Kvercetín potláča produkciu zápalových cytokínov v reumatoidnej artritíde Fibroblastom podobným synoviocytom

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPre viac informácií

Abstraktné.Reumatoidná artritída (RA) je chronické, progresívne a systémové autoimunitné ochorenie charakterizované najmä symetrickou mnohokĺbovou synovitídou. Kvercetín má protizápalové, antioxidačné a imunitné regulačné aktivity, a preto vykazuje vysokú liečivú hodnotu. Cieľom tejto štúdie bolo pozorovať účinok kvercetínu na synoviocyty podobné fibroblastom (FLS) pri RA. Reumatoidná artritída fibroblastom podobné synoviocyty (RAFLS) boli vopred ošetrené 50 nmol/l kvercetínu počas 2 hodín a potom boli stimulované pomocou TNF-a počas 24 hodín na následné experimenty. RAFLS boli transfekované krátkym interferujúcim (si)-X-inaktívnym špecifickým transkriptom (XIST), mikroRNA (miR)-485mimika, miR-485inhibítor alebo si-PSMB8 alebo kombinácia. Na vyhodnotenie účinku kvercetínu na RAFLS ošetrené TNF sa použili ELISA, PCR a western blotting -a. Zistilo sa, že kvercetín inhiboval produkciu zápalových cytokínov a expresiu XIST v RAFLS indukovaných TNF-a. Bioinformatická analýza ukázala, že XIST pôsobil ako špongia pre miR-485 a že proteazómový typ podjednotky-8 (PSMB8) bol priamym cieľom miR-485. Okrem toho PSMB8 fungoval ako supresor pri produkcii zápalových cytokínov RAFLS indukovanej TNF-a. Celkovo sa pozorovalo, že kvercetín inhibuje produkciu zápalových cytokínov a expresiu XIST v RAFLS indukovaných TNF-a. Okrem toho by XIST-umlčanie mohlo potlačiť zápalovú reakciu špongiou miR-485 v bunkách ošetrených TNF-a. Celkovo by kvercetín mohol potlačiť vývoj RA in vitro.

Ak chcete vedieť viac, kliknite sem

Úvod

Reumatoidná artritída (RA) je bežné zápalové ochorenie charakterizované zápalovou bunkovou infiltráciou, ktorá vedie k degenerácii synovia, kĺbovej chrupavky a kosti (1). Výskyt a rozvoj RA zahŕňa uvoľnenie veľkého počtu zápalovýchcytokínya mediátorov, čo spôsobuje nevratnú deštrukciu chrupky a kosti v kĺbe (2). S nárastom starnúcej populácie v ľudskej spoločnosti vykazoval výskyt RA v rokoch 1995 až 2001 stúpajúci trend vo vyspelých krajinách (3,4). V súčasnosti sa liečba RA opiera o nesteroidné protizápalové lieky, glukokortikoidy, metotrexát a iné symptomatické metódy kontroly ochorenia. Tieto lieky môžu zlepšiť symptómy RA, ale dlhodobé užívanie má silné toxické vedľajšie účinky, ako je inhibícia imunitnej funkcie tela (5). Preto je veľmi dôležité nájsť bezpečné a účinné lieky na liečbu RA.

Kvercetín je najdôležitejší bioflavonoid v ľudskej strave a nachádza sa vo veľkej miere v kvetoch, listoch a plodoch rastlín (6,7). Kvercetín má protizápalové, antioxidačné a imunitné regulačné aktivity (8,9), a preto vykazuje vysokú liečivú hodnotu. Klinické štúdie ukázali, že kvercetín má dobrý účinok na zmiernenie osteoartrózy kolena, ako aj reumatoidných bolestí kĺbov a tela po cvičení (10-12). Synoviocyty podobné fibroblastom (FLS) sú hlavnými efektorovými bunkami a môžu uvoľňovať rôzne zápalové cytokíny, čím zhoršujú progresiu RA (13,14). Okrem toho môže TNF-a podporovať aktiváciu a kostnú resorpciu osteoklastov a môže indukovať expresiu iných zápalových faktorov, adhéznych molekúl a proteáz spojených s kosťou a chrupavkou; čo spôsobuje zhrubnutie vrstvy synoviálnej výstelky a ďalej zhoršuje zápalovú odpoveď kĺbov (15). Táto štúdia sa preto zamerala na pozorovanie účinku kvercetínu na FLS pri RA a preskúmanie možného mechanizmukvercetínpri liečbe RA.

Materiály a metódy

Bunková kultúra. Primárne bunky RAFLS boli získané z Bunkovej banky zbierky typov kultúr Čínskej akadémie vied (kat. č.{0}}a). Všetky bunky sa udržiavali v DMEM (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) obsahujúcom 10 percent FBS (HyClone; Cytiva) 100 U/ml penicilínu a 100 ug/ml streptomycínu v inkubátore pri 37 stupňoch. Po kultivácii počas 24 hodín boli RAFLS vopred ošetrené 50 nmol/l kvercetínom (MilliporeSigma) počas 2 hodín pri 37 stupňoch a potom boli stimulované s použitím 50 ng/ml TNF-a počas 24 hodín pri 37 stupňoch pre nasledujúce experimenty.

Cistanche môže zlepšiť imunitu

Bunková transfekcia. Malé interferujúce (si)-RNA zamerané na XIST (si-XIST; konečná koncentrácia, 20 nM) a jej zmiešanú negatívnu kontrolu (NC) siRNA (konečná koncentrácia, 20 nM), miR-485inhibítor (konečná koncentrácia, 30 nM) a miešaná inhibičná kontrola (miR-NC; konečná koncentrácia, 30 nM) a miR{8}} mimiká (konečná koncentrácia, 15 nM) a miešaná mimická kontrola (miR-NC mimiká; konečná koncentrácia 15 nM) boli získané zo Šanghaja Spoločnosť GenePharma Co., Ltd. Celkom 1x10 stupňov RAFLS sa umiestnilo na šesťjamkové platne na 12 hodín, potom sa konštrukty transfekovali do RAFLS zmiešaním s činidlom Lipofectamine*2000 (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) pri 37 stupňoch počas 15 minút podľa pokynov výrobcu. . Celkom 24-72 h po transfekcii sa transfekované bunky zhromaždili na nasledujúce experimenty. Sekvencie transfekovaných molekúl boli nasledovné: si-XIST, 5'-GCAAAUGAAAGCUACCAAU-3'; si-NC, 5'-AAUUCUCCGAACGUGUCACGU-3'; miR-485 inhibítor, 5'-UCACGCGAGCCGAACGAACAA-3'; anti-miR-NC, 5'-CAGUACUUUUUGUAGUACAAA-3';miR-485 napodobenina, 5'-GUCAUACACGGCUCUCCUCUCUCU-3'; miR-NC, 5'-UUC UCCGAACGUGUCACGUTT-3!

Enzymovo viazaný imunosorbentový test (ELISA). Koncentrácia zápalových cytokínov v transfekovaných a netransfekovaných RAFLS (IL-1, IL-6 a IL-8) bola stanovená pomocou súprav ELISA (kat. č. KE00021, KE00139 a KE00006; Proteintech Group, Inc.) podľa protokolu výrobcu. Na odčítanie absorbancie pri 450 nm sa použila čítačka mikrodoštičiek.

Reverzná transkripčne-kvantitatívna (RT-q)PCR analýza. Celková bunková RNA sa extrahovala z transfekovaných a netransfekovaných RAFLS pomocou činidla TRIzol" (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Syntéza cDNA sa uskutočnila pomocou Maxima Probe qPCR Master Mix (Fermentas; Thermo Fisher Scientific, Inc.) podľa pokyny výrobcu. Kvantitatívna analýza expresie XIST a PSMB8 sa uskutočnila s použitím činidla SYBROPremix Ex Taqm (Takara Bio, Inc.) a ako endogénna kontrola sa použil GAPDH. Podmienky termocyklovania boli nasledujúce: 94 stupňov počas 3 minút; 40 cyklov 94 stupňov pre 30 sekúnd, 55 stupňov počas 30 sekúnd a 72 stupňov počas 1 minúty a 72 stupňov počas 10 minút. Úroveň expresie miR-485 sa analyzovala pomocou súpravy SYBRO PrimeScript"M miRNA RT-PCR (Takara Biotechnology Co., Ltd. ) a malá jadrová RNA U6 sa použila ako vnútorná referencia. Podmienky termocyklovania boli nasledovné: denaturácia pri 95 stupňoch počas 10 sekúnd; 40 cyklov 95 stupňov počas 5 sekúnd a 60 stupňov počas 20 sekúnd; nasledovaná analýzou disociačnej krivky pri 95 stupňoch počas 60 sekúnd, 55 stupňoch počas 30 sekúnd a 95 stupňoch počas 30 sekúnd. Priméry boli zakúpené od Sangon Biotech Co., Ltd. a sekvencie primérov boli nasledovné: GAPDH Forward, 5-CTTGGTATCGTGGA AGGACTC-3' a reverzný, 5'-GTAGAGCAGGGATGATGATG TTCT-3'; U6 vpred, 5'-GCTTCGGCAGCACATATACTA AAAT-3' a vzad, 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTC AT-3'; IncRNA XIST vpred, 5'-AATGGAACGGCTGA GTTTTAC-3' a vzad, 5'-TCATCCGCTTGCGTTCAT AG-3'; miR-485 vpred, 5'-CAGAGCTGGCCGTGAT-3 a vzad, 5'-GTCGTATCCAGTGCAGGTCCGAGGTA TTCGCACTGGATACGACGAATTC-3'; PSMB8 vpred, 5'-GCTGCCTTCAACATAACATCA-3' a vzad, 5'-CTG CCACCACCACCATTA-3! Relatívna expresia sa analyzovala pomocou 2-AACq(16).

Western blotting. Celkový proteín sa izoloval z RAFLS použitím vopred vychladeného lyzačného pufra RIPA (Beyotime Institute of Biotechnology) vrátane inhibítora proteázy. Celkový proteín sa kvantifikoval pomocou súpravy na testovanie proteínov BCA (Pierce; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Celkom 30 ug proteínových vzoriek na dráhu sa oddelilo pomocou 10 percent SDS-PAGE a následne sa preniesli na nitrocelulózovú membránu (MilliporeSigma). Membrány boli blokované 5 percentným odtučneným mliekom pri teplote miestnosti počas 1 hodiny. Následne boli membrány inkubované cez noc pri 4 stupňoch s primárnymi protilátkami cielenými proti PSMB8 (1:1,000; kat. č. abl80606) a GAPDH (1:1,000; kat.č. abl81602) (všetky od Abcam). Membrány sa inkubovali s chrenovou peroxidázou značenou anti-králičou IgG sekundárnou protilátkou (1:1,000;sc-2027; Santa Cruz Biotechnology, Inc.) pri teplote miestnosti počas 1 hodiny. Proteínové pásy boli vizualizované pomocou detekčnej súpravy ECL (Pierce; Thermo Fisher Scientific, Inc.) a analyzované pomocou softvéru Quantity One v4.6.2 (Bio-Rad Laboratories, Inc.). GAPDH sa použil ako kontrola zaťaženia.

Luciferázový reportérový test. Fragmenty XIST a PSMB8 3'-nepreložené oblasti obsahujúce väzbové miesta divokého typu (WT) alebo mutantné (MUT)miR-485 boli získané od Shanghai GenePharma Co., Ltd. Boli klonované do svetlušiek reportérový vektor luciferázového génu pmiRGLO (Promega Corporation). Plazmid bol syntetizovaný Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc. Potom 48 hodín po transfekcii s použitím činidla LipofectamineD 2000 (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) pri 37 stupňoch s 5 percentami CO sa uskutočnil luciferázový test s použitím súpravy duálneho luciferázového reportérového testovacieho systému (Promega Corporation ) podľa pokynov výrobcu. Aktivita luciferázy sa analyzovala s použitím jednorúrkovej multimódovej čítačky Modulus (Promega Corporation) v porovnaní s aktivitou luciferázy Renilla. Boli použité nasledujúce sekvencie: XIST-WT vpred, 5'-CGCCAGCTTCGACAATTCGAC-3 a vzad, 5'-ACT TGAAGCGGCCATACGTTGACAA-3';XIST-MUT vpred, 5'-TCAAAACCCAACTAGAGGACGATTTG}}TGA{{200}TGA{{200}}TGA ', a naopak, 5'-AACCCAGAAAACCGTACGGCAATCGT-3';

PSMB8-WT vpred, 5'-CCGCTAAGTCCGAGTAGTCA-3' a vzad, 5'-ATAAGAATGCGGCCGAATTCATGG GAA-3'; a PSMB8-MUT vpred, 5-TTAGGACACGCA TCGGATTACGCTATTAT-3' a vzad, 5'-GACACCTGT TTACGGCTACCCGCAAATATGCCAA-3'.

Bioinformatická analýza. Väzbové miesta medzi miR{{0}} a XIST, ako aj miR-485 a PSMB8, predpovedal StarBase v2.0 (http://www.microrna.gr/lncBase) resp. Softvér TargetScan v7.1 (http://www.targetscan.org/vert_71/).

Štatistická analýza. Všetky namerané údaje sú vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka. Rozdiely sa vypočítali pomocou párového Studentovho t-testu na porovnanie medzi dvoma skupinami alebo jednosmernej ANOVA nasledovanej Dunnettovým alebo Tukeyho post hoc testom na viacnásobné porovnania. Všetky štatistické analýzy boli vykonané pomocou GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc.) a SPSS 14.0 (SPSS, Inc.).P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="" difference.="" experiments="" were="" repeated="" three="">

Výsledky

Kvercetín inhibuje produkciu zápalových cytokínov a expresiu XIST v RAFLS indukovaných TNF-a. Pri stimulácii TNF-a bola koncentrácia zápalových cytokínov (IL-1, IL-6 a IL-8) a hladina expresie XIST významne zvýšená v RAFLS v porovnaní s hladinami v NC (obr. IA a B). Avšak liečba kvercetínom mohla výrazne potlačiť podporu TNF-a pri produkcii zápalových cytokínov a hladina expresie XIST bola výrazne znížená vo FLS (obr. IA a B). Tieto výsledky naznačujú, že kvercetín by mohol potlačiť zápalovú reakciu v RAFLS indukovanú TNF-a.

XIST funguje ako špongia pre miR{{0}}. Následne sa skúmali potenciálne molekulárne mechanizmy a predpovedali sa možné ciele XIST pomocou databázy StarBase v2.0.

Bioinformatická analýza ukázala, že miR{0}} má potenciálne väzbové miesto so sekvenciou XIST (obr. 2A). Ukázalo sa, že transfekcia miR-485 mimikom zvyšuje expresiu miR-485 v RAFLS (obr. 2B). Medzitým miR-485 napodobňuje výrazne potlačenú luciferázovú aktivitu v XIST divokého typu v porovnaní s luciferázovou aktivitou v NC (obr. 2C). TNF-a mohol významne znížiť hladinu expresie miR-485 v RAFLS, ktorý bol zachránený kvercetínom (obr. 2D). XIST bol významne podexprimovaný v RAFLS po transfekcii si-XIST (obr. 2E). , XIST-umlčanie významne podporilo expresiu miR-485, ktorá bola zvrátená miR-485 inhibítorom v RAFLS liečenom TNF-a (obr. 2F). Tieto výsledky naznačujú, že XIST interagoval s miR-485.

PSMB8 je priamym cieľom -485. Podľa analýzy TargetScan bolo vysoko konzervované domnelé väzbové miesto s miR-485 identifikované v PSMB8 3'-neprekladanej oblasti (obr. 3A). MiR-485 mimika významne potlačila fluorescenciu v PSMB8 divokého typu v porovnaní s fluorescenciou v NC (obr. 3B). TNF-a mohol významne zvýšiť hladinu expresie PSMB8 v RAFLS, ktorá bola zvrátená kvercetínom (obr. 3C). Inhibítor miR-485 mohol významne znížiť hladinu expresie miR-485 v RAFLS (obr. 3D). Okrem toho bola expresia PSMB8 významne znížená v RAFLS po transfekcii si-PSMB8 ( Obr. 3E). Inhibítor miR-485 by mohol významne zvýšiť expresiu PSMB8 na úrovni mRNA a proteínu, čo bolo zrušené pomocou si-PSMB8 v RAFLS ošetrených TNF-a (obr. 3F). Tieto výsledky ukázali, že miR-485 sa priamo zameral na PSMB8.

PSMB8 funguje ako supresor pri produkcii zápalových cytokínov v RAFLS indukovaných TNF-a. Po transfekcii si-PSMB8 sa koncentrácie zápalových cytokínov (IL-1, IL-6 a IL-8) významne znížili u transfekovaných RAFLS liečených TNF-a v porovnaní s netransfekovanými bunky ošetrené TNF-a (obr. 4A). Okrem toho kvercetín potláčal zápalovú reakciu v RAFLS pod stimuláciou TNF-a, ktorá

bol zachránený transfekciou si-PSMB8 (obr. 4B). Tieto výsledky naznačujú, že PSMB8 by mohol potlačiť zápalovú reakciu v RAFLS indukovanú TNF-a.

Diskusia

Ako prírodný aktívny produkt z rastlín je kvercetín sekundárnym metabolitom izolovaným a extrahovaným z rastlín Fagaceae prírodnou medicínskou chémiou (17). V predchádzajúcich rokoch bolo overené, že kvercetín inhibuje zápalovú odpoveď pri mnohých ochoreniach, vrátane malígnych nádorov ( 18), diabetický Mellitus (19) a ateroskleróza (20). Táto štúdia hodnotila úlohu kvercetínu na rozvoj RA. Predpokladá sa, že po aktivácii fibroblastov v patogenéze RA sa vytvorí séria zápalových faktorov a enzýmov degradujúcich extracelulárnu matricu, ktoré sprostredkujú zápalovú odpoveď, spôsobia progresívnu deštrukciu kostí a chrupaviek a ovplyvnia kvalitu

života vážne (21,22). Táto štúdia pozorovala, že kvercetín potláčal produkciu zápalových cytokínov FLS indukovanú TNF-a.

As a class of non-coding transcripts, IncRNAs are >200 nukleotidov na dĺžku a reguluje génovú expresiu na epigenetickej, transkripčnej a post-transkripčnej úrovni (23,24). lncRNA XIST bola pôvodne identifikovaná pri regulácii inaktivácie X v somatickej bunke samice cicavca (25). Predchádzajúci výskum naznačuje, že deregulovaná expresia XIST sa podieľa na zápalovej reakcii niektorých chorôb vrátane zápalovej neuralgie a akútnej pneumónie (26, 27). V súlade s predchádzajúcim výskumom táto štúdia zistila, že hladina expresie XIST bola upregulovaná v FLS indukovaných TNF-a, ktorý bol zrušený kvercetínom. ncRNA môžu regulovať génovú expresiu hubovaním miRNA (28). Bioinformatická analýza ukázala, že miR-485 mal potenciálne väzbové miesto so sekvenciou XIST.cistanche deserticola maOkrem toho hladina expresie miR{0}} bola znížená vo FLS liečených TNF-a. Okrem toho tlmenie XIST účinne podporovalo expresiu miR-485 v bunkách po transfekcii.

miRNA sa môžu zamerať na 3'-nepreloženú oblasť mRNA na kontrolu génovej expresie (29).cistanche účinkyTáto štúdia odhalila, že PSMB8 je priamym cieľom miR-485.PSMB8 môže fungovať ako podjednotka imunoproteazómu na vyvolanie zápalovej reakcie nasledovne. Yamagishi (30) uvádza, že špecifická inhibícia PSMB8 môže znížiť sekréciu zápalových faktorov, čím sa oneskorí zápalová odpoveď diabetes mellitus. Koerner et al (31) odhalili, že zapojenie PSMB8 do zápalovej odpovede je úzko spojené s rozvojom kolorektálneho karcinómu. Táto štúdia odhalila, že TNF-a by mohol významne zvýšiť hladinu expresie PSMB8 v RAFLS. Okrem toho by si-PSMB8 mohol inhibovať koncentráciu zápalových cytokínov v RAFLS liečených TNF-a. Okrem toho kvercetín nemohol potlačiť zápalovú reakciu v RAFLS liečených si-PSMB8 pri stimulácii TNF-a. Tieto údaje naznačujú, že PSMB8 funguje ako supresor pri produkcii zápalových cytokínov v RAFLS indukovaných TNF-a.

Táto štúdia pozorovala, že potlačenie produkcie zápalových cytokínov kvercetínom vo FLS indukovaných TNF-a je sľubné in vitro. Účinok in vivo a účinok farmakokinetiky a penetrácie synoviálnej membrány na kvercetín sa však ešte musia preskúmať. Plánujú sa teda ďalšie štúdie s cieľom pokúsiť sa študovať účinok kvercetínu na RA in vivo.

Na záver,cistanche deserticolatáto štúdia pozorovala kvercetínom inhibovanú produkciu zápalových cytokínov a expresiu XIST v RAFLS indukovaných TNF-a. Okrem toho by XIST-umlčanie mohlo potlačiť zápalovú reakciu špongiou miR-485 v bunkách ošetrených TNF-a. Celkovo by kvercetín mohol potlačiť vývoj RA in vitro.

Tento článok je prevzatý z 17. júna 2020; Prijaté 11. júna 2021DOI: 10.3892/etm.2021.10695