Rýchle simultánne stanovenie šiestich účinných zložiek v Cistanche Tubulosa pomocou blízkej infračervenej spektroskopie

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Xinhong Wang, Xiaoguang Wang a Yuhai Guo

Abstrakt:

Kvantitatívne stanovenie viacerých účinných zložiek v danej rastline si zvyčajne vyžaduje veľmi veľké množstvo autentických prírodných produktov. V tejto štúdii sme navrhli rýchlu a nedeštruktívnu metódu na súčasné stanovenie echinakozidu, verbaskozidu, manitolu, sacharózy, glukózy a fruktózy vCistanche tubulosapomocou blízkej infračervenej spektroskopie (NIRS). Blízka infračervená difúzna reflexná spektroskopia (DRS) a vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC) sa uskutočnili na 116 dávkach vzoriek Cistanche tubulosa. Údaje DRS boli spracované pomocou štandardnej normálnej odrody (SNV) a metódy multiplikatívnej korekcie rozptylu (MSC). Čiastočná regresia najmenších štvorcov (PLSR) sa použila na zostavenie kalibračných modelov pre zložky, ktoré sú predmetom záujmu v Cistanche tubulosa. Všetky modely sa potom hodnotili výpočtom strednej kvadratickej chyby kalibrácie (RMSEC), korelačného koeficientu kalibrácie (r). Hodnoty r všetkých šiestich kalibračných modelov boli určené ako väčšie ako 0,94, čo naznačuje, že každý model je spoľahlivý. Preto kvantitatívne modely NIR uvedené v tejto štúdii možno kvalifikovať tak, aby presne kvantifikovali obsah šiestich liečivých zložiek vCistanche tubulosa.

Kľúčové slová: Cistanche tubulosa; vysokoúčinná kvapalinová chromatografia; blízka infračervená spektroskopia; čiastočné najmenšie štvorce

Úvod

Cistanche(Hoffmg. Et Link) je viacročný fanerogamný rod rastlín z čeľade Orobanchaceae. Väčšina druhov patriacich do rodu Cistanche sa v Číne používa ako liečivá rastlina po tisícročia; mať povesť vynikajúceho tonika; a sú známe ako „Ženšen púští“ [1,2].Cistanche tubulosaje obligátnym parazitom koreňov trvácej rastliny Tamarix Chinensis. V Čínskom liekopise je zdokumentovaný ako autentický zdroj Cistanches Herba (čínsky názov: Roucongrong) z vydania z roku 2005 [3]. Moderný farmakologický výskum na druhoch Cistanche sa začal v 80. rokoch 20. storočia [4]. Farmakologické výskumy ukázali, že extrakty z rastlín Cistanche majú široké spektrum účinkov, ako je liečba nedostatku obličiek a stareckej zápchy, zlepšenie schopnosti učiť sa a zapamätania, proti Alzheimerovej chorobe, posilnenie imunity, proti starnutiu, proti únave atď. [1,5–7]. V posledných troch desaťročiach sa komplexné a systematické farmakologické štúdie spojili s fytochemickými výskumami, aby sa objasnil materiálny základ priaznivých účinkov koreňov rastlín Cistanche. Tieto prieskumy naznačujú, že fenyletanoidové glykozidy (PhG) boli hlavnými účinnými zložkami rastlín Cistanche, ktoré zohrávali kľúčovú úlohu pri liečbe obličkovej nedostatočnosti, impotencie [8], proti starnutiu [9] a proti Alzheimerovej chorobe [10]. Obsah dvoch PhG (echinakozid a verbaskozid) bol požadovaný v Čínskom liekopise. Medzitým sacharidy, ako je manitol, sacharóza, glukóza a fruktóza v rastlinách Cistanche, majú laxatívnu funkciu a sacharidové zhluky rastlín Cistanche sa používajú na liečbu zápchy [11].

Divoké zdrojeCistanche tubulosasú distribuované najmä v oblasti okolo púšte Taklamakan v južnej autonómnej oblasti Xinjiang v Číne. Podobne ako mnohé iné druhy používané ako tradičná čínska medicína (TCM), C. tubulosa má veľkú ekonomickú hodnotu a vo svojom voľne žijúcom prostredí takmer vyhynula v dôsledku nadmerného zberu. Pestovanie C. tubulosa sa začalo v 90. rokoch 20. storočia v Číne, aby sa zabezpečili dodávky surovín pre Cistanches Herba, ako aj ochrana divokých rastlinných zdrojov. Od roku 2017 existuje takmer 13 tisíc ha pestovanej C. tubulosa v prefektúre Hotan v Sin-ťiangu [12,13]. Požaduje sa pokrok v technológii výsadby, rozšírenie pestovania, ako aj zlepšenie kvalityCistanche tubulosa.

Primárny účel kultivácieCistanche tubulosaje vyrábať Cistanches Herba, ktorá je bohatá na tieto účinné zložky. Obsah účinných zložiek v Cistanches Herba, ako sú PhGs a oligosacharidy, však môžu byť počas výroby výrazne ovplyvnené mnohými faktormi [12,13]. Mal by sa preskúmať systém detekcie kvality C. tubulosa v reálnom čase. Preto je potrebné vyvinúť vysokovýkonnú metódu, ktorá plne naplní požiadavku analýzy veľkého počtu vzoriek v krátkom časovom období. Tradične sa stanovenie týchto primárnych účinných zložiek, ako sú PhG a sacharidy, v C. tubulosa zvyčajne dosahovalo pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC) [14,15]. Hoci je presný a spoľahlivý, je časovo náročný a pracný na zber a spracovanie údajov. Okrem toho je potrebné veľa času a úsilia na prípravu vzorky, ktorá zvyčajne zahŕňa pulverizáciu, extrakciu a filtráciu testov HPLC. Na získanie pomerne veľkého množstva dát je preto potrebný jasný princíp a ľahko ovládateľný nástroj. Našťastie sa blízka infračervená spektroskopia (NIRS) vo veľkej miere využíva na hodnotenie poľnohospodárskych produktov [16], potravín [17], lekárskych vzoriek [18] a farmaceutických produktov [19], pretože je rýchla a zároveň nedeštruktívna. Preto by NIRS mohol presne zodpovedať požiadavkám na efektívne merania TCM a nie je prekvapujúce, že NIRS sa použil na kvalitatívnu identifikáciu [20, 21] a kvantifikáciu zlúčenín [22] v TCM.

V tejto štúdii sa obsah šiestich účinných zložiek, vrátane echinakozidu, verbaskozidu, manitolu, sacharózy, glukózy a fruktózy v 116 šaržiach vzoriek C. tubulosa, ktoré boli odobraté z prefektúry Hotan v Xinjiang v rokoch 2013–2015, najprv stanovil pomocou HPLC. Potom sa vytvorili kalibračné modely týchto šiestich komponentov metódou čiastočnej regresie najmenších štvorcov (PLSR). Tieto modely sa potom validovali s korelačným koeficientom a chybami predikcie v kalibračných súboroch. Výsledky ukázali, že vyvinutá metóda môže byť použitá ako spoľahlivá metóda na kvantitatívnu analýzu C. tubulosa.

Výsledok

HPLC analýza

Obsah echinakozidu a verbaskozidu bol stanovený v literatúre dobre definovanou metódou HPLC-UV [3,23] a štyri sacharidy (manitol, sacharóza, glukóza a fruktóza) boli stanovené dobre definovanou metódou HPLC-ELSD v r. literatúru [24] pre všetkých 116 vzoriek. Príprava vzorky a metódy stanovenia boli opísané v častiach 3.1 a 3.3. Obrázok 1 ukazuje charakteristické chromatogramy zmiešaných štandardov. Je možné vidieť, že všetkých šesť účinných zložiek bolo oddelených od základnej línie, a preto ich bolo možné kvantifikovať. Pred testovaním vzorky bola validovaná metóda HPLC. Hlavné výsledky metódy HPLC sú uvedené v tabuľke 1. Priaznivý lineárny vzťah (r=0.9998) a výťažnosť (98,5 percenta) metódy stanovenia echinakozidu sú uvedené vo výsledkoch, rovnaký výsledok ako pri všetkých päť komponentov. Preto je možné presne určiť obsah šiestich účinných zložiek. Všetky stanovené rozsahy obsahu sú zhrnuté v tabuľke 1.

Analýza NIRS

Obrázok 2 ukazuje NIR spektrá (4000–10,000 cm−1) vzoriek C. tubulosa. Vo všetkých vzorkách sa objavili významné absorpčné píky od 4000 cm-1 do 7500 cm-1, zatiaľ čo jemné výkyvy sa objavili od 7500 cm-1 do 10 000 cm-1. K posunu základnej línie NIR spektier došlo, pretože vzorka bola ľahko ovplyvnená faktormi, ako je veľkosť častíc a farba (obrázok 2A). Na zníženie vplyvu nepotrebných informácií do určitej miery sa použili matematické predbežné úpravy spektier. Matematické predbežné úpravy zahŕňali prvú deriváciu (1. derivácia), druhú deriváciu (2. deriváciu), štandardnú normálnu odrodu (SNV) a multiplikatívnu korekciu rozptylu (MSC). Obrázok 2B ukazuje 2. deriváciu NIR spektier C. tubulosa a evidentne sú pozorované významné variácie, ktoré sa vyskytli z troch oblastí, 4000 – 4500 cm-1, 5000 – 5500 cm-1 a 7000 – 7500 cm-1. .

Vytvorenie kvantitatívnych kalibračných modelov

Čiastočná regresia najmenších štvorcov (PLSR) je klasická modelovacia metóda a je široko používaná v kvantitatívnych modeloch kvôli vysokej kvalite výsledkov. Medzi výhody PLSR patrí dobrá prognostická schopnosť a relatívna jednoduchosť. PLSR sa tiež široko používa pri vytváraní kvantitatívnych kalibračných modelov TCM [25]. Na základe vopred upravených spektier NIR a modelu kvantitatívnej analýzy NIR pre šesť účinných zložiek v C. tubulosa sa stanovil pomocou metódy PLSR s údajmi HPLC analýzy ako skutočnými hodnotami. 116 vzoriek bolo náhodne rozdelených do kalibračných a validačných sád v pomere 3:1. Najvhodnejšie podmienky pre kalibráciu boli zvolené s nízkym RMSEC a vysokým korelačným koeficientom.

Výber vlnového pásma pre kalibračné modely

Výber vhodného vlnového pásma bol dôležitým krokom pri zostavovaní kalibračných modelov. V tejto štúdii sa porovnávali intervalové spektrá NIR 4000–7500 cm-1 (odporúčané softvérom TQ analytik) a 4000–10 000 cm-1. Zistilo sa, že tento rozsah nebol vhodný na kalibráciu v intervale medzi 4000 cm{8}} a 7500 cm{10}} z tabuľky 2. Preto v súčasnej štúdii boli spektrálne intervaly pre šesť chemických zložiek všetky vybrané z intervalu od 4 000 do 10 000 cm-1 porovnaním výkonnosti RMSEC a korelačného koeficientu.

Výber optimálneho počtu faktorov pre kalibračné modely

PLSR vysvetľuje maximálnu mieru variability v údajoch znížením rozmerov spektrálnych údajov výpočtom faktorov. Problém „nedostatočnej vybavenosti“ sa objavil v dôsledku nedostatočných informácií, ktoré vyplývali z obmedzeného počtu faktorov; avšak výber faktorov väčších ako sú optimálne hodnoty zavedené v modeli spôsobí problém „nadmernosti“. Buď „nedostatok“ alebo „nadmernosť“ zníži predikčnú schopnosť zavedených modelov [22]. Obrázok 3 ukazuje vzťah medzi RMSECV a faktormi pre všetkých šesť zlúčenín. Preto sme vybrali tie faktory, ktoré zodpovedajú najnižším hodnotám RMSECV. Optimálny výber faktorov pre kalibračné modely je uvedený v tabuľke 3.

Výber spektrálnej predúpravy pre kalibračné modely

Ďalším najdôležitejším ovplyvňujúcim faktorom pre kalibračné modely je spektrálna predúprava, ktorá je zameraná na zníženie vplyvu rozptylu a posunu základnej čiary, zvýšenie pomeru signálu k šumu a odstránenie nepravidelných variácií. Na elimináciu obvyklého vplyvu rozptylu žiarenia boli použité metódy multiplikatívnej korekcie rozptylu (MSC) a štandardnej normálnej variácie (SNV). Na vyriešenie účinkov základného driftu boli porovnané spektrá 1. a 2. derivácie a bola zvolená 2. derivácia [26]. Pre požadovaný efekt sme pred deriváciou vyhladili spektrá pomocou algoritmu Savitzky-Golay (SG) filtra, aby sa zabránilo zväčšeniu šumu. V tabuľke 3 sú uvedené informácie o spektrálnej predúprave a jej výsledky pre kalibračné modely.

Hodnotenie zavedených modelov

Dobrý kalibračný model NIRS by mal mať nízke hodnoty RMSEC a RMSEP, ako aj vysoký korelačný koeficient (r) a malé rozdiely medzi RMSEC a RMSEP [27–29]. Kalibračné modely šiestich vybraných zlúčenín boli vytvorené podľa postupov uvedených vyššie (tabuľka 3). Hodnoty RMSEC a r pre kalibračnú sadu echinakozidu boli 27,6 a 0,9808, v tomto poradí. Výkonnostné parametre iných modelov chemických zlúčenín sú uvedené v tabuľke 3, z ktorej môžeme vyvodiť záver, že zavedené modely poskytujú uspokojivé výsledky predikcie a možno ich použiť na rýchlu kvantitatívnu analýzu C. tubulosa. Rozptylové grafy šiestich chemických zlúčenín sú znázornené na obrázku 4, aby boli kalibračné modely popisnejšie a vizuálne pozorované. Ako je znázornené na obrázku 4, medzi prediktívnymi a nameranými hodnotami sa vyskytli menšie rozdiely, pretože väčšina bodov bola rozložená okolo regresívnej krivky s rovnicou ako y=x. Preto boli na obrázku 4 pozorované vynikajúce prediktívne výkony.

Materiály a metódy

Príprava vzorky

V rokoch 2013 až 2015 sa z prefektúry Hotan v autonómnej oblasti Xinjiang odobralo 116 vzoriek C. tubulosa. Všetky vzorky boli kultivované, ale boli odobraté v rôznych štádiách rastu. Čerstvá hmotnosť vzoriek sa pohybovala od 20 g do 1000 g. Po vysušení na slnku boli vysušené vzorky rozdrvené a preosiate cez 60-sito [3,23].

NIR spektroskopický zber dát

NIR spektrá vzoriek sa zbierali v intervale 8 cm{1}} v spektrálnej oblasti 4000–10 000 cm-1 systémom Antaris MXFT-NIR (Thermo Scientific, Madison, WI, USA) vybavený ručným adaptérom na odrážanie optických vlákien. Každé spektrum sa získalo spriemerovaním 64 skenov. Všetky vzorky sa nechali ekvilibrovať na teplotu miestnosti (25 °C) pred skenovaním NIR spektier, aby sa zaistilo, že vzorky boli analyzované pri rovnakej teplote. Vlhkosť v laboratóriu bola udržiavaná na úrovni okolia.

Zber údajov HPLC

Príprava na extrakciu

Jeden gram prášku C. tubulosa sa extrahoval 50 ml 50 percentného metanolu v kónickej banke s ultrazvukom (500 W, 40 kHz) počas 30 minút. Extrakt sa skladoval pri 4 °C. Supernatant extraktu sa prefiltroval, aby sa získala vzorka na HPLC analýzu [3,23].

Simultánne stanovenie echinakozidu a verbascozidu s HPLC-UV

Kvapalinová chromatografická analýza sa uskutočnila na systéme Shimadzu UHPLC (Shimadzu, Kyoto, Japonsko) pozostávajúcom z dvoch jednotiek na dodávanie rozpúšťadla LC-20ADXR, čerpadla LC-20AD a vzorkovača SIL-20ACXRauto , kolónová pec CTO-20AC, detektor SPD-M20A DAD, odplyňovač DGU-20A3R a ovládač ICBM-20A.

Kolóna Grace Prevail Carbohydrate ES (150 x 2,1 mm, 2,7 mm) použitá na chromatografické separácie sa udržiavala pri 35 °C. Mobilná fáza pozostávala z acetonitrilu (A) a 0,1 % vodnej kyseliny mravčej (B) a bola dodávaná podľa gradientového programu takto: 0–7 min, lineárny gradient 10–20 percent A; 7–15 min, 20 percent A; a 15–20 minút, lineárny gradient 20–10 percent A. Druhá rýchlosť mobilnej fázy bola 0,4 ml/min. UV monitorovanie sa uskutočňovalo pri 330 nm.

Súčasné stanovenie manitolu, sacharózy, glukózy a fruktózy pomocou HPLC-ELSD

HPLC sa uskutočňovala na LC systéme Agilent série 1100 (Palo Alto, CA, USA) pozostávajúcom z odplyňovača aG1322A, kvartérneho čerpadla G1311A, autosamplera G1311A, regulátora teploty kolóny G1316A a detektora G1315B DAD.

Na chromatografické separácie sa použila kolóna Sigma Prevail Carbohydrate ES (4,6 x 25 0 mm, 5 um) a udržiavala sa pri teplote kolóny 25 °C. Mobilná fáza sa skladala z acetonitrilu a vody (77:23, obj./obj.) a izokraticky sa dodávala pri rýchlosti 0,7 ml/min. Výtok bol monitorovaný pomocou evaporative light scattering detector (ELSD) s predvolenými parametrami [23,24].

Spracovanie dát

TQ Analyst (verzia 8.0, Thermo Scientific, Madison, WI, USA) sa použil na rozdelenie kalibračných a validačných sád, matematické predbežné spracovanie spektier, vytvorenie kalibračných modelov a ďalšie výpočty. Na výrobu figúrok bol použitý Origin (verzia 9.1).

Závery

Poďakovanie: Táto práca bola podporená Národným projektom plánovania vedy a techniky v Číne (2015BAD29B00-04).

Príspevky autora: Xinhong Wang vymyslel a navrhol experimenty. Xinhong Wang a Xiaoguang Wang vykonali experimenty. Xinhong Wang a Yuhai Guo napísali noviny.

Konflikty záujmov: Autori vyhlasujú, že neexistujú žiadne konflikty záujmov.

Referencie

1. Jiang, Y.; Tu, PF Analýza chemických zložiek v cistanche. J. Chromatogr. 2009, 1216, 1970–1979. [CrossRef] [PubMed]

2. Xu, R.; Chen, J.; Chen, S.-L.; Liu, T.-N.; Zhu, W.-C.; Xu, J. Cistanche deserticola Ma pestovaná ako nová plodina v Číne. Genet. Resour. Crop Evol. 2008, 56, 137–142. [CrossRef]

3. Redakcia výboru pre čínsky liekopis. Chinese Pharmacopoeia, 2005. vydanie; Chemical Industrial Press: Peking, Čína, 2005; Zväzok 1, s. 90.

4. Kobayashi, H.; Komatsu, J. Zložky cistanchE herba (1). Yakugaku Zasshi 1983, 103, 508–511. [CrossRef] [PubMed]

5. Pieseň, ZH; Lei, L.; Tu, PF Pokroky vo výskume farmakologickej aktivity v rastlinách cistanche huffing. Et odkaz. Brada. Tradícia. Herb. Drogy 2003, 34, 473–476.

6. Xiong, Q.; Kadota, S.; Tani, T.; Namba, T. Antioxidačné účinky fenyletanoidov z Cistanche deserticola. Biol. Pharm. Bull. 1996, 19, 1580–1585. [CrossRef] [PubMed]

7. Xuan, GD; Liu, CQ Výskum účinku fenyletanoidných glykozidov (PEG) z Cistanche deserticola na anti-starnutie u starých myší vyvolané D-galaktózou. J. Chin. Med. Mater. 2008, 31, 1385–1388.

8. Sato, T.; Kozima, S.; Kobayashi, K.; Kobayashi, H. Farmakologické štúdie na Cistanchis Herba. I. Účinky zložiek Cistanchis Herba na sex a správanie pri učení u chronicky stresovaných myší. Yakugaku Zasshi 1986, 105, 1131–1144. [CrossRef]

9. Shen, CY; Jiang, JG; Yang, L.; Wang, DW; Zhu, W. Účinné zložky proti starnutiu z bylín a nutraceutík používané v tradičnej čínskej medicíne: farmakologické mechanizmy a dôsledky pre objavovanie liekov. Br. J. Pharmacol. 2016, 11, 1395–1425. [CrossRef] [PubMed]

10. Li, N.; Wang, J.; Ma, J.; Gu, Z.; Jiang, C.; Yu, L.; Fu, X. Neuroprotektívne účinky cistanches herba terapie na pacientov so stredne ťažkou Alzheimerovou chorobou. Evid. Založený doplnok. Altern. Med. 2015, 2015. [CrossRef] [PubMed]

11. Gao, JY; Jiang, Y.; Dai, F.; Han, ŽL; Liu, HY; Bao, Z.; Zhang, TM; Tu, PF Štúdia o laxatívnych zložkách v Cistanche deserticola YC Ma. Mod. Brada. Med. 2015, 17, 307–310.

12. Tu, PF; Chen, QL; Jiang, Y.; Guo, YH; Yang, TX; Wang, XY; Aierkan, M.; Li, XB; Du, Y.; Nan, ZD; a kol. Kultivačné techniky Cistanche tubulosa a jej hostiteľa Tamarix spp. Mod. Brada. Med. 2015, 17, 349–358.

13. Tu, PF; Jiang, Y.; Guo, YH; Tian, ​​YZ; Li, XB; Wang, XY; Wei, J.; Chen, QL; Aierkan, M. Rozvoj ekologického priemyslu cistanches herba na podporu ekologickej civilizácie západnej púštnej oblasti. Mod. Brada. Med. 2015, 17, 297–301.

14. Lu, DY; Zhang, JY; Yang, ZY; Liu, HM; Li, S.; Wu, BJ; Ma, ZG Kvantitatívna analýza cistanches herba pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie spojenej s detekciou diódového poľa a hmotnostnou spektrometriou s vysokým rozlíšením v kombinácii s chemometrickými metódami. J. Sep. Sci. 2013, 36, 1945–1952. [CrossRef] [PubMed]Molekuly 2017, 22, 843 9 z 9

15. Jiang, Y.; Li, SP; Wang, YT; Chen, XJ; Tu, PF Diferenciácia byliniek pomocou odtlačku prsta pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie-detekcia diódového poľa-hmotnostná spektrometria. J. Chromatogr. 2009, 1216, 2156–2162. [CrossRef] [PubMed]

    ---