Rapamycín alternatívne modifikuje mitochondriálnu dynamiku v dendritických bunkách na zníženie ischemického reperfúzneho poškodenia obličiek
Feb 22, 2022
Abstrakt:Dendritické bunky (DC) sú jedinečné imunitné bunky, ktoré môžu spájať vrodené a adaptívne imunitné reakcie a imunometabolizmus výrazne ovplyvňuje ich fenotyp. Rapamycín je makrolidová zlúčenina, ktorá má imunosupresívne funkcie a používa sa na prevenciu straty štepu pri transplantácii obličky. Súčasná štúdia hodnotila terapeutický potenciál ochrany DCs liečených ex-vivo rapamycínomobličkyv myšom modeli akútpoškodenie obličiek (AKI). Na liečbu rapamycínom single (S) (Rapa-S-DC) boli Veh-DC ošetrené rapamycínom (10 ng/ml) počas 1 hodiny pred LPS. Na rozdiel od toho, viacnásobné (M) ošetrenie rapamycínom (Rapa-M-DC) bolo vystavené 3 ošetreniam počas 7 dní. Iba viacnásobné ex-vivo ošetrenia DC rapamycínom vyvolali pretrvávajúce preprogramovanie mitochondriálneho metabolizmu. Tieto DC mali 18-násobne viac mitochondrií, mali takmer 4-násobne vyššiu mieru spotreby kyslíka a produkovali viac ATP v porovnaní s Veh-DC (kontrolné DC ošetrené Veh). Analýza dráhy ukázala, že signalizácia IL10 je hlavnou cestou k zmenenému imunofenotypu po liečbe Rapamycínom v porovnaní s vehikulom s výrazne nižšími cytokínmi Tnfa, Il1b a Il6, zatiaľ čo regulátory mitochondriálneho obsahu Pgc1a, Tfam a Ho1 zostali zvýšené. Je kritické, že adoptívny prenos DC ošetrených rapamycínom na príjemcov WT 24 hodín pred bilaterálnymobličkyischémia významne chránilaobličkyod zranenia s výrazným 3-násobným zlepšením vfunkcie obličiek. Nakoniec infúzia DC obsahujúcich vyšší počet mitochondrií (ošetrených ex-vivo zdravými izolovanými mitochondriami (10 µg/ml) jeden deň predtým) tiež čiastočne chránilaobličkyod IRI. Tieto štúdie ukazujú, že preventívna infúzia ex-vivo preprogramovaných DC, ktoré majú vyšší obsah mitochondrií, má terapeutickú kapacitu na vyvolanie protizápalového regulačného fenotypu na ochranuobličkyzo zranenia.
Kľúčové slová:dendritická bunka; rapamycín; mitochondrie; akútne poškodenie obličiek; ischemické reperfúzne poškodenie
ÚvodPatobiológia akútpoškodenie obličiekje multifaktoriálny a zahŕňa zložité interakcie medziobličkovéparenchymálnych buniek a imunitných buniek [1,2]. Voblička,konvenčné dendritické bunky (DC) sú hlavnou podskupinou imunitných buniek a nachádzajú sa tesne v intersticiálnom priestoreobličky[3 – 5]. DC sú jedným z primárnych typov buniek zapojených do vrodenej imunity a sú nevyhnutné pri poskytovaní ochrany proti patogénom. Naša predtým publikovaná práca s použitím DC derivovaných z kostnej drene ukázala, že terapia DC môže regulovať rôzne vrodené a adaptívne imunitné reakcie spojené s AKI [6,7].
DC sa nachádzajú vo veľkej miere vo všetkých tkanivách, pričom podskupina DC (CD11c plus DC) sídli vobličkovéparenchým. Tieto CD11c plus DC však tiež zohrávajú patogénnu úlohu pri zhoršovanípoškodenie obličiekpo ischemicko-reperfúznom poškodení (IRI) [8]. IRI je definované ako poškodenie vyplývajúce z opätovného zavedenia okysličenej krvi do orgánu po ischémii a často sa vyskytuje pri infarkte myokardu, mŕtvici a transplantácii solídnych orgánov. V reakcii na IRI tvoria CD11c plus DC značnú časť infifiltrátu zápalových buniek vobličkovétkaniva.
DC sú schopné rozpoznať molekulárne vzory spojené s patogénom (PAMP) prostredníctvom rôznych receptorov na rozpoznávanie vzorov umiestnených na povrchu DC, ako sú receptory podobné toll (TLR) a receptory podobné NOD. Väzba receptorov rozpoznávania vzorov (PRR) na ich špecifické PAMP vedie k aktivácii niekoľkých dráh, ktoré zahŕňajú prozápalové reakcie, syntézu antimikrobiálnych peptidov a indukciu lymfocytmi sprostredkovanej adaptívnej imunity [9]. Významný výskum bol venovaný štúdiu zmien v bunkovej bioenergetike DC po aktivácii PAMP. Zistilo sa, že aktivácia DC lipopolysacharidom (LPS; PAMP odlišná od gramnegatívnych baktérií) prostredníctvom väzby na jeho špecifický receptor TLR4 vedie k metabolickej zmene z vysoko účinnej oxidačnej fosforylácie na proces veľmi podobný Warburgovmu metabolizmu alebo aeróbnej glykolýze. . Warburgov metabolizmus je charakterizovaný odklonením pyruvátu generovaného z glykolýzy smerom k premene na laktát na výrobu energie a preč z transportu do mitochondrií, aby prešiel katabolizmom prostredníctvom cyklu TCA, napriek dostatočnej dostupnosti kyslíka. Jedno vysvetlenie tohto javu zahŕňa jeden z mnohých následných účinkov aktivácie TLR4, ktorým je zvýšená aktivita serín/treonín kinázy, cicavčieho cieľa rapamycínu (mTOR). Inhibícia mTOR rapamycínom zachováva mitochondriálnu funkciu v aktivovaných DC znížením iNOS, pričom DC ošetrené rapamycínom stimulované v prítomnosti LPS vykazujúce znížené hladiny aeróbnej glykolýzy [10]. Inhibítory mTORC1, ako je rapamycín, sa v súčasnosti používajú pri transplantácii solídnych orgánov ako možná alternatíva pre inhibítory kalcineurínu, aby sa predišlo chronickýmobličkovépoškodenie aloštepu, pretože má tiež potenciál expandovať CD4 plus CD25 plus regulačné T-bunky [11,12]. Použitie rapamycínu pri transplantácii však môže viesť k zápalovým komplikáciám, ktoré zahŕňajú periférny edém, zvýšenie kreatinínu a trombocytopéniu. Predchádzajúce štúdie ukázali, že nepriaznivé účinky hypoxických stimulov sú zosilnené expozíciou LPS a zoslabené rapamycínom [8,13].
Cieľom je vyvinúť metódy na použitie liekov klinickej kvality schválených FDA, ako je Rapamycín, na vyvolanie regulačných DC, ktoré môžu kontrolovať nežiaduce vrodené a adaptívne imunitné reakcie. Cieľom tejto štúdie bolo určiť potenciálny ochranný mechanizmus (mechanizmy) rapamycínom stimulovaných BMDC na predklinickom myšom modeliobličkyIRI. Liečba BMDC ex-vivo rapamycínom zabraňuje akýmkoľvek nepriaznivým mimocieľovým účinkom a zápalovým komplikáciám spojeným so systémovými injekciami liečiva. Optimálna dávka a načasovanie väčšiny farmakologických zlúčenín alebo liečiv závisia od rôznych parametrov. V rakovinových bunkách nízka dávka rapamycínu v porovnaní s vysokou dávkou odlišne inhibuje mTORC1 a mTORC2, čo vedie k čiastočnej alebo úplnej inhibícii progresie bunkového cyklu [14]. Pre všetky naše ex-vivo kondicionačné štúdie BMDC v súčasnom rukopise sme zvolili nízku dávku rapamycínu 10 ng/ml na základe predtým publikovaných štúdií s tolerogénnymi BMDC [15,16]. Načasovanie toho, koľko dávok (tri alebo jedna) bolo založené na našej predtým publikovanej práci s množiacimi sa myšími BMDC a pridané s GMCSF [17,18]. Naše súčasné údaje ukazujú, že jedno aj viacnásobné ošetrenie DC rapamycínom indukuje menej silné imunogénne reakcie (nižšie cytokíny a kostimulačné molekuly) po stimulácii LPS. Prenos buď jednej alebo viacerých DC ošetrených rapamycínom rovnako chrániobličkyz IRI v syngénnych (C57BL/6 BMDC→C57BL/6 myši) alebo alogénnych (BALB/c BMDC→C57BL/6 myši) modeloch IRI. Avšak, viacnásobné ex-vivo ošetrenie rapamycínom (3 ošetrenia počas 7 dní), okrem zníženia imunogénnych reakcií, tiež zvýšilo počet a funkciu mitochondrií (Seahorse Analyzer) v porovnaní s DC ošetrenými vehikulom. Tieto experimentálne pozorovania naznačujú, že DC s vyšším počtom mitochondrií majú potenciál stať sa regulačnými a prenos týchto DC môže chrániťobličkyz ischemického poranenia. Ako ukázala naša nedávna štúdia s použitím DC liečených FTY720 [18], farmakologické alebo mitochondriálne transplantáty, ktoré indukujú vyšší počet mitochondrií v imunitných bunkách (DC alebo makrofágy), tiež spôsobujú, že tieto bunky majú protizápalový fenotyp, čo je účinok pravdepodobne spôsobený udržiavaním mitochondrií. oxidatívna fosforylácia (OXPHOS) a so zníženým prechodom na glykolýzu pre energiu po stimulácii. Pre tieto účinky sme exogénne zvýšili počet mitochondrií v DC, aby sme otestovali, či vyššie počty mitochondrií môžu indukovať regulačný fenotyp pomocou mitochondriálnych transplantácií. Prenos týchto Mito-DC chránenýobličkyz IRI; avšak na rozdiel od Rapa-DC tieto Mito-DC nemajú znížené imunogénne reakcie (MHCII, kostimulačné molekuly a cytokíny) po stimulácii LPS, čo pravdepodobne naznačuje, že zvýšenie počtu kópií mitochondrií môže prevážiť funkčné zmeny vyvolané exogénnou stimuláciou LPS. V tejto štúdii a ako už bolo predtým preukázané [6,7,18], systémovo injikované DC (liečené nosičom, rapamycínom alebo mitochondriami) v dávke pol milióna sa prevažne nachádzajú iba v slezine a nenašiel sa žiadny signál vobličky. V slezine, ako je FTY{0}}DC, rapamycín a DC bohaté na mitochondrie môžu vyvolať protizápalovú odpoveď vedúcu k ochrane predobličkyIRI. Tieto kľúčové zistenia poskytujú nový dôkaz, ktorý naznačuje, že zvýšenie počtu mitochondrií (exogénne prostredníctvom mitochondriálnych transplantácií alebo prostredníctvom farmakologickej intervencie (FTY720 alebo rapamycín)) v imunitných bunkách môže byť novou terapeutickou modalitou na konečnú reguláciu ich imunologických reakcií na prevenciu a/alebo včasnú liečbupoškodenie obličiek.
Materiály a metódy
MyšiVšetky postupy a manipulácia so zvieratami sa vykonávali v súlade s príručkou National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals a číslo protokolu Bajwa UTHSC, 18-080, dátum schválenia 28.09.2018 bolo schválené Univerzitou of Inštitucionálne výbory pre starostlivosť o zvieratá a ich používanie v Tennessee Health Science Center (UTSHC). Zásady starostlivosti o laboratórne zvieratá sa riadia zásadami verejnej zdravotnej starostlivosti o humánnej starostlivosti a používaní laboratórnych zvierat. Všetky výsledky sa uvádzajú v súlade s usmerneniami ARRIVE [19]. Pre všetky transferové štúdie boli myši C57BL/6J a BALB/c zakúpené od The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA). Myši boli chované v štandardnom ustajnení v teráriu s 12-hodinovým cyklom svetlo/tma na kŕmnej potrave a voda bola voľne dostupná.
Renálna ischémia-reperfúzne poškodenie Boli dodržané všetky podrobné chirurgické postupy, ako už bolo uvedené [18]. Samce myší C57BL/6 (vo veku 8–12 týždňov) boli podrobené 26-minútovej bilaterálnej ischémii, po ktorej nasledovala 20–24 hodinová reperfúzia. Stručne povedané, všetci samci myší boli anestetizovaní intraperitoneálnou (ip) injekciou zmesi ketamínu a xylazínu so subkutánnou injekciou buprenorfínu a umiestnení na teplú podložku, aby sa telesná teplota udržala na 34,5–36 °C. Myši boli potom náhodne rozdelené do podmienok simulácie alebo operácie IRI. Bola vykonaná bilaterálna incízia boku. Telesná teplota bola kontrolovaná a udržiavaná počas ischemického obdobia. Shamoperované myši podstúpili rovnaký postup s výnimkou zovretia cievy a uzavretia chirurgických rán. Myši, ktoré mali jedenobličkybez reperfúzie 24 hodín po ischémii boli vylúčené zo všetkých analýz.
Hodnotenie funkcie obličiek a histológiaKrv sa odoberala v anestézii z retroorbitálneho sínusu a plazmatický kreatinín (mg/dl) sa stanovil pomocou enzymatickej metódy s malými úpravami podľa protokolu výrobcu (Diazyme Laboratories, Poway, CA, USA) a dusíka v krvi v moči (BUN ) a meranie kreatinínu sa uskutočnilo pomocou súpravy QuantiChrom Urea Assay Kit (DIUR-100, BioAssay Systems, Hayward, CA, USA), ako už bolo opísané [18,20]. Pre histológiu,obličkyboli fixované cez noc v 4 percentách PLP alebo 10 percentách formalínu a zaliate do parafínu.Obličkyboli pripravené na farbenie H&E, ako už bolo opísané [18], a boli urobené fotografie s úpravou jasu/kontrastu vykonanou pomocou mikroskopu EVOS (Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, USA). Na kvantifikáciu skóre tubulárneho poškodenia boli rezy hodnotené spočítaním percenta tubulov, ktoré vykazovali nekrózu buniek, stratu kefového lemu, tvorbu odliatku a dilatáciu tubulov nasledovne: 0=normálne; 1=Menšie alebo rovné 10 percent ; 2=10 až 25 percent ; 3=26 až 50 percent ; 4=51 až 75 percent ; 5=Väčšie alebo rovné 75 percent . Bolo hodnotených päť až 10 fifieldov z každej vonkajšej drene a hodnotené slepým spôsobom. Histologická zmena bola vyjadrená ako akútna tubulárna nekróza (ATN), hodnotená ako už bolo opísané [7,21]. Apoptotické bunky sa detegovali testom TUNEL (súprava na detekciu smrti buniek in situ, TMR Red; Roche, Basel, Švajčiarsko) podľa pokynov výrobcu.
Kultúra dendritických buniek (DC) z kostnej drene (BM) a adoptívny prenos8–1{12}} týždňov staré samce myší C57BL/6J alebo BALB/c WT sa použili na generovanie DC z celých prekurzorov BM [22]. Supernatant bohatý na GMCSF bol odvodený z buniek J558L stabilne transfekovaných myšacím GMCSF. Bunková línia bola veľkorysým darom od Dr. Ira Mellmana (oddelenie biológie, Yale University, New Haven, CT, USA). V stručnosti, čerstvo izolovaná BM bola kultivovaná s 6 ng/ml rekombinantného myšieho GMCSF (celkom 3 ošetrenia) počas 8 dní v RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). O optimálnej dávke 10 ng/ml rapamycínu sa rozhodlo po testovaní rôznych dávok (0,1–10 ng/ml). BMDC boli ošetrené 10 ng/ml rapamycínu (Sigma, St. Louis, MO, USA) celkovo na tri ošetrenia alebo 1-cez noc). BMDC boli ošetrené agonistom TLR4 lipopolysacharidom (LPS; Escherichia coli sérotyp 0111:B4: 100 ng/ml; Sigma-Aldrich); alebo vehikulum (1 x PBS) počas 24 hodín v kultivačnom médiu pre syngénne štúdie (C57BL/6J BMDCs→C57BL/6J myši) a ponechané neošetrené pre alogénne štúdie (BALB/c BMDCs→C57BL/6J myši). Bunky sa premyli a 0,5 x 106 buniek na myš sa intravenózne (iv) injikovalo do naivných myší 1 deň pred bilaterálnymobličkyIRI. BMDC boli označené MitoTracker CMXRos Red alebo MitoTracker Deep Red (100 nM, 30 min pri 37 °C, Invitrogen) alebo Mitosox (5 uM; 10 min pri 37 °C; Invitrogen).
Kvantitatívna PCR v reálnom časeRelatívna hladina expresie mitochondriálnej DNA (mtDNA) sa merala, ako už bolo opísané [23]. Stručne povedané, izolovala sa celková genómová DNA a rovnaké množstvá (5 ng) sa použili pre RTPCR s použitím ND1 ako náhradných primérov pre mtDNA a primérov HK2 pre jadrovú DNA (nDNA) pre myš a ND6 pre ľudskú mtDNA, ako už bolo opísané [23,24]. Celková RNA bola izolovaná a reverzne transkribovaná na cDNA a bola uskutočnená RT-PCR, ako už bolo opísané [7,25,26].
Izolácia a kvantifikácia mitochondriíMitochondrie boli izolované z buniek HEK293, ako už bolo opísané [18]. V stručnosti, 60 cm platne buniek HEK293 sa odobrali pridaním 5 ml homogenizačného pufra (300 mmol/l sacharózy, 10 mmol/l HEPES-KOH, 1 mmol/l EGTA-KOH, pH 7,4) s 1 mg proteázy subtilizínu A od Bacillus licheniformis (Sigma-Aldrich). Podrobný protokol na izoláciu mitochondrií možno nájsť v našom predchádzajúcom publikovanom rukopise [18].
2 Bioanalyzátor toku morského koníkaSedem dní staré BMDC boli prenesené na doštičky pre tkanivové kultúry Seahorse 24-, zmerala sa rýchlosť spotreby kyslíka (OCR) a parametre sa vypočítali tak, ako bolo opísané vyššie [25] s nasledujúcou modifikáciou. Po zmeraní bazálnej respiračnej frekvencie oligomycín (Sigma; 2 µM), FCCP (Sigma; 1,5 µM; karbonylkyanid 4- (triflfluórmetoxy)-fenylhydrazón (FCCP)) a inhibítory elektrónového transportného reťazca (komplex I a III) rotenón (Sigma; 0,5 uM) a antimycín A (Sigma; 0,5 uM)) boli injikované postupne počas testu. Bazálne mitochondriálne dýchanie, dýchanie spojené s ATP, únik proton (spotreba kyslíka nesúvisiaca s ATP), maximálne dýchanie, nemitochondriálne dýchanie, rezervná respiračná kapacita, pomer kontroly dýchania a účinnosť väzby boli stanovené v celých bunkách podľa Branda et al. . [27]; Pre každú experimentálnu skupinu sa použilo N=4-5 jamiek a experimenty sa opakovali minimálne 3-krát.
Analýza prietokovou cytometriou, Western Blot a ELISAZískavanie údajov prietokovou cytometriou sa uskutočnilo na FACS Calibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) s vylepšenou farebnou prietokovou cytometriou Cytek {{0}} (Cytek Development, Inc., Fremont, CA, USA). Dáta boli analyzované softvérom FlowJo 9.0 (Tree Star, Ashland, OR, USA), ako už bolo opísané [6,7,28]. Pre ELISA médium bolo odobraté z BMDC 24 hodín po ošetrení 100 ng/ml LPS. Hladiny TNF, IL6 alebo IL10 sa merali pomocou súprav ELISA pre myši (Invitrogen) podľa protokolu výrobcu a ako bolo opísané vyššie [18]. Veh- alebo Mito-DC ošetrené a bez LPS počas 6 alebo 24 hodín sa použili na izoláciu celkového proteínu s použitím RIPA lyzačného pufra doplneného o koktail inhibítorov proteázy a fosfatázy (Thermo Fisher Scientifific, Vernon Hills, IL, USA). Pre GAPDH lyzátové supernatanty boli buď povarené (10 minút pri 100 °C) a lyzáty boli ponechané pri izbovej teplote počas 10 minút pre kokteil OXPHOS pre hlodavce (Abcam, Cambridge, MA, USA) [18]. Podrobnejšie metódy boli opísané skôr [18].
Dáta a štatistická analýzaNa analýzu a prezentáciu údajov sa použil GraphPad Prism 8 (GraphPad Inc., San Diego, CA, USA). Údaje sa analyzovali po transformácii, ak to bolo potrebné na vytvorenie normálnej distribúcie, 2-tailed t testom alebo 1-spôsobom ANOVA s post-hoc analýzou podľa potreby. Na analýzu dvoch skupín sa použil dvojstranný nepárový t test. p Menšie alebo rovné 0.05 sa použilo na označenie významnosti.
Výsledky
Viacnásobná liečba rapamycínom (Rapa-M) indukuje vyšší počet mitochondrií a menej imunogénnych DCDC C57BL/6 WT boli izolované a množené počas 8 dní v prítomnosti GMCSF a vehikula (IX PBS) alebo rapamycínu (10 ng/ml), celkovo tri ošetrenia. DC boli ošetrené 100 ng/ml LPS cez noc. DC ošetrené LPS sa použili pre RNASeq alebo sa označili rôznymi mitochondriálnymi farbivami. Údaje RNASeq potvrdili predchádzajúce údaje, že liečba rapamycínom indukuje menej imunogénnych DC s nižšími prozápalovými cytokínmi, ktoré regulujú vrodené a adaptívne imunitné reakcie s IL10 ako hlavnou meniacou sa dráhou (doplnkový materiálový obrázok S1A, B a tabuľka S1). V porovnaní s liečbou vehikulom liečba rapamycínom zvýšila mitochondriálny obsah v BMDC (obrázok 1A), ako bolo kontrolované pomocou MitoTracker CMXRos Red (50 nM) s a bez LPS. Podobne došlo k výrazne vyššiemu značeniu pomocou MitoTracker Deep Red (100 nM) a výrazne nižšiemu značeniu pomocou MitoSox (5 uM) a po stimulácii LPS cez noc v Rapa-M-DC v porovnaní s Veh-DC (obrázok 1B, C). Semikvantifikácia histogramov MFI pre všetky mitochondriálne farbivá (obrázok 1D). Okrem toho sa Veh- a Rapa-M-DC farbili pomocou JC-1, aby sa skontrolovalo, či liečba rapamycínom zmenila potenciál mitochondriálnej membrány. Viacnásobné ošetrenie rapamycínom nemení základný potenciál mitochondriálnej membrány v porovnaní s kontrolnými BMDC ošetrenými vehikulom, ako je znázornené imunofluorescenciou (obrázok doplnkového materiálu S2A) a prietokovou cytometriou (obrázok doplnkového materiálu S2B, C).
(Veh) a označené (A) MitoTracker CMXRos (50 nM) alebo (B) MitoSox (5 µM) alebo (C) MitoTracker Deep Red (100 nM) . (D) Polokvantifikovaná analýza údajov prietokovej cytometrie MFI mitochondrií značených farbivami. (E) DC boli naočkované do analyzátora Seahorse XF{4}}e, stimulované s LPS a bez neho počas 24 hodín a rýchlosť spotreby kyslíka (OCR) bola stanovená počas sekvenčných ošetrení oligomycínom (1), FCCP (2) a antimycín A/rotenón (3). (F) Kvantifikácia bazálnej produkcie OCR a ATP. (G) Hladiny mRNA Pgcla a Tfam vo Veh-DC a Rapa-M-DC ošetrených 100 ng/ml LPS alebo ponechané nestimulované počas 24 hodín. (H) Prietoková cytometrická analýza MHC II, kostimulačných molekúl (CD40/80/86) a expresia PDL1 bola stanovená so stimuláciou LPS a bez nej. (I) ELISA IL10, IL6 a TNF z Veh-DC a Rapa-M-DC ošetrených 100 ng/ml LPS počas 24 hodín. (J-L) hladiny mRNA Il10, Tnfa a Il6 vo Veh-DC a Rapa-M-DC ošetrených 100 ng/ml LPS alebo ponechané nestimulované počas 24 hodín. * p menšie alebo rovné 0,05, ** p menšie alebo rovné 0,01 a *** p menšie alebo rovné 0,001, jednosmerná ANOVA nasledovaná Tukeyho post-testom. Údaje predstavujú priemer ± SEM z troch opakovaní.
Zmenená mitochondriálna funkcia, bioenergetická analýza bola hodnotená pomocou Seahorse Bioanalyzer. Ako už bolo uvedené [18], LPS znížil spotrebu kyslíka v porovnaní s kontrolami Veh vo Veh-DC, ako sa očakávalo (obrázok 1E, modrá až čierna čiara). Je zaujímavé, že rapa-M DC s alebo bez LPS majú vyššiu bazálnu OCR (obrázok 1E, zelená až modrá čiara v čase nula). Rapa-M-DC preukázal zlyhanie pri zvyšovaní maximálnej respiračnej kapacity po injekcii FCCP v nestimulovaných bunkách, ktorá bola udržiavaná stimuláciou LPS, čo dokazuje, že rapamycín abluje voľnú respiračnú kapacitu, ako sme predtým opísali v práci s FTY-DC [18]. DC ošetrené LPS mali zníženú produkciu ATP meranú pomocou OCR (modrá až čierna) v porovnaní s Veh-DC. Rapa-M-DC demonštroval významne väčšiu produkciu ATP v porovnaní s Veh-DC v nestimulovaných aj LPS stimulovaných DC (obrázok 1F). Rapa-M-DC vykazovali zvýšené hladiny mRNA pre koaktivátor gama receptora aktivovaného peroxizómovým proliferátorom 1-alfa (Pgc1a) v porovnaní s Veh-DC (obrázok 1G) a génovú expresiu pre Pgc1a a mitochondriálny transkripčný faktor A (Tfam ) boli udržiavané v Rapa-M-DC po stimulácii LPS. Tieto údaje naznačujú, že propagácia BMDC v prítomnosti rapamycínu zvýšila mitochondriálny obsah, bazálnu OCR a produkciu ATP.
Testovať, či rapamycín okrem zvýšenia počtu a funkcie mitochondrií tiež vyvolal zmenu v DC kostimulačných molekulách po testovaní LPS. Je zaujímavé, že po liečbe LPS majú Rapa-M-DC výrazne nižšie hladiny expresie kostimulačných molekúl prezentácie antigénu (CD80, CD86 a CD40), MHCII a PDL1 v porovnaní s Veh-DC (obrázok 1H, modrá vs. červená). Je zaujímavé, že Rapa-M-DC mali podobné hladiny expresie pre PDL1 v porovnaní s Veh-DC, ale mali významný nárast pomeru PDL1/CD86 po stimulácii LPS v porovnaní s Veh-DC liečenými LPS, kde PDL1/CD{{{{101} 18}} znížené (Veh/Veh 0,59 ± 0.03 vs. Veh/LPS 0,43 ± 0.{{33 }}02, p < 0,001="" a="" rapa/veh="" 0,56="" ±="" 0,001="" vs.="" rapa/lps="" 0,73="" ±="" 0,02,="" p="">< 0,05).="" medzi="" veh-="" a="" rapa-m-dc="" neboli="" pozorované="" žiadne="" významné="" zmeny="" v="" expresii="" cd11c,="" hoci="" rapa-m-dc="" mal="" nižší="" bočný="" rozptylový="" signál,="" čo="" naznačuje="" menšiu="" veľkosť="" buniek="" po="" stimulácii="" lps="" (údaje="" nie="" sú="" uvedené).="" rapa="" m-dc="" mali="" vyššie="" relatívne="" hladiny="" mtdna/ndna="" v="" porovnaní="" s="" veh-dc="" (105,7="" ±="" 8,7="" oproti="" 196,8,9="" ±="" 49,3),="" čo="" dokazuje,="" že="" liečba="" rapamycínom="" zvyšuje="" počet="" mitochondrií="" dc.="" rapamycín="" významne="" znížil="" génovú="" expresiu="" lps-indukovaných="" il6,="" il10="" a="" tnfa="" a="" proteínové="" koncentrácie="" tnf="" a="" il6,="" ale="" udržal="" vyššie="" hladiny="" il10="" v="" porovnaní="" s="" veh-dc="" ošetreným="" lps="" (obrázok="" 1i–l).="" ďalšie="" gény,="" o="" ktorých="" je="" známe,="" že="" sú="" regulované="" rapamycínom="" (autofágia="" alebo="" zápal),="" sú="" uvedené="" v="" tabuľke="" doplnkového="" materiálu="" s2.="" gény="" po="" lps="" označené="" zelenou="" farbou="" boli="" down-regulované="" a="" červenou="" farbou="" boli="" upregulované="" v="" porovnaní="" s="" príslušným="" ošetrením="">
Prenos Rapa-M-DC chráni obličky pred ischemickým poranenímVšetky DC boli aktivované 100 ng/ml LPS pred prenosom vo všetkých syngénnych štúdiách (myši C57BL/6 BMDC —> C57BL/6). Pol milióna DC bolo injikovaných 1 deň pred 26-minútovou bilaterálnou injekciouobličkyIRI. Schéma návrhu štúdie (obrázok 2A). Ako kontrola sa myšiam injikoval 1 x PBS ako kontrola bez buniek (NC). V porovnaní s myšami liečenými NC a Veh-DC myši liečené Rapa-M-DC významne chrániliobličkyz poranenia, plazmatický kreatinín (obrázok 2B); podobné zmeny v BUN boli pozorované u týchto myší [Sham 41,30 ± 3,4 oproti NC 159,75 ± 3,2 oproti Veh-DC 151,82 ± 1,5 oproti Rapa-M-DC 114,68 ± 16,3; p < 0,05="" nc="" alebo="" veh-dc="" vs.="" rapa-m-dc].="" morfologické="" zmeny="" (obrázok="" 2c,="" d)="" boli="" paralelné="" s="" funkčnými="" štúdiami.="" myši="" liečené="" rapa-m-dc="" majú="">obličkyHladiny mRNA Kim1 [Veh DC 0.016 ± 0.009 oproti Rapa-M-DC {{2{{23} }}}.001 ± 0,002], Ngal [Veh-DC 2,14 ± 1,2 vs. Rapa-M-DC 0,12 ± 0,09] a Tnfa [Veh-DC 0,19 ± 0,15 oproti Rapa-M-DC 0,0005 ± 0,0002] v porovnaní s myšami liečenými Veh-DC. V týchto štúdiách, a ako bolo preukázané skôr [6,7,17,18], myši liečené Veh-DC v dávke pol milióna mali porovnateľné zmeny vfunkcie obličiekaobličkycytokínový profil. V štúdiách syngénneho prenosu mali myši liečené Rapa-M-DC zníženú apoptózu (značenie digoxigenín deoxyuridínového nick-endu sprostredkované terminálnou deoxynukleotidyltransferázou [TUNEL]) v porovnaní s myšami liečenými Veh-DC (Veh-DC 3,8 ± 1,4 oproti Rapa- M-DC 1,1 ± 0,6; p < 0,05);="" reprezentatívne="" obrázky="" z="" analýzy="" tunel="" sú="" uvedené="" na="" obrázku="" s3="" doplnkového="" materiálu.="" zaujímavé="" je,="" že="" u="" myší="" liečených="" rapa-m-dc="" nedošlo="" k="" žiadnym="" významným="" zmenám="" v="" počte="" infifiltrujúcich="" neutrofilov="" v="" porovnaní="" s="" veh-dc="" (údaje="" nie="" sú="" uvedené),="" čo="" naznačuje,="" že="" myši="" liečené="" rapa-m-dc="" nemusia="" mať="" žiadne="" zmeny="" v="" chemokínoch,="" hoci="" funkcia="" týchto="" infifiltrujúcich="" buniek="" vrodenej="" imunity="" môže="" byť="">
Jediná liečba rapamycínom (Rapa-S) indukuje menej imunogénnych DC bez zmeny mitochondriálnej dynamikyĎalej sme testovali, či jediná liečba rapamycínom bola dostatočná na vyvolanie regulačného fenotypu, čím sa uskutočniteľnosť indukcie regulačného fenotypu DC stala klinicky relevantnejšou. WT DC boli izolované a propagované počas 8 dní v prítomnosti GMCSF, celkovo tri ošetrenia. Sedemdňové DC boli ošetrené rapamycínom (10 ng/ml) pred liečbou 100 ng/ml LPS na inkubáciu cez noc a označené nasledujúci deň pomocou MitoTracker CMXRos červená (50 nM). V porovnaní s liečbou vehikulom liečba Rapa-S nemení mitochondriálny obsah v BMDC (obrázok 3A) s a bez LPS. Podobne nenastala žiadna zmena v označovaní pomocou MitoTracker Deep Red (100 nM) a MitoSox (5 µM) a po nočnej stimulácii LPS v Rapa-S-DC v porovnaní s Veh-DC (Obrázok 3B, C). Semikvantifikácia histogramov MFI pre všetky mitochondriálne farbivá (obrázok 3D). Podobne pri analýze viacnásobnej liečby boli Veh- a Rapa-S-DC farbené pomocou JC{{20}}, aby sa skontrolovalo, či jednorazová liečba rapamycínom mení potenciál mitochondriálnej membrány. Jednorazové ošetrenie rapamycínom nemení základný potenciál mitochondriálnej membrány v porovnaní s kontrolnými BMDC ošetrenými vehikulom, ako ukazuje imunofluorescencia (obrázok doplnkového materiálu S2A) a prietoková cytometria (obrázok doplnkového materiálu S2B, C). LPS znížil spotrebu kyslíka v porovnaní s kontrolami Veh vo Veh-DC podľa očakávania (obrázok 3E, modrá až čierna čiara). Rapa-S-DC nemali žiadnu zmenu v bazálnom OCR (obrázok 3E, zelená až modrá čiara v čase nula). Keď bola kvantifikovaná produkcia ATP, LPS znížil produkciu ATP meranú pomocou OCR (modrá až čierna) vo Veh-DC a Rapa-S-DC (obrázok 3F). Avšak Rapa-S-DC vykazovali zvýšené hladiny mRNA pre Pgc1a v porovnaní s kontrolami Veh a tieto hladiny sa udržiavali v Rapa-S-DC po LPS (obrázok 3G), v hladinách transkriptov Tfam sa pozorovala malá až žiadna zmena. Ďalej sme testovali, či jediné ošetrenie rapamycínom vyvolalo zmenu v DC kostimulačných molekulách po LPS. Je zaujímavé, že po liečbe LPS majú Rapa-S-DC výrazne nižšie hladiny expresie kostimulačných molekúl prezentujúcich antigén (CD80, CD86 a CD40), MHCII, a PDL1 v porovnaní s Veh-DC (obrázok 3H). Rapa-S-DC mali podobnú úroveň expresie pre PDL1 v porovnaní s Veh-DC a mali podobné významné zníženie pomeru PDL1/CD86 po stimulácii LPS v porovnaní s Veh-DC (Veh/Veh 0). 59 ± 0,03 vs. Veh/LPS 0,43 ± 0,002, p < 0,001="" a="" rapa-s/veh="" 0,69="" ±="" 0,02="" vs.="" rapa-s/lps="" 0,56="" ±="" 0,008,="" p="">< 0,05).="" jednorazové="" ošetrenie="" rapamycínom="" významne="" znížilo="" génovú="" expresiu="" lps-indukovaných="" il6,="" il10="" a="" tnfa="" spolu="" s="" nižšími="" koncentráciami="" proteínov="" il10="" s="" malou="" alebo="" žiadnou="" zmenou="" v="" tnf="" a="" po="" ošetrení="" lps="" (obrázok="" 3i–l).="" ďalšie="" známe="" gény,="" ktoré="" majú="" byť="" regulované="" rapamycínom="" (autofágia="" [beclin,="" atg7,="" atg9,="" lc3b="" a="" lamp2]="" alebo="" zápal="" [il1b,="" il12p40,="" tlr4,="" nos2,="" hif1a="" a="" ho1])="" boli="" len="" čiastočne="" regulované="" v="" porovnaní="" s="" vehikulovými="" dc="" po="" stimulácii="" lps="" (doplnok).="" tabuľka="" materiálov="">
Prenos Rapa-S-DC chráni obličky pred ischemickým poranenímVšetky DC boli aktivované 100 ng/ml LPS alebo ošetrené rapamycínom (10 ng/ml) pred prenosom vo všetkých syngénnych štúdiách (myši C57BL/6 BMDC→C57BL/6). Pol milióna DC bolo injikovaných 1 deň pred bilaterálnymobličkyIRI. Schéma návrhu štúdie (obrázok 4A). Ako kontrola sa myšiam injikoval 1 x PBS ako kontrola bez buniek (NC). V porovnaní s myšami liečenými Veh-DC myši liečené Rapa-S-DC významne chrániliobličkyz poranenia plazmatický kreatinín (obrázok 4B); podobné zmeny v BUN boli pozorované u týchto myší [Veh-DC 151,82 ± 1,5 vs. Rapa-S-DC 139,53 ± 3,8]. Morfologické zmeny (obrázok 4C, D) boli paralelné s funkčnými štúdiami. Myši liečené Rapa-S-DC majú nižšieobličkyHladiny mRNA Kim1 [Veh-DC 0.016 ± 0.{{10}}{{20}}9 vs. Rapa -S-DC 0.004 ± 0,002], Ngal [Veh DC 2,14 ± 1,2 oproti Rapa-S-DC 0,14 ± 0,008] a Tnfa [Veh-DC 0,196 ± 0,15 oproti Rapa-S-DC 0,0017 ± 0,001] v porovnaní s myšami liečenými Veh-DC.
Alogénny prenos BMDC Rapa-M-DC alebo Rapa-S-DC rovnako chráni obličky pred ischemickým poranenímPol milióna DC bolo injikovaných 1 deň pred bilaterálnymobličkyIRI pre alogénne (BALB/C BMDC→C57BL/6 myši) transferové štúdie. Schéma návrhu štúdie (obrázok 5A). Ako kontrola sa myšiam injikoval 1x PBS ako kontrola bez buniek (NC). V porovnaní s myšami liečenými Veh-DC myši liečené Rapa-M-DC alebo Rapa-S-DC významne chrániliobličkyzo zranenia (obrázok 5B). Morfologické zmeny (obrázok 5C, D) boli paralelné s funkčnými štúdiami. Myši liečené rapamycínom DC majú nižšieobličkyHladiny mRNA Kim1 [Veh-DC 0.04 ± 0.{{10}}2 vs. Rapa-M-DC 0. 005 ± 0.0{{30}}2 vs. Rapa-S-DC 0.{{37} }05 ± 0.0002], Ngal [Veh-DC 0,57 ± 0,3 oproti RapaM-DC 0,19 ± 0,11 oproti Rapa- S-DC 0,05 ± 0,01] a Tnfa [Veh-DC 0,037 ± 0,02 vs. Rapa-M-DC 0,007 ± 0,003 vs. Rapa-S-DC 0,008 ± 0,005] v porovnaní s myšami liečenými Veh-DC. V štúdiách alogénneho prenosu mali myši liečené Rapa-M-DC alebo Rapa-S-DC zníženú apoptózu TUNEL v porovnaní s myšami liečenými Veh-DC (Veh-DC 16,7 ± 8,2 oproti Rapa-M-DC 7,2 ± 2,5 oproti Rapa- S-DC 9,1 ± 0,1).
Exogénne mitochondrie zaťažené DC (Mito-DC) s vyššou mitochondriálnou dynamikou a viac imunogénnym fenotypom po stimulácii LPSWT DC boli izolované a propagované počas 8 dní v prítomnosti GMCSF, celkovo 3 ošetrenia. Sedem dní staré DC boli cez noc liečené ľudskými exogénnymi mitochondriami (10 ug/ml). V porovnaní s liečbou vehikulom majú DC Mito-DC mitochondrie vyššie mitochondrie. Mitochondrie boli izolované z ľudskej bunkovej línie HEK293. BMDC boli analyzované na prítomnosť ľudských mitochondrií v myších WT DC s použitím ľudských mtDNA primerov pre NADH dehydrogenázu (ND). Relatívny obsah ľudskej [mtDNA] vo Veh-DC bol {{10}}},26 ± 0,10 oproti 16,8 ± 0,59; p < 0,001,="" čo="" je="" 63-násobné="" zvýšenie="" genómovej="" dna="" izolovanej="" z="" bmdc.="" obmedzenie="" súčasného="" testu="" spočíva="" v="" tom,="" že="" meria="" ľudskú="" alebo="" myšiu="" mtdna="" vo="" vzťahu="" k="" jadrovej="" dna="" a="" malé="" množstvo="" ľudskej="" mtdna="" zistené="" vo="" veh-dc="" by="" mohlo="" byť="" spôsobené="" malým="" prekrývaním="" sekvencie="" nd="" v="" teste="" pcr="" alebo="" možnosťou,="" pretože="" sme="" ukazujúci="" relatívnu="" expresiu="" k="" myšacej="" jadrovej="" dna.="" aby="" sa="" zistilo,="" či="" vyšší="" obsah="" mitochondrií="" zmenil="" aj="" mitochondriálnu="" funkciu,="" vykonala="" sa="" bioenergetická="" analýza="" pomocou="" bioanalyzátora="" seahorse.="" lps="" znížil="" spotrebu="" kyslíka="" v="" porovnaní="" s="" kontrolami="" veh="" vo="" veh-dc="" podľa="" očakávania="" (obrázok="" 6a,="" modrá="" až="" čierna="" čiara).="" mito-dc="" majú="" vyššiu="" bazálnu="" ocr="" (obrázok="" 6a,="" zelená="" až="" modrá="" čiara="" v="" čase="" nula).="" po="" liečbe="" odpájacím="" fccp="" mito-dc="" preukázal="" zlyhanie="" pri="" zvyšovaní="" maximálnej="" respiračnej="" kapacity="" v="" nestimulovaných="" bunkách,="" ktorá="" bola="" udržiavaná="" stimuláciou="" lps,="" čo="" dokazuje,="" že="" liečba="" izolovanými="" mitochondriami="" odstraňuje="" voľnú="" respiračnú="" kapacitu="" (pravdepodobne="" preto,="" že="" už="" pri="" maximálnom="" ocr="" v="" bazálnom="" stave).="" keď="" bola="" kvantifikovaná="" produkcia="" atp,="" lps="" znížil="" produkciu="" atp="" meranú="" pomocou="" ocr="" (modrá="" až="" čierna)="" vo="" veh-dc.="" mito-dc="" demonštroval="" významne="" väčšiu="" bazálnu="" produkciu="" ocr="" a="" atp="" v="" porovnaní="" s="" veh-dc="" v="" dc="" stimulovaných="" lps="" (obrázok="" 6b).="" mito-dc="" vykazovali="" zvýšené="" hladiny="" mrna="" pre="" pgc1a="" a="" zaujímavo="" významne="" nižšie="" tfam="" v="" porovnaní="" s="" kontrolami="" veh="" (obrázok="" 6c).="" rozdiely="" v="" pgcla="" a="" tfam="" v="" týchto="" súboroch="" experimentov="" po="" stimulácii="" lps="" v="" porovnaní="" s="" údajmi="" na="" obrázkoch="" 1="" a="" 3="" sú="" pravdepodobne="" spôsobené="" použitím="" balb/c="" bmdc.="" v="" porovnaní="" s="" c57bl/6="" bmdc="" majú="" dc="" z="" balb/c="" po="" stimulácii="" významné="" zmeny="" v="" produkcii="" mitochondrií="" a="" cytokínov="" [29,30].="" vzhľadom="" na="" tieto="" zmeny="" v="" dc="" sme="" historicky="" používali="" vyšší="" ischemický="" čas="" u="" balb/c="" myší="" v="" porovnaní="" s="" c57bl/6,="" aby="" sme="" mali="">obličkyzranenie [6,18]. Tieto údaje naznačujú, že prenos exogénnych zdravých mitochondrií vedie k zvýšenému obsahu mitochondrií, bazálnej OCR a produkcii ATP. To naznačuje potenciál pre protizápalový fenotyp v DC po liečbe exogénnymi mitochondriami, ako sa ukázalo v našej predchádzajúcej štúdii [18]. Ďalej testujeme, či DC ošetrené exogénnymi mitochondriami, čo vedie k zvýšeniu počtu a funkcie mitochondrií, tiež vyvolalo zmenu v DC kostimulačných molekulách po LPS. Je pozoruhodné, že so stimuláciou LPS a bez nej majú Mito-DC významne vyššie hladiny expresie kostimulačných molekúl prezentácie antigénu (CD80, CD86 a CD40), MHCII a PDL1 v porovnaní s Veh-DC (obrázok 6D). Okrem toho Mito-DC mali vyššiu úroveň expresie pre PDL1 v porovnaní s Veh-DC; mali však tiež zvýšený pomer PDL1/CD86 po stimulácii LPS v porovnaní s Veh-DC ošetrenými LPS (údaje nie sú uvedené). Mito-DC mal významne otupenú génovú expresiu LPS-indukovaného Tnfa, ale vyššiu génovú expresiu IL6 a 1110 v porovnaní s Veh-DC a nižšie proteínové koncentrácie TNF a IL10, ale udržal si vyššie hladiny IL6 v porovnaní s Veh-DC ošetreným LPS (obrázok 6E -H). Ďalšie gény, o ktorých je známe, že sú regulované mitochondriami (autofágia [Beclin, Atg7, Atg9, Lc3b a Lamp2] alebo zápal [Il1b, Il12p40, Tlr4, Nos2, Hifla a Ho1]) boli čiastočne regulované po stimulácii LPS (tabuľka doplnkového materiálu S3). Veh-DC a Mito-DC boli ošetrené LPS počas 6 a 24 hodín. Merali sa relatívne zmeny v mitochondriálnom komplexe. Mito-DC ošetrené s LPS a bez neho majú významne vyššie hladiny proteínov mitochondriálnych komplexov IV, II a I a významne nižšie hladiny komplexov V a III v porovnaní s Veh-DC (obrázok 6I). Semikvantitatívna analýza relatívnej proteínovej expresie mitochondriálnych komplexov voči GAPDH (obrázok 6J). Bloty po celej dĺžke sú poskytnuté ako doplnkové figúrky (doplnkové obrázky materiálu S4 – S7).
Obrázok 6. Mitochondriálne zaťažené DC (Mito-DC) majú vyššiu mitochondriálnu funkciu a imunogenicitu po LPS stimulácii v porovnaní s Veh-DC. Sedem dní staré Veh-DC a boli inkubované s 10 µg/ml mitochondrií HEK293 jeden deň pred liečbou 100 ng/ml LPS počas ďalších 24 hodín alebo boli ponechané nestimulované ( Veh). (A) 24 hodín po pridaní mitochondrií boli DC nasadené do analyzátora Seahorse XF{10}}e, stimulované s LPS a bez neho počas 24 hodín a rýchlosť spotreby kyslíka (OCR) bola stanovená počas sekvenčných ošetrení oligomycínom (1 FCCP (2) a antimycín A/rotenón (3). (B) Kvantifikácia bazálnej produkcie OCR a ATP. (C) Hladiny mRNA Pgcla a Tfam vo Veh-DC a Mito-DC ošetrených 100 ng/ml LPS alebo ponechané nestimulované počas 24 hodín. (D) Prietoková cytometrická analýza MHCII, kostimulačných molekúl (CD40/80/86) a expresia PDL1 bola stanovená so stimuláciou LPS a bez nej. (E) ELISA IL10, IL6 a TNF z Veh-DC a Mito-DC ošetrených 100 ng/ml LPS počas 24 hodín. Hladiny (F–H) mRNA Tnfa, Il6 a Il10 vo Veh-DC a Mito-DC ošetrených 100 ng/ml LPS alebo ponechané nestimulované 24 hodín. Dáta predstavujú priemer ± SEM, * p menšie alebo rovné 0,05, ** p menšie alebo rovné 0,01 a*** p menšie alebo rovné 0,001, jednosmerná ANOVA, po ktorej nasleduje Tukeyho post-test. Údaje predstavujú priemer ± SEM z troch opakovaní.
Alogénny BMDC prenos Mito-DC chrániObličkyz ischemického poranenia Pol milióna DC bolo injikovaných 1 deň pred bilaterálnymobličkyIRI pre Mito-DC allo génové (BALB/C BMDC→C57BL/6 myši) transferové štúdie. Schéma návrhu štúdie (obrázok 7A). Ako kontrola sa myšiam injikoval 1x PBS ako kontrola bez buniek (NC). V porovnaní s myšami liečenými Veh-DC myši liečené Mito-DC významne chrániliobličkyzo zranenia (obrázok 7B). Morfologické zmeny (obrázok 7C, D) boli paralelné s funkčnými štúdiami. Myši liečené Mito-DC majú nižšieobličkyHladiny mRNA Kim1 [Veh-DC 0.04 ± 0.02 oproti Mito-DC 0.02 ± 0.01], Ngal [Veh-DC 0,57 ± 0,3 vs Mito-DC 0,39 ± {{29} }.20] a Tnfa [Veh-DC 0,037 ± 0,02 vs. Mito-DC 0,0028 ± 0,0013] v porovnaní s myšami liečenými Veh-DC. V štúdiách alogénneho prenosu mali myši liečené Mito-DC zníženú apoptózu TUNEL v porovnaní s myšami liečenými Veh-DC (Veh-DC 16,7 ± 8,2 oproti Mito-DC 3,0 ± 1,2).
Diskusia V súčasnej štúdii sme preukázali ochranu predobličkyIRI indukovaná adoptívnym prenosom DC ošetrených rapamycínom (buď raz alebo viackrát) alternatívne reguluje funkciu DC, ktorá je závislá od relatívnych zmien v dynamike mitochondrií. Jedno aj viacnásobné ošetrenie rapamycínom indukuje znížené imunogénne (nižšie cytokíny a kostimulačné molekuly) DC. Prenos buď Rapa-M-DC alebo Rapa-S-DC chrániobličkyz ischemického reperfúzneho poškodenia, čo naznačuje, že znížený imunogénny stav DC modifikovaných rapamycínom indukuje ochranu. Okrem toho chráni aj prenos Veh-DC, ktorý mal prechodné zvýšenie počtu mitochondriíobličkyz IRI (obrázok 8A–D)). Z týchto štúdií môžeme vyvodiť záver, že injekcia menej imunogénnych DC je ústredná pre vyvolanie ochrany pred IRI, čo je proces, ktorý možno dosiahnuť farmakologickou liečbou (rapamycínom) alebo prenosom zdravých exogénnych mitochondrií. Ako už bolo uvedené [31] a potvrdené v našich štúdiách RNAseq, celkovo neexistuje jasný tolerogénny podpis spojený s DC modulovanými rapamycínom. Aj keď rapamycínové DC vykazujú niektoré významné zmeny v génoch po stimulácii LPS v porovnaní s vehikulovými DC, tieto boli obmedzené na RapaM-DC, ktoré majú nižšiu cytokínmi sprostredkovanú signalizáciu a produkciu cytokínov (TNF-signalizácia prostredníctvom produkcie NF-kB a IFN), všetko kritické v oboch vrodené a adaptívne imunitné reakcie. Ako už bolo uvedené a potvrdené v našej štúdii, signalizácia IL-10 bola identifikovaná ako hlavná dráha, ktorá sa líšila v DC liečených rapamycínom s FDR 5,87 × 10 4 (doplnkový materiálový obrázok S1), charakteristickým cytokínom tolerogénneho podpisu v DC.
Historicky sú tolerogénne DC (Tol-DC) identifikované ako zrelé alebo polonezrelé s nízkou expresiou kostimulácie (CD80, CD{5}}, CD40) so zvýšenou produkciou IL10 sprevádzanou nízkou sekréciou IL12 a IFN nižšia schopnosť aktivovať T bunky a potenciál indukovať Treg po prozápalovej stimulácii [32,33]. Regulačné alebo tolerogénne DC môžu byť diferencované in vitro pomocou imunosupresívnych liekov alebo zlúčenín ako FTY720 [18] alebo rapamycínu (súčasná štúdia), alebo protizápalových cytokínov ako IL10 [34] alebo prostredníctvom genetickej modifikácie.
Úloha dendritických buniek pri akútnom poškodení obličiek (AKI)Aj keď sa urobili veľké farmakologické pokroky v prevencii alebo liečbe rôznych zranení, žiadne nie sú pre AKI dostupné, zostáva teda hlavnou zdravotnou záťažou [35]. Okrem toho je použitie nešpecifických imunosupresívnych liekov spojené s nepriaznivými vedľajšími účinkami na prevenciu alebo redukciu adaptívnych imunitných reakcií sprostredkované odmietnutie aloštepu alebo autoimunitné ochorenie. Výhodou je teda použitie typu imunitných buniek, ako sú DC, ktoré môžu cieliť na vrodené a adaptívne imunitné reakcie. Okrem toho sú DC dôležité bunky v imunite alebo tolerancii a skúma sa myšlienka použitia ex-vivo regulačných alebo tolerovaných DC v bunkových terapiách rakoviny, autoimunitných porúch a transplantácií [36]. Farmakologické (FTY720 [18]) alebo biologické stratégie (geneticky modifikované) indukujú regulačné alebo tolerogénne DC (Tol-DC) [37], ktoré sú buď odolné voči dozrievaniu alebo majú nižšie úrovne dozrievania, alebo sú alternatívne aktivované, ktoré v konečnom dôsledku exprimujú nízke hladiny MHC I alebo MHC II a kostimulačné molekuly ako CD40, CD80 a CD86. S použitím CD11c-DTR transgénnych myší sme už predtým publikovali štúdie, ktoré preukázali, že deplécia DC difterickým toxínom významne chránila myšiobličkyz ischemicko-reperfúzneho poškodenia (IRI) [7,38] a naopak na dávke závislý nárast počtu DC exacerbovalpoškodenie obličiek[7], čo naznačuje, že DC by mohli hrať hlavnú úlohu pri regulácii AKI. Stojí za zmienku, že v AKI model AKI, ktorý sa používa (chemoterapia s použitím cisplatiny alebo ischémia), určuje úlohu DC pri zmene imunologických reakcií. Pri AKI indukovanom cisplatinou vedie ablácia DC buď pomocou transgénnych myší alebo pomocou injekcie lipozomálneho chlodronátu k väčšiemu poškodeniu, pretože IL-10 produkovaný z DC v tomto modeli je v konečnom dôsledku nevyhnutný na tlmenie nefrotoxického poškodenia [39,40].
Rapamycín: zápal, imunitné bunky, ischemické reperfúzne poškodenie (IRI)Predtým publikované štúdie preukázali ochrannú úlohu rapamycínu v modeloch AKI pomocou štúdií IRI, ktoré zahŕňali reguláciu infifiltrácie buniek NKT a ich funkcie, čím sa zlepšilapoškodenie obličiek[41] v tejto štúdii boli myši trikrát orálne liečené rapamycínom 24 hodín, 1 hodinu pred ischémiou a 12 hodín po ischémii. Chronické perorálne podávanie myšiam jeden deň predtýmobličkyIRI a každý deň potom (až 7 dní) viedli k vyššímpoškodenie obličiekv dôsledku inhibícieobličkovéproliferácia tubulárnych buniek 1 a 3 dni po ischémii [42]. Bolo to evidentné ako na myšom modeli unilaterálnej ureterálnej obštrukcie (UUO), kde sa liečba rapamycínom zlepšilaobličkyfifibrózy priamou inhibíciou signalizácie mTOR v myofifibroblastoch a intersticiálnych makrofágoch [43]. Tieto štúdie naznačujú, že rapamycín môže mať opačné účinky pri rôznych akútnych a chronickýchobličkymodelov. Rôzne štúdie však uvádzajú škodlivú úlohu rapamycínu na zvieracích modeloch IRI. Perorálne podávanie rapamycínu (4 mg/deň) počas 7 dní u yorkshirských ošípaných narušilo vazorelaxáciu závislú od endotelu a zvýšilo nekrózu myokardu v modeli oklúzie koronárnej artérie [44]. U myší však akútna liečba rapamycínom (hodinu pred ischémiou, intraperitoneálna injekcia) vyvolala kardioprotekciu reguláciou signalizácie JAK2-STAT3 na ochranu pred infarktom myokardu [45]. V závislosti od cesty (žalúdovou sondou alebo subkutánne alebo intraperitoneálne), dávkovania (0.1–6 mg/kg/deň), načasovania (skoré alebo oneskorené) [46] a typu použitého modelu (srdce [47] , pečeň [48] prípobličky[41,49]), rapamycín sa ukázal ako ochranný [47] alebo neprotektívny [50].
Bunková terapia a rapamycínPropagácia myších BMDC alebo ľudských CD14 plus monocytov, ktoré považujeme za chronické, vyvolala alternatívny ochranný alebo regulačný fenotyp v DC, ktorý reguloval vrodené aj adaptívne imunitné reakcie. Pri letálnej chorobe štep verzus hostiteľ mali DC generované s rapamycínom znížené MHC II a kostimulačné molekuly, ale mali vyššiu populáciu produkujúcu IL12 po stimulácii LPS. Tieto IL12 produkujúce Rapa-M-DC zosilňovali apoptózu apoptózy T buniek, čo je mechanizmus, ktorý zahŕňa IFN [51]. Podobne CD14 plus monocyty propagované v prítomnosti rapamycínu tiež produkovali vyšší IL12p70 spolu s hladinami IL27, ktoré regulovali funkciu NK buniek, čím sa menili alogénne reakcie T buniek prostredníctvom IFN [52]. Inoblička,prenos Tregs liečených rapamycínom výrazne potlačil reakcie T buniek, myeloidných buniek a myofifibroblastov, čo viedlo k zlepšeniu akútnych a chronickýchochorenie obličiekv porovnaní s priamou liečbou myší rapamycínom [53]. Podobne sa zlepšil adoptívny prenos myeloidných supresorových buniek (MDSC) ošetrených rapamycínom do myšífunkcie obličiekso zníženým histologickým poškodením a infifiltráciou imunitných buniek [54]. Tieto štúdie poskytujú dôkaz, že bunková terapia, ktorá zahŕňa liečbu buniek rapamycínom pred injekciou, zabraňuje nepriaznivým vedľajším účinkom, ktoré by mohli byť spojené so systémovou liečbou rapamycínom. Okrem toho sme testovali použitie metformínu alebo zlúčenín ako 5-aminoimidazol-4-karboxamid-1- -4- ribofuranosid (AICAR) na vyvolanie regulačného fenotypu u myších DC, aby sme otestovali ich úlohu pri zmeneobličkyIRI. Podobne ako pri dávkovacej stratégii používanej pri rapamycíne (Rapa-S-DC), sme BMDC ošetrili nízkymi dávkami metformínu (1 mM) alebo AICAR (1 mM) v deň 7 spolu s LPS. Systémovo sme si injekčne podali 0,5 x 106 buď metformín-DC alebo AICAR-DC jeden deň predtýmobličkyIRI. Myši liečené buď metformínom-DC alebo AICAR-DC boli významne chránené v porovnaní s myšami liečenými buď NC alebo Veh-DC (nepublikované pozorovania, Bajwa lab). Viaceré lieky alebo zlúčeniny, ktoré indukujú metabolické zmeny alebo aktivujú dráhu AMPK, by teda mohli stáť za testovanie buď samostatne alebo v kombinácii. Stojí za zmienku, že použitie viacerých kombinácií liekov alebo zlúčenín (metformín alebo AICAR), ktoré by mohli potenciálne dopĺňať ochranné účinky rapamycínu, sa ešte musí preskúmať pri hodnotení ich použitia v BMDC. V rakovinových bunkách kombinácia AICAR s rapamycínom zvyšuje účinnosť rapamycínu na ďalšie potlačenie mTORC2 na vyvolanie apoptózy [55]. V T bunkách sa testovalo aj kombinované použitie metformínu a rapamycínu ako potenciálneho regulátora metabolického kontrolného bodu na ovplyvňovanie funkcie T buniek [56]. Preto by sa tieto kombinované terapeutické modality mali v budúcnosti testovať s tolerogénnymi alebo regulačnými BMDC ako potenciálnymi priamymi alebo nepriamymi regulátormi metabolických kontrolných bodov.
Rapamycín: Úloha mitochondrií v dendritických bunkách a makrofágochFunkcie DC a makrofágov sú regulované mitochondriálnym metabolizmom. Makrofágy typu 1 [57,58] a imunogénne DC (aktivácia sprostredkovaná TLR) majú metabolický prechod, pri ktorom je mitochondriálna oxidačná fosforylácia inhibovaná endogénne syntetizovaným oxidom dusnatým (NO) a zaväzujú sa k vysokej aeróbnej glykolytickej rýchlosti [59]. Aktivácia DC alebo makrofágov niekoľkými agonistami TLR (LPS alebo CpG) vedie k rýchlemu zvýšeniu glykolýzy, po ktorej nasleduje zníženie OXPHOS a mitochondriálneho membránového potenciálu [59–61]. Určitá úloha mitochondrií bola preukázaná u DC liečených in vitro vitamínom D; tieto DC majú zvýšenú produkciu OXPHOS, mitochondriálnej hmoty a mROS [62], naša nedávna štúdia s použitím FTY720 [18] ukázala podobné zmeny v DC (vyššia OXPHOS a menšia imunogenicita), akútna liečba rapamycínom predĺžila bunkovú životnosť DC, ktorá bola závislá od zachovania mitochondriálnej funkcie [10] prostredníctvom inhibície NO. Na rozdiel od predlžovania dĺžky života DC tie isté skupiny tiež uviedli, že akútna alebo krátka expozícia rapamycínu v DC z nich tiež robí silné aktivátory antigénovo špecifických CD8 plus T buniek, čím sa zvyšuje kontrola melanómu B16 ako vakcinácia u myší [63]. Akútna liečba (90 minút) DC derivovaných z ľudských monocytov rapamycínom potláča LPS indukované imunostimulačné molekuly a alostimulačný potenciál, ktorý zahŕňal neschopnosť liečených DCS zosilniť NF-kB signalizáciu [64]. V makrofágoch rapamycín potláča produkciu IL1 a IL-18po stimulácii LPS, čo je proces, ktorý tiež zahŕňa redukciu mitochondriálnych ROS (mtROS) priamou inhibíciou dráh NLRP3 inflflammasóm-p38 MAPK-NF-kB [65]. rapamycínom kondicionované DC (Rapa-DC) z myší a ľudí sa správajú odlišne, v porovnaní s myšou Rapa-DC sa ukázalo, že ľudský Rapa-DC je čiastočne odolný voči dozrievaniu po prozápalových cytokínoch a vykazuje heterogenitu pri regulácii expanzie efektorových T-buniek a funkcia [66]. Veľkú časť imunoregulačných vlastností DC odvodených od monocytov upravených rapamycínom a ich úlohu pri transplantácii elegantne zhodnotili Macedo et al. [67].
Naše súčasné zistenia naznačujú, že jedno alebo viaceré DC ošetrené rapamycínom majú znížený imunogénny a imunostimulačný fenotyp po stimulácii LPS. Prenos týchto DC chrániobličkyod IRI. Rapamycín alternatívne reguluje dynamiku mitochondrií; iba viacnásobná liečba indukuje vyšší počet mitochondrií. Tieto údaje naznačujú, že mitochondriálna dynamika DC (vyšší obsah mitochondrií) spolu s menej imunogénnym fenotypom indukovaným rapamycínom spolupracujúobličkyz chemického poškodenia. Aj keď je zaujímavejšie, naše údaje s DC ošetrenými exogénnymi mitochondriami naznačujú, že vyšší počet mitochondrií môže prekonať imunogénnejší stav DC po stimulácii LPS, aby sa tiež chránilobličkyod IRI. Bude zaujímavé potvrdiť, či vyššie počty mitochondrií v DC menia reakcie T buniek, DC majú schopnosť meniť imunitnú odpoveď, ako naznačila naša predchádzajúca štúdia. Naše predbežné údaje naznačujú, že v štúdiách alogénnej proliferácie T buniek DC s vyšším počtom mitochondrií potláčajú proliferáciu CD4 T buniek v zmiešaných lymfocytových reakciách (MLR, údaje nie sú uvedené). V súčasnosti nie je jasné, či DC s vyšším počtom mitochondrií môžu vyvolať reakciu Treg, ktorá by mohla pozitívne prispieť k ochraneobličkyod IRI. Tie budú predmetom nášho ďalšieho štúdia.
Závery V súhrne sme preukázali, že BMDC môžu regulovaťpoškodenie obličiekmechanizmom, ktorý zahŕňa biogenézu mitochondrií buď viacnásobným ošetrením rapamycínom alebo exogénnym zvýšením počtu mitochondrií použitím exogénnych mitochondrií. Dospeli sme k záveru, že regulačné DC (DC s vyšším počtom mitochondrií) môžu byť užitočné vobličkyIRI, ako aj pri iných zápalových stavoch, ako je transplantácia a autoimunitné poruchy na prevenciu alebo liečbu poranenia.