínom a podrobená rovnakým postupom ako skupina Sham (n=10); Ischémia (I) - skupina podrobená renálnej teplej ischémii (n=10); Ischemia Quercetin (IQ) – skupina liečená kvercetínom a podrobená renálnej teplej ischémii (n=10). Skupiny SQ a IQ dostávali 50 mg/kg kvercetínu (Quercetin, New Roots Herbal, Vaudreuil{11}}Dorion, Kanada) sondou 3 dni pred a 3 dni po operácii a jedno intraperitoneálne podanie 60 minút pred chirurgickým zákrokom bez liečby skupiny (S a I) dostali fyziologický roztok (namiesto kvercetínu) použitím rovnakých protokolov.

Všetky potkany boli anestetizované intramuskulárnym ketamínom (Cetamin, Syntec, Santana de Parnaíba, Brazília, 100 mg/kg) a xylazínom (Xilazin, Syntec, 20 mg/kg). Pri aseptickej technike sa použila ventrálna stredná incízia na odhalenie brušných vnútorností, ktoré sa premiestnili, aby sa odhalila ľavá stranaobličky. Ľavá renálna artéria a žila sa izolovali tupou disekciou. U zvierat skupín I a IQ sa obličkové cievy uzavreli na 60 minút, zatiaľ čo v skupinách S a SQ sa pedikel vyrezal, ale nevyvolala sa žiadna ischémia. Všetky skupiny zostali v anestézii 60 minút, počas ktorých boli brušné vnútornosti vložené do brucha a rez bol prekrytý navlhčenou gázou. Na konci tohto obdobia sa odstránili cievne svorky a pozorovala sa reperfúzia (v skupinách I a IQ) a brušná dutina sa uzavrela štandardným spôsobom.

Ľavýobličkysa zhromaždili a fixovali v 4% fosfátom pufrovanom formaldehyde. Obličky boli odvážené a obličkový objem bol meraný Scherleho metódou (21). Pomer plochy kôry a mimo kôry (C-NC) sa vypočítal pomocou Cavalieriho metódy (22-24). Kortikálny objem (CV) sa vypočítal vynásobením objemu obličiek C-NC (24).

Zvieratá boli usmrtené 4 týždne po operácii predávkovaním anestetikami (Isoflurane, BioChimico, Rio de Janeiro, Brazília). Ihneď po smrti sa odobrala vzorka krvi punkciou srdca. Táto vzorka sa použila na analýzu sérových hladín močoviny a kreatinínu automatizovanou enzymatickou metódou. Ľavýobličkysa zhromaždili a fixovali v 4% fosfátom pufrovanom formaldehyde. Theobličkyboli odvážené a obličkový objem bol meraný Scherleho metódou (21). Pomer plochy kor-texu a bez kortexu (C-NC) sa vypočítal pomocou Cavalieriho metódy (22-24). Kortikálny objem (CV) sa vypočítal vynásobením objemu obličiek C-NC (24).

Náhodne zozbierané vzorky od všetkých vľavoobličkyboli spracované na zaliatie do parafínu, narezané na hrúbku 5 um a zafarbené hematoxylínom a eozínom. Histologická analýza sa uskutočnila naslepo s použitím 25 histologických polí získaných z piatich rôznych rezov obličkovej kôry z každej obličky. Glomerulárna objemová hustota (Vv[glom]), ktorá udáva proporcionálny objem obsadený glomerulami v kortexe, bola odhadnutá metódou počítania bodov (22-24). Objemovo vážený glomerulárny objem (VWGV) sa odhadol pomocou metódy bodového odberu vzoriek (22-24). Odhad celkového počtu glomerulov na obličku (N[glom]) sa vypočítal pomocou vzorca: CVxVv[glom]/VWGV (24).

Výsledky boli porovnané jednosmernou ANOVA s Bonferroniho posthoc testom. Analýzy boli vykonané pomocou GraphPad Prism 5.{2}} (GraphPad Software, San Diego, USA). Všetky výsledky boli považované za významné, keď p<0.05. all="" numerical="" data="" were="" presented="" as="" mean±standard="">

Okrem toho skúsený veterinárny patológ (nevedomý podmienok liečby) vyšetril všetky histologické rezy a opísal histopatologické zmeny. Pozorované zmeny sa potom zaznamenali na skupinu.

cistanche kulturistika

VÝSLEDKY

Hladina močoviny v sére v skupine I bola o 10,4 percent vyššia ako v skupine S. Nebol pozorovaný žiadny rozdiel v hladinách močoviny v sére medzi IQ skupiny a inými skupinami. Tiež nebol pozorovaný žiadny rozdiel v analýze sérového kreatinínu medzi všetkými skupinami.

C-NC skupiny I sa znížilo o 9,3 percenta v porovnaní so skupinou S. Liečba kvercetínom v skupine IQ obnovila normálne hodnoty tohto parametra. C-NC skupiny IQ bola o 5,9 percenta vyššia ako v skupine I a mala podobné hodnoty ako skupiny S a SQ.

Vv[glom] skupiny I bol o 32,7 percent nižší ako u skupiny S a o 34,2 percenta znížený v porovnaní so skupinou SQ. Medzitým sa IQ skupiny zvýšilo o 33,7 percenta v porovnaní so skupinou I a pokleslo o 12.0 percent v porovnaní s SQ. Liečba kvercetínom u zvierat vystavených renálnej ischémii (skupina IQ) zabránila zníženiu Vv[glom] pozorovanému u neliečených zvierat.

Ischemickáobličky(skupina I) vykazovala znížený N[glom] v porovnaní so skupinami S a SQ (26.0 percent a 33.0 percent v uvedenom poradí). Liečba kvercetínom v skupine IQ zabránila tejto strate glomerulov, pretože táto skupina nevykazovala žiadny rozdiel od skupín S a SQ, ale o 28,3 percenta sa zvýšil N[glom] v porovnaní so skupinou I.

Nebol zaznamenaný žiadny rozdielobličkyhmotnosť,obličkyobjem, kortikálny objem a VWGV medzi skupinami. Všetky údaje sú uvedené v tabuľke{0}} a sú znázornené na obrázkoch 1 a 2.

Histopatologická analýza odhalila diskrétne tubulárne a medulárne prekrvenie u niektorých zvierat skupín S a SQ, ale kortikálna architektúra bola zachovaná. Na druhej strane bolo pozorovaných mnoho ohniskov poškodenia parenchýmuobličkyskupiny I. To zahŕňalo amorfný materiál v tubulárnom lúmene, amorfný eozinofilný materiál v medulárnej oblasti, glomerulárnu degeneráciu, mononukleárnu infiltráciu, zjavnú stratu glomerulov a stratu kortikálnej architektúry. Tieto patologické nálezy boli minimálne vobličkypodrobené ischémii pri liečbe kvercetínom (skupina IQ).

DISKUSIA

Napriek veľkému úsiliu vyhnúť sa teplej ischémii počas parciálnej nefrektómie, technikami off-clamp a studenej ischémie (4, 5), teplá ischémia je stále nevyhnutná pri väčšine operácií šetriacich nefróny (1, 2, 6) a jej škodlivé a trvalé následky pre renálnu funkciu a morfológiu zostávajúceho parenchýmu (7, 8) sú spôsobené vysokou produkciou reaktívnych foriem kyslíka a následnou peroxidáciou lipidov (25, 26). Vzhľadom na to je použitie antioxidačných liečiv ako možných protektorov nefrónov pravdepodobné (9-11, 18-20), ako aj v iných orgánoch a tkanivách (12-17) spojených s ischémiou/reperfúziou (9, 10, 15-20, 26).

Kvercetín je flavonoid, ktorý sa ukázal ako účinný v boji proti tvorbe reaktívnych foriem kyslíka a pozitívne upravil hodnoty biochemických markerov homeostatických funkcií orgánov a tkanív (12-17), vrátaneobličkyv rôznych situáciách (11), ako je teplá ischémia (18-20). Naše kvantitatívne výsledky potvrdzujú, že použitie kvercetínu je prospešné pri teplej renálnej ischémii. Predpokladá sa, že ochranné výsledky pozorované u zvierat dostávajúcich kvercetín boli dôsledkom zníženého oxidačného poškodenia obličkového tkaniva. Oxidačný stres však nebol v tejto štúdii priamo hodnotený, ako v iných (27) a budúce štúdie by mali objasniť mechanizmy účinku. Použitie tohto flavonoidu bolo účinné pri prevencii glomerulárnej straty (N[glom]), ktorá sa vyskytla iba u zvierat vystavených renálnej ischémii bez liečby kvercetínom.

Hoci zameraním tejto štúdie bolo histomorfometrické hodnotenie, analyzovali sa aj hladiny močoviny a kreatinínu v sére, ktoré sú najbežnejšie používanými biochemickými markermi funkcie obličiek (28). Močovina v sére sa zvýšila iba v skupine s ischémiou, čo potvrdzuje, že liečba kvercetínom zabránila dysfunkcii obličiek, ako naznačuje tento marker. Je to v súlade s predchádzajúcimi údajmi uvedenými v predchádzajúcich štúdiách (18-20).

Operácia šetriaca nefróny má, ako už názov napovedá, za cieľ odstrániť maléobličkyhmoty pri zachovaní maximálneho počtu nefrónov pre dlhodobé zachovanie funkcie obličiek (1, 2, 6-8). Preto kvantifikácia absolútneho počtu glomerulov, čo je výsledok, ktorý sa približuje počtu nefrónov prítomných v parenchýme (10, 22-24), poskytuje definitívny výsledok, ktorý naznačuje, či čiastočná nefrektómia dosiahne svoj cieľ. Podľa našich najlepších vedomostí je táto štúdia prvou, ktorá uvádza preventívne účinky kvercetínu na glomerulárnu stratu spôsobenú teplou renálnou ischémiou.

Model hlodavcov je široko používaný v štúdiách zameraných na účinky renálnej ischémie/reperfúzie (9, 18-20, 22) a morfometrické zmeny spôsobené týmto postupom už boli preukázané (22). Naše výsledky sú v súlade s predchádzajúcou správou o 60-minútovej teplej renálnej ischémii v tomto modeli (22), so znížením C-NC, Vv[glom] a N[glom] v skupine s ischémiou v porovnaní s falošná skupina.

Falošné zvieratá liečené kvercetínom nevykazovali žiadne klinické, biochemické alebo morfometrické kvantitatívne modifikácie obličiek, čo dokazuje, že kvercetín nemá žiadne vedľajšie účinky naobličky, čo je v súlade s predchádzajúcimi štúdiami (18-20, 26, 29). Ešte dôležitejšie je, že naše výsledky potvrdzujú, že tento flavonoid zabraňuje glomerulárnej strate spôsobenej ischémiou/reperfúziou, pretože hodnoty Vv[glom] a N[glom] v skupine s ischémiou liečenej kvercetínom boli podobné hodnotám v skupine s falošnou liečbou.

Predtým publikované štúdie ukázali ochranné účinky kvercetínu v krátkodobom období, pretože analýza týchto štúdií bola vykonaná jeden deň po renálnej teplej ischémii (18-20). Táto štúdia pridala informácie o tejto téme a analyzovalaobličky4 týždne po ischemickom poranení, čím sa preukázalo, že ochranné účinky kvercetínu sú trvalé.

Napriek tomu je potrebné poznamenať, že táto štúdia mala určité obmedzenia. Patofyziologické reakcie na ischemické poškodenie sa medzi druhmi líšia. Aj keď je model renálnej teplej ischémie u potkanov široko používaný, stále ide o experimentálne prostredie s niekoľkými rozdielmi v porovnaní s klinickým prostredím. Okrem toho by bolo žiaduce hodnotenie renálneho klírensu a iných biomarkerov renálneho séra pre citlivejšiu funkčnú analýzu. Budúce klinické štúdie skúmajúce použitie kvercetínu ako nefroprotektívneho lieku u pacientov, ktorí podstúpili čiastočnú nefrektómiu s teplou ischémiou, sú opodstatnené.

Dospelo sa teda k záveru, že kvercetín bol účinný ako nefroprotektívne činidlo, redukovalo histopatologické modifikácie, predchádzalo glomerulárnej strate a udržiavalo normálne hladiny močoviny v sére po teplej ischémii. Tieto výsledky naznačujú, že tento flavonoid môže zlepšiť- -dlhodobú funkciu obličiek u pacientov, ktorí podstúpili čiastočnú nefrektómiu s teplou ischémiou.

Cistanche tubulosa zabraňuje ochoreniu obličiek, kliknite sem a získajte vzorku

FINANCOVANIE

Koordinácia pre zlepšenie post-

-Absolventi - CAPES

Nadácia na podporu výskumu v Rio de

Janeiro - FAPERJ

Národná rada pre vedecko-technický rozvoj – CNPq

KONFLIKT OF ZÁUJEM

Žiadna deklarovaná.

LITERATÚRA

1. Campbell S, Uzzo RG, Allaf ME, Bass EB, Cadeddu JA, Chang A, et al. Renálna hmota a lokalizovaná rakovina obličiek: Usmernenie AUA. J Urol. 2017; 198:20-9.

2. Cai Y, Li HZ, Zhang YS. Porovnanie parciálnej a radikálnej laparoskopickej nefrektómie: dlhodobé výsledky klinického T1b renálneho karcinómu. Urol J. 2018; 15:16-20.

3. Salameh JP, McInnes MDF, McGrath TA, Salameh G, Schieda N. Diagnostická presnosť dvojenergetického CT na hodnotenie renálnych hmôt: Systematický prehľad a metaanalýza. AJR Am J Roentgenol. 2019; 212:W100-W105.

4. Simone G, Capitanio U, Tuderti G, Presicce F, Leonardo C, Ferriero M a kol. Čiastočná nefrektómia s vypnutou svorkou: Porovnanie dlhodobých funkčných výsledkov podľa skóre sklonu. Int J Urol. 2019; 26:985-91.

5. Bertolo R, Garisto J, Dagenais J, Agudelo J, Armanyous S, Lioudis M a kol. Robotom asistovaná parciálna nefrektómia so studenou verzus teplou ischémiou: Porovnanie funkčných výsledkov u „rizikových“ pacientov so zhodným skóre sklonu. J Endourol. 2018; 32:{5}}.

6. Hur M, Park SK, Shin J, Choi JY, Yoo S, Kim WH a kol. Účinok vzdialeného ischemického predkondicionovania na sérový kreatinín u pacientov podstupujúcich čiastočnú nefrektómiu: protokol štúdie pre randomizovanú kontrolovanú štúdiu. Skúšky. 2018; 19:473.

7. Lee H, Song BD, Byun SS, Lee SE, Hong SK. Vplyv času teplej ischémie na pooperačnú funkciu obličiek po čiastočnej nefrektómii pre klinický karcinóm T1 obličkových buniek: štúdia so skóre sklonu. BJU Int. 2018; 121:46-52.

8. Zabell JR, Wu J, Suk-Ouichai C, Campbell SC. Renálna ischémia a funkčné výsledky po parciálnej nefrektómii. Urol Clin North Am. 2017; 44:{4}}.

9. Ozkan TA, Karakoyunlu N, Polat R, Sarıbaş GS, Şener NC, Özdemir S, a kol. Hodnotenie ochranného účinku ezomeprazolu v experimentálnom modeli renálnej ischémie-reperfúzie. Int Urol Nephrol. 2018; 50:{4}}.

10. Damasceno-Ferreira JA, Abreu LAS, Bechara GR, Costa WS, Pereira-Sampaio MA, Sampaio FJB a kol. Manitol znižuje stratu nefrónov po teplej renálnej ischémii na prasacom modeli. BMC Urol. 2018; 18:16.

11. Abharzanjani F, Afshar M, Hemmati M, Moussavi M. Krátkodobá vysoká dávka kvercetínu a resveratrolu mení markery starnutia u ľudíObličkyBunky. Int J Prev Med. 2017; 8:64.

12. Patra A, Satpathy S, Shenoy AK, Bush JA, Kazi M, Hussain

MUDr. Formulácia a hodnotenie zmiešaných polymérnych miciel kvercetínu na liečbu rakoviny prsníka, vaječníkov a rakoviny rezistentnej voči viacerým liekom. Int J Nanomedicína. 2018; 13:2869-81.

13. Wang D, Lou X, Jiang XM, Yang C, Liu XL, Zhang N. Kvercetín chráni pred zápalom, aktiváciou MMP-2 a indukciou apoptózy u potkanieho modelu kardiopulmonálnej resuscitácie prostredníctvom modulácie Bmi{{2} } výraz. Mol Med Rep. 2018; 18:{5}}.

14. Srinivasan P, Vijayakumar S, Kothandaraman S, Palani M. Antidiabetická aktivita kvercetínu extrahovaného z ovocia Phyllanthus Emblica L.: In silico a in vivo prístupy. J Pharm Anal. 2018; 8:109-18.

15. Tóth Š, Jonecová Z, Čurgali K, Maretta M, Šoltés J, Švaňa M, et al. Kvercetín tlmí ischémiou reperfúziou indukovanú expresiu COX-2 a MPO v sliznici tenkého čreva. Biomed Pharmacother. 2017; 95:{5}}.

16. Park DJ, Shah FA, Koh PO. Kvercetín zmierňuje poškodenie neurónových buniek na zvieracom modeli oklúzie strednej cerebrálnej artérie. J Vet Med Sci. 2018; 80:{3}}.

17. Uyla MU, ahin A, ahintürk V, Alata Ö. Kvercetín ovplyvňuje osud ischémie pečene a reperfúzneho poškodenia u potkanov: Experimentálny výskum. Int J Surg. 2018; 53:{3}}.

18. Kahraman A, Erkasap N, Serteser M, Köken T. Ochranný účinok kvercetínu na poškodenie renálnej ischémie/reperfúzie u potkanov. J Nephrol. 2003; 16:219-24.

19. Kinaci MK, Erkasap N, Kucuk A, Koken T, Tosun M. Účinky kvercetínu na apoptózu, expresiu génov NF-B a NOS pri ischémii/reperfúznom poškodení obličiek. Exp Ther Med. 2012; 3:{4}}.

20. Chen BL, Wang LT, Huang KH, Wang CC, Chiang CK, Liu SH. Kvercetín zmierňuje renálne ischemické / reperfúzne poškodenie prostredníctvom aktivácie autofágovej dráhy regulovanej proteínkinázou aktivovanou AMP. J Nutr Biochem. 2014; 25:1226-34