pre viac informácií:{0}}

Časť: II Renálne a extrarenálne prejavy v modeli cystinózy dospelých zebričiek

2.3.5. Ctns−/− Zebrafish má zvýšenú hrúbku rohovky

Cystinózapostihuje oči, čo vedie k akumulácii cystínu v niekoľkých tkanivách, ako je dúhovka, spojovka a epitel sietnice, avšak rohovka je najviac postihnutou časťou kvôli akumulácii cystínu [19] a predstavuje zvýšenú hrúbku [20]. Pomocou farbenia H&E sme zistili, že ctns-/-zebrafish vykazovala zvýšenú hrúbku stromálnej vrstvy rohovky v porovnaní s divokým typom (obrázok 10A, B, E) zebrafish. Neodhalili sme však zjavné abnormality v retinálnom epiteli ctns-/-zebrafish (obrázok 10C, D).

Obrázok 9. Priemerná rýchlosť plávania u divokých a ctns-/-zebrafish. Priemerná rýchlosť je znížená u ctns-/-zebrafish v porovnaní s divokým typom u oboch pohlaví. Priemerná rýchlosť plávania sa meria v pixeloch za sekundu. Každá bodka predstavuje jednu zebričku, teda celkovo n=6 divokých a n=6 ctns−/−18-mesačných zebričiek. Dvojcestná ANOVA s Fisherovým testom najmenšieho signifikantného rozdielu (PLSD): ** p <>

Obrázok 10. Histológia oka u divokých a ctns−/− zebričiek. (A, B) Reprezentatívne snímky rohovky divokého typu (A) a ctns−/− (B) 18-mesačných zebričiek. Stromálna vrstva rohovky (čierne šípky a čierne čiary). Farbenie H&E. Stĺpce stupnice predstavujú 50 um. (C, D) Reprezentatívne snímky sietnice divokých (A) a ctns-/- (B) zebričiek. Farbenie H&E. Stĺpce stupnice predstavujú 50 um. (E) Relatívna kvantifikácia hrúbky stromálnej vrstvy rohovky. Každá bodka predstavuje jeden údaj o hrúbke stromálnej vrstvy rohovky. Nepárový t-test s Welchovou korekciou, obojstranný: * p <>

2.3.6. Ďalšie Ctns-/- fenotypy zebrafish

Okrem fenotypov uvedených vyššie sme vykonali histologickú analýzu mozgu a vaječníkov bez toho, aby sme zistili rozdiely medzi zobričkou divou. Okrem toho sme hodnotili telesnú dĺžku a hmotnosť ctns - / - a zebry divokého typu vo veku 18 mesiacov a zistili sme zvýšenú telesnú hmotnosť inctns - / - zebrafish, zatiaľ čo sme zistili zvýšenú dĺžku tela u ctns - / - zebrafish oboch pohlaví v porovnaní s divokým typom (doplnkový obrázok S1).

3. Diskusia

Počas posledných desaťročí,cystinózasa zo smrteľného ochorenia detského veku pretransformovalo na liečiteľnú metabolickú poruchu, s ktorou môžu pacienti prežiť dospelosť a dosiahnuť pokročilý vek [21,22]. Dlhšie prežitie pacientov odhalilo nové fenotypy chorôb a vyvolalo nové otázky týkajúce sa patogenézy a dlhodobých účinkov terapií. V tomto ohľade sa štúdium cystinózy u dospelých zvierat stáva čoraz relevantnejším.

V súčasnej štúdii sme skúmali obličkové a extrarenálne prejavy cystinózy v modeli dospelej zebry vo veku 18 mesiacov, čo zodpovedá ľudskému veku 40–50 rokov [23,24]. Najprv sme potvrdili, že dospelý model zebrafish ctns-/- predstavuje akumuláciu cystínu v celom tele a rôznych orgánoch. Vobličkyna histologickej úrovni sme pozorovali známky poškodenia PTEC odrážané prítomnosťou mnohých eozinofilných kvapôčok podobných hyalínom, cytoplazmatických vakuol a čiastočnej straty kefových lemov. Okrem toho sa u samcov zebry ctns-/- vyvinula glomerulárna hypertrofia. Nakoniec sme ukázali, že expresia štiepenej kaspázy 3 bola zvýšená v renálnom PTEC ctns-/-zebrafish, čo naznačuje, že apoptóza je zapojená do patogenézy nefropatickej cystinózy u zebrafish. Od rcystinózapacienti sú prítomní aj extrarenálne V našom modeli zebričiek sme skúmali účinok mutácie ctns−/− v iných orgánoch. Je zaujímavé, že sme zistili, že ctns-/- mutácia spôsobila poškodenie anatómie kože a ovplyvnila plodnosť, pohybovú aktivitu a oči.

Lyzozómy sú miestami intracelulárneho trávenia a sú považované za životne dôležité koordinátory bunkového metabolizmu [25]. Ide o lyzozomálne ochorenie, ktoré je kľúčovým znakomcystinózaje akumulácia lyzozomálneho cystínu [26,27]. Je zaujímavé, že sme zistili 54-násobný nárast cystínu v celom tele18-mesiaca cystinózy zubáčovej v porovnaní s divokým typom, zatiaľ čo v našej predchádzajúcej štúdii [10] larvy cystinózy 6 dní po oplodnení vykazovali 13-násobné zvýšenie. Celkovo tieto údaje naznačujú, že cystín sa hromadí počas života u zebričiek cystinóznych. Kvapalinová chromatografia a analýza hmotnostnej spektrometrie potvrdili, že medzi všetkými orgánmi,obličkysare preferované miesto pre akumuláciu cystínu. Lysozomálny opuch a hyalínové eozinofilné kvapôčky vo vnútri lyzozómov boli hlásené v cystínom nabitých PTEC [28,29] a v ľudských biopsiách sa cystínové kryštály javia ako polymorfné tvarové priestory v intersticiálnych makrofágoch a PTEC cytoplazme [27]. V ľudskom tkanive je akumulácia cystínu a kryštalizácia kumulatívny proces, ktorý sa vyskytuje počas života. Cystínové kryštály neboli zistené v ctns-/-zebrafish v štádiu lariev [10], zatiaľ čo v našich pilotných experimentoch sme zistili, že polymorfný tvar cystínových kryštálov sa objavuje vo veku 3 a 6 mesiacov a je jasne viditeľný. vo veku 18-mesiacov, čo naznačuje progresívne zhoršovanie účinkov cystinózy vobličky.

Kliknite naCistanche účinky na ochorenie obličiek

Na posúdenie histologických zmien glomerulov sme merali povrchové plochy Bowmanovej kapsuly, glomerulárneho chumáča a Bowmanov priestor ctns-/-zebrafish na rezoch zafarbených PAS. Zistili sme, že u ctns-/-zebrafish sa vyvinula glomerulárna hypertrofia, čo naznačuje hyperfiltráciu. Mierne glomerulárne poškodenie pozorované u zebričiek možno pripísať regeneračnej schopnosti zebričkyobličkyschopnosť pridať nové nefróny, ako aj opraviť existujúce nefróny [30].

Okrem histologického poškodenia sa ukázalo, že akumulácia cystínu aktivuje proteínkinázu spúšťajúcu apoptózu v PTEC[12]. Vyhodnotili sme teda expresiu štiepenej kaspázy-3 v PTEC a zistili sme, že ctns−/−zebrafish vykazovala zvýšenú kaspázu-3 a jadrovú fragmentáciu. Prítomnosť štiepenej kaspázy-3 bola zistená hlavne v bunkách, ktoré akumulovali cytoplazmatické vakuoly, čo naznačuje, že apoptóza prebieha v poškodenom PTEC. Ďalším mechanizmom, ktorý môže vysvetliť zvýšenú apoptózu, môže byť prítomnosť reaktívnych foriem kyslíka v dôsledku zníženého glutatiónu spojeného s akumuláciou cystínu [31]. Sú však potrebné ďalšie štúdie na vyhodnotenie, či sa tento mechanizmus vyskytuje aj u ctns-/-zebrafish.

Hociobličkysú prvé a najťažšie postihnuté orgány,cystinózaje multisystémové ochorenie, pri ktorom sú zapojené rôzne orgány, ako je koža, pohlavné žľazy, oči a svaly. Z literatúry je známe, že pacienti s cystinózou často vykazujú predčasné starnutie kože, blond vlasy a svetlú farbu pleti [13]. Posledný fenotyp je spôsobený zapojením cysteínového transportéra do regulácie syntézy melanínu[32]a udržiavania tmavšej pigmentácie prostredníctvom novoobjaveného cysteínového transportéra MFSD12 [33]. Je vzrušujúce, že náš dospelý model ctns-/-zebrafish predstavoval hypopigmentovaný a bodkovaný kožný vzor a vykazoval zhoršenú distribúciu melanínu, ktorá nebola pozorovaná v štádiu lariev [10].

Navyše,cystinózaspôsobuje neplodnosť u mužov, zatiaľ čo ženy sú známe ako plodné [14]. Nedávne údaje naznačujú, že neplodnosť môže byť spôsobená progresívnou testikulárnou degeneráciou, ktorá vedie k zmenenej kvalite spermy, alebo obštrukciou v nedefinovanej časti mužského vylučovacieho systému. Zanesené štruktúry môžu ovplyvniť kvalitu spermy, najmä v oblastiach, kde majú kanáliky veľmi malý priemer, napríklad retetestis[16]. Inzebrafish, spermie na génový proces sú veľmi podobné cicavcom; avšak jedným z hlavných rozdielov je, že spermatogenéza prebieha v cystách [34]. V našej štúdii sme zistili zvýšené množstvo spermií v spermatogénnej cyste ctns-/-zebrafish, avšak nezistili sme známky degenerácie semenníkov. Preto by opísaný fenotyp mohol naznačovať obštrukciu na úrovni semenníkov, ktorá vedie k menšiemu uvoľňovaniu spermií do prostredia, avšak na potvrdenie tejto hypotézy sú potrebné ďalšie štúdie. Na funkčnej úrovni sa zdá, že znížený počet vajíčok a znížený počet oplodnených vajíčok odzrkadľujú zhoršenie plodnosti ctns-/-zebrafish.

Ďalším klinickým prejavomcystinóza, ktorá vo všeobecnosti postihuje pacientov od druhej dekády života, je myopatia charakterizovaná ochabovaním svalov a slabosťou [1]. Je zaujímavé, že sme zistili, že ctns-/-dospelé zebričky vykazujú zníženú lokomotorickú aktivitu v porovnaní s kontrolou, čo naznačuje narušenú svalovú funkciu. Je potrebné poznamenať, že tento fenotyp nebol prítomný u lariev [10], čo naznačuje, že ovplyvňuje ctns-/-zebrafish v neskoršom štádiu ochorenia. Napriek tomu sa vo svaloch nezistili žiadne viditeľné histologické rozdiely. Znížená lokomotorická aktivita môže byť spôsobená mitochondriálnou dysfunkciou, ktorú nebolo možné zistiť rutinnými histologickými štúdiami [35–37]. Komplexná charakterizácia mitochondrií pri cystinóze zebrafish vyžaduje ďalšie hodnotenie.

Okrem vyššie uvedených fenotypov niekoľko štúdií ukázalo, že pacienti s cystinózou tiež vykazujú očné symptómy, ako je fotofóbia a blefarospazmus [1], pričom rohovka je jednou z najviac postihnutých častí oka, čo vedie k akumulácii cystínových kryštálov a zväčšeniu hrúbky [20]. O príčinách zväčšenej hrúbky rohovky sa však vie len málo. Napríklad sa predpokladalo, že opísaný fenotyp je spôsobený subklinickou dysfunkciou epitelových a/alebo endotelových buniek, ktorá vedie k vznikustromaledému[20]. V našej štúdii sme zistili, že zobrazenie ctns-/-dospelých zebričiek sa zväčšila hrúbka stromálnej vrstvy rohovky, čo naznačuje, že náš model vykazuje známky dysfunkcie rohovkycystinóza.

Cistanche preobličkyfunkciu

Jedna z hlavných medzier, ktorú treba vyplniť pre komplexné pochopeniecystinózaje nedostatok zvieracieho modelu, ktorý by plne rekapituloval ľudské ochorenie. Bolo vyvinutých niekoľko myších modelov, ktoré vykazujú akumuláciu cystínu, ale nedokážu reprodukovať celýobličkovéfenotyp [8,26]. Konkrétne myš C57BL/6 vykazovala akumuláciu cystínu v niekoľkých orgánoch, ktorá sa zvyšuje s vekom [8]. Okrem toho myšací model C57BL/6 vykazuje proximálne tubulárne lézie začínajúce vo veku 6 mesiacov. Podobne v našom modeli sa proximálne tubulárne lézie časom zhoršujú. Na glomerulárnej úrovni však myšací model C57BL / 6 predstavoval normálny fenotyp, zatiaľ čo náš model dospelých zebričiek vykazuje glomerulárnu hypertrofiu. Okrem toho myšací model C57BL/6 nenapodobňuje zhoršenú fertilitu pozorovanú u ľudí, zatiaľ čo model ctns-/-zebrafish predstavuje spermatogénne cysty obohatené o spermie a zníženú produkciu vajíčok. Na úrovni oka predstavuje myš[38], ako aj model ktns-/-zebrafish okulárne abnormality. Naopak, na úrovni kože tento myšací model nevykazuje zhoršenú produkciu melatonínu [8], ktorá sa v modeli dospelých zebričiek javí ako hypopigmentovaný vzor kože. Nakoniec, na behaviorálnej úrovni, náš model ctns-/- zebrafish predstavuje zníženú lokomotorickú aktivitu, ktorá môže byť spôsobená poruchou mitochondriálnej funkcie alebo môže byť spôsobená sekundárnym účinkom zvýšenej hmotnosticystinózazebrička. Celkovo sa zdá, že náš model ctns−/− zebrafish lepšie rekapituluje ľudskú chorobu. Nedávno Shimizu a spol. vytvoril novú kongénnu mutáciu Ctnsugl v kmeni potkanov, ktorý sa prezentovalobličkovélézie a cystínové kryštály v lyzozómochobličkykôra [7]. Bližšia charakteristika modelu však zatiaľ chýba. Preto existuje naliehavá potreba vyvinúť a charakterizovať nové funkčné modely, ktoré rekapitulujú ľudské choroby.

Na záver sme demonštrovali, že náš dospelý model zebry ctns-/- reprodukuje niekoľko ľudských fenotypov cystínového pieskovca môže byť užitočný na štúdium patogenézy ochorenia u dospelých a na testovanie dlhodobých účinkov nových liekov na korekciu obličiek a extra-obličkovéprejavov.

4. Materiály a metódy

4.1. Údržba a chov zebrafish

So Zebrafish sa manipulovalo a udržiavalo sa v súlade s predpismi KU Leuven o dobrých životných podmienkach zvierat (etické schválenie č. 142/2019). Pre túto štúdiu sme zahrnuli ctns-/-zebričku vo veku 18 mesiacov a kontrolnú zebričku divokého typu u oboch pohlaví. Podrobnosti o generovaní ctns-/-zebrafish boli opísané v našej predchádzajúcej štúdii [10].

4.2. Meranie cystínu

Hladiny cystínu sa merali u zobričiek (samec divého typu, n=3 a ctns-/-samec, n=3) a množstvo bolo vyjadrené ako nmol/mg proteínov. Najprv boli zebričky obetované ponorením do trikaínmetánsulfonátu MS-222 (300 mg/l), potom boli vzorky tkaniva sonikované v prítomnosti 200 ul 5 mM N-etylmaleimidu (NEM, Louis, MO, USA, Sigma-Aldrich E3876) v Dulbeccovom fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku (PBS), pre maximálne 200 mg tkaniva na každý lyzát. Následne sa ku každému homogenátu pridalo 100 ul 12-percentnej kyseliny sulfosalicylovej (SSA) a vzorky sa centrifugovali pri 12,000 g počas 10 minút, 4°C. Supernatanty obsahujúce cystín sa skladovali pri -80 °C až do doby analýzy, zatiaľ čo pelety sa cez noc rozpustili pri 4 °C v 300 ul 0,1 M NaOH a udržiavali sa pri -80 °C, kým sa proteín nezmeral pomocou súpravy Pierce BCA Protein Assay Reagent Kit. Následne sa množstvo (nmol) cystínu normalizovalo na množstvo (mg) proteínu z každej vzorky. Potom sa 50 µl supernatantu obsahujúceho cystín zmiešalo s 50 µl roztoku vnútorného štandardu (Cystine d6) a pretrepávalo sa 5 s; potom sa zmes extrahovala 200 ul acetonitrilu, vortexovala sa 30 s a potom sa centrifugovala pri 16,000 g počas 9 minút. Kvapalinová chromatografia a hmotnostná spektrometrická analýza sa uskutočnili pomocou zariadenia UHPLCAgilent1290InfinityII6470 (Agilent technologies, Santa Clara, CA, USA) vybaveného zdrojom ESI-JET-STREAM pracujúcim v režime kladných iónov (ESI plus). Softvér použitý na ovládanie tohto zariadenia a analýzu údajov bol MassHunter (Work station Agilent Technologies, Barcelona, ​​Španielsko). Použitá separačná kolóna bola InfinityLab Poroshell 120 HILIC 1,9 um 100 x 2,1 mm (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA).

4.3. Hematoxylín a eozín a farbenie kyselinou periodickou - Shiff

Zebrafish (samica divého typu, n=3; samček divokého typu, n=3; ctns−/−samica, n=3; ctns−/−samec, n=3) boli obetované ponorením do trikaínmetánsulfonátu MS{6}} (300 mg/l), potom bola celá zebrička fixovaná v 4 percentnom pufrovanom paraformaldehyde (4 percentá PFA) pri 4 °C počas 1 týždňa . Po dvojnásobnom premytí PBS boli zebričky prenesené do roztoku EDTA (100 mM, pH=8) na dekalcifikáciu počas ďalšieho 1 týždňa, po čom nasledovalo zaliatie do parafínu. Tkanivo zebry zaliate parafínom bolo vyrezané (hrúbka 4-µm) na Leicamikrotóme (LeicaBiosystems, Wetzlar, Nemecko). Rezy boli zafarbené H&E a PAS podľa štandardných protokolov.

Pri histologických štúdiách zobričiek (samice divého typu, n=3 a ctns-/-samice rýb, n=3) boli oči enukleované a fixované v 4% PFA pri izbovej teplote počas 4 hodín. Nasledujúce vloženie do média s optimálnou teplotou rezania (Tissue-Tek® VIP®; Sakura Finetek, Japonsko) boli vyrobené 10-µm kryorezy (Cryostar NX70, Thermofisher Scientific, Tokio, Japonsko). Rezy boli zafarbené H&E podľa štandardných protokolov. Snímky boli vytvorené mikroskopom Leica s jasným poľom (Leica DM6, Wetzlar, Nemecko).

4.4. Imunohistochémia (farbenie štiepenou kaspázou{2}})

Rezy s čerstvo narezaným tkanivom zebry boli zbavené parafinov a rehydratované. Rezy sa podrobili získaniu antigénu vyvolanému teplom s použitím 10 mM citrátového pufra (pH=6). Po blokovaní 5-percentným normálnym kozím sérom (NGS) v dPBS boli rezy inkubované s králičou kaspázou proti štiepeniu-3 (Cell Signaling, Danvers, MA, USA, riedenie 1:200) a následne s anti-králičím -Envision, sekundárna protilátka značená HRP (Dako Products, Agilent, Santa Clara, CA, USA). Ako negatívna kontrola sa použilo normálne králičie sérum. Ako chromogén bol použitý diaminobenzidín (DAB, DAKO, Glostrup, Dánsko). Následne boli rezy kontrastne zafarbené H&E, dehydratované a pripevnené.

Liečba ochorenia obličiek: Cistanche

4.5. Farbenie toluidínovou modrou a TEM

Zebrafishobličkovétkanivá (samce zebričky divokého typu, n=3 a ctns-/-samce zebričky, n=3) boli zozbierané a fixované v EM fixačnom pufri (1,5 percenta glutaraldehydu/1 percenta paraformaldehydu) počas 24 hodín . Následne boli obličkové tkanivá dodatočne fixované 2,5 % glutaraldehydom/1,2 % akroleínom vo fixačnom pufri (0,1 mol/l kakodylátov, 0,1 mol/l sacharózy, pH 7,4) a 1 oxidu osmičelého a zaliate do živice. Polotenké rezy (0.5-μm hrúbka) boli zafarbené toluidínovou modrou. Ultratenké rezy boli zafarbené uranylacetátom. Obrázky boli zhromaždené pomocou JEM-1200 EX transmisnej elektrónovej mikroskopie (JEOL Ltd, Tokio, Japonsko) s rôznymi zväčšeniami.

4.6. Digitálna analýza obrazu

Zafarbené sklíčka boli digitalizované pomocou Philips Ultra-Fast Scanner 1.6 RA (Philips, Eindhoven, Holandsko)

4.6.1. Analýza glomerulárnej hypertrofie

Na analýzu glomerulárnej hypertrofie u zebry sa merali povrchové plochy (µm2) Bowmanovho puzdra, Bowmanovho priestoru a glomerulárneho chumáča na sklíčkach zafarbených PAS. Všetky dostupné glomeruly na sekciu boli zahrnuté a merané pomocou softvéru ImageJ. Na štatistickú analýzu sa použil priemer meraní z každej zebričky.

4.6.2. Analýza výrazov štiepenej kaspázy{3}}

Twoobserversscoredthecleavedcaspase-3expressioninthetubulesofeachzebrafish. The semiquantitative score was conducted on the three randomized tubular fields in each zebrafish(20×magnification). Thepercentageofcaspase-3positivearearelativetothetotal area of tubules was scored as 1 (negative staining), 2 (1–10% positive staining), 3 (10%–25% positive staining), 4 (>25 percent pozitívne zafarbenie). Na štatistickú analýzu sa použil priemer skóre z každej zebričky.

4.6.3. Analýza hrúbky rohovkového stroma

Hrúbka strómy rohovky zebričky (10-násobné zväčšenie) sa merala v rovnakých vzdialenostiach od stredu oka pomocou softvéru ImageJ na zebričke. Pre každý obrázok sa vykonalo n=7 meraní na rôznych miestach v očnej časti (centrálna, stredná, periféria) pozdĺž rohovky v intervaloch 100 uM. Priemer meraní sa použil na štatistickú analýzu.

4.7. Štúdia plodnosti

Plodnosť bola hodnotená párením samíc a samcov zebričky (samce divokého typu, n=4 a samice divokého typu, n=6 a ctns-/-samce, n=4 a ctns−/−samice rýb, n=6) v podnose na neresenie. Nasledujúce ráno, hodinu po svetle, sa odobrali embryá a zaznamenal sa celkový počet vyprodukovaných vajíčok. Oplodnené vajíčka boli testované a spočítané od neoplodnených pomocou svetelnej mikroskopie. Šľachtenie sa uskutočnilo n=7-krát raz týždenne za sebou. Boli vylúčené dva experimenty, ktoré viedli k žiadnej produkcii vajec súčasne u divého typu aj u ctns-/-zebrafish.

4.8. Pohybová aktivita

Zebrafish (samica divého typu, n=6; samček divokého typu, n=6; ctns−/−samica, n=6; ctns−/−samec, n=6) boli umiestnené v bežných bytových jednotkách a po adaptačnom čase 5 minút boli filmované 5 minút. Nahrávanie videa bolo uskutočnené pomocou GoPro® HERO 7 umiestnenej na vrchu nádrže, čo ponúka pohľad zhora na plávajúcu rybu. Rozlíšenie a snímková frekvencia boli nastavené na 1080 p (1920 × 1080) a 30 fps. Videá boli analyzované pomocou zariadenia idTracker.ai, pričom sa sledovali trajektórie, aby sa počas experimentu našli jednotlivé pruhované ryby. Trajektórie boli následne analyzované pomocou vlastného python kódu, aby sa odvodila priemerná lokomotorická rýchlosť (pixel/s) v každej skupine [39].

Cistanche-renal

4.9. Meranie telesnej hmotnosti a dĺžky

Zebričky boli zneškodnené ponorením do 300 mg/Loftricainmetánsulfonátu MS-222. Po overení absencie odozvy na vonkajšie podnety sa usmrtené zebričky umiestnili na papierovú vreckovku a vysušili. Dĺžka usmrtenej zebričky bola hodnotená pomocou posuvného meradla, meraného od špičky tlamy po chvostovú stopku. Hmotnosť usmrtenej zebričky bola hodnotená pomocou analytickej stupnice.

4.10. Štatistická analýza

Štatistická analýza sa uskutočnila pomocou SPSS (IBM, New York, NY, USA) a GraphpadPrism (GraphPadSoftware, LaJolla). Údaje z dvoch skupín boli analyzované pomocou nepárového t-testu s Welchovou korekciou, obojstrannou. Údaje dvoch kategorických nezávislých premenných sa analyzovali pomocou dvojcestnej ANOVA s Fisherovým testom najmenšieho signifikantného rozdielu (PLSD). Rozdiely s p < 0,05="" sa="" považovali="" za="" štatisticky="">

4.11. Štúdia plodnosti

Na porovnanie rýchlostí produkcie vajec medzi divokým typom a ctns-/-zebrafish sa vykonala Poissonova regresná analýza s použitím zovšeobecnených odhadovacích rovníc s robustnými štandardnými chybami, aby sa zohľadnila korelácia mier s experimentmi. Na porovnanie ponuky šancí boli použité vajcia medzi divokým typom a ctns-/-zebrafish. Uskutočnila sa logistická regresná analýza s použitím zovšeobecnených odhadovacích rovníc s robustnými štandardnými chybami, aby sa zohľadnila korelácia pravdepodobnosti v rámci experimentov.

Doplnkové materiály: Nasledujúce materiály sú dostupné online na https://www.mdpi.com/article/ 10.3390/ijms22179398/s1.

Autorské príspevky: Konceptualizácia, SPB, JH, LvdH, HJB, EL; metodika, SPB, JH, LDG, HT, TN, PB, SC, BG; softvér SPB, JH, LDG, HT, TN; validácia, SPB, JH, LDG, PB, LvdH, HJB a EL; formálna analýza, SPB, JH, LDG, HT, TN; vyšetrovanie, LvdH, HJB, EL; zdroje, HJB a EL; spracovanie údajov, SPB, JH, LDG, LvdH, HJB, EL; písanie—pôvodná príprava návrhu SPB, JH; písanie – recenzia a úprava, LvdH, HJB, EL; vizualizácia, LvdH, HJB, EL; dozor, PdW, LvdH, HJB, EL; administrácia projektu, LvdH, HJB, EL; získavanie financií, HJB, EL Všetci autori si prečítali publikovanú verziu rukopisu a súhlasili s ňou.

Financovanie: Autori by radi uznali interný fond od KULeuvenC1GranttoE.L. (C14/17/113), grant Čínskej štipendijnej rady pre JH (CSC n◦ 201508500109) a postdoktorandské štipendium FWO pre LDG (12I3820N).

Vyhlásenie inštitucionálneho revízneho výboru: Štúdia bola vykonaná v súlade s usmerneniami Helsinskej deklarácie a schválená etickou komisiou KU Leuven č. 142/2019. Poďakovanie: Radi by sme sa poďakovali: Didierovi Cagninimu za vyhodnotenie histológie mozgu u ctns-/-a zobry divej, KathleeenLambaerts, Frédéric Hendrickx a KimvanKelst za ich neustálu podporu a pomoc vo vodnom zariadení KU Leuven, Petrovi Neeskensovi za technickú podporu z TEM a Ron Wolterbeek na štatistickú analýzu.

Konflikty záujmov: Autori vyhlasujú, že nie sú konfliktné so záujmom. V dizajne štúdie sa nezapojili donori; pri zbere, analýzach alebo interpretácii údajov; v písaní rukopisu, alebo v rozhodnutí o zverejnení výsledkov.

Referencie

1. Elmonem, MA; Veys, KR; Soliman, NA; van Dyck, M.; van den Heuvel, LP; Levtchenko, E. Cystinóza: Prehľad. Orphanet J. Rare Dis. 2016, 11, 47. [CrossRef]

2. Jezegou, A.; Llinares, E.; Anne, C.; Kieffer-Jaquinod, S.; O'Regan, S.; Aupetit, J.; Chablis, A.; Sagne, C.; Debacker, C.; ChadefauxVekemans, B.; a kol. Heptahelický proteín PQLC2 je exportér lyzozomálnych katiónových aminokyselín, ktorý je základom účinku cysteamínu vcystinózaterapiu. Proc. Natl. Akad. Sci. USA 2012, 109, E3434–E3443. [CrossRef] [PubMed]

3. Besouw, MT; Levtchenko, SK Zlepšenie prognózy nefropatickej cystinózy. Int. J. Nephrol. Renova. Dis. 2014, 7, 297–302. [CrossRef]

4. Brodin-Sartorius, A.; Tete, MJ; Niaudet, P.; Antignac, C.; Hosť, G.; Ottolenghi, C.; Charbit, M.; Moyse, D.; Legendre, C.; Lesavre, P.; a kol. Cysteamínová terapia odďaľuje progresiu nefropatickej cystinózy u neskorých dospievajúcich a dospelých. KidneyInt. 2012, 81, 179–189. [CrossRef]

5. Cherqui, S. Cysteamínová terapia: Liečba cystinózy, nie liečba. Kidney Int. 2012, 81, 127–129. [CrossRef]

6. Dávid, D.; Prince Berlingerio, S.; Elmonem, MA; Oliveira Arcolino, F.; Soliman, N.; van den Heuvel, B.; Gijsbers, R.; Levtchenko, E. Molekulárny základ cystinózy: geografická distribúcia, funkčné dôsledky mutácií v géne CTNS a potenciál na opravu. Nephron 2019, 141, 133–146. [CrossRef] [PubMed]

7. Shimizu, Y.; Yanobu-Takanashi, R.; Nakano, K.; Hamase, K.; Shimizu, T.; Okamura, T. Delécia v géne Ctns spôsobuje renálnu tubulárnu dysfunkciu a akumuláciu cystínu u potkanov LEA/Tohm. Mamm. Genóm 2019, 30, 23–33. [CrossRef]

8. Nevo, N.; Chol, M.; Bailleux, A.; Kalatzis, V.; Morisset, L.; Devuyst, O.; Gubler, MC; Antignac, C. Renálny fenotypcystinózamyšací model závisí od genetického pozadia. Nephrol. Vytočiť. Transplantácia 2010, 25, 1059–1066. [CrossRef] [PubMed]

9. Elmonem, MA; Berlingerio, SP; van den Heuvel, LP; de Witte, PA; Lowe, M.; Levtchenko, EN GenetickýRenálnaChoroby: Vznikajúca úloha modelov zebričiek. Bunky 2018, 7, 130. [CrossRef] [PubMed]

10. Elmonem, MA; Khalil, R.; Chodaparast, L.; Chodaparast, L.; Arcolino, FO; Morgan, J.; Pastore, A.; Tylzanowski, P.; Ny, A.; Lowe, M.; etal. Cystinóza (ctns)zebrafish mutanty vykazujú pronefrickú glomerulárnu a tubulárnu funkciu. Sci. Rep. 2017, 7, 42583. [CrossRef]

11. Lusco, MA; Najafian, B.; Alpers, CE; Fogo, ABAJKDAtlas of RenalPathology:Cystinóza. Am. J.KidneyDis. 2017,70,e23–e24. [CrossRef]

12. Park, MA; Pejovič, V.; Kerisit, KG; Junius, S.; Thoene, JG Zvýšená apoptóza v cystinotických fibroblastoch aobličkovéepitelové bunky proximálneho tubulu sú výsledkom cysteinylácie proteínkinázy C delta. J. Am. Soc. Nephrol. 2006, 17, 3167–3175. [CrossRef]

13. Veys, KRP; Elmonem, MA; Dhaenens, F.; Van Dyck, M.; Janssen, M.; Cornelissen, EAM; Hohenfellner, K.; Reda, A.; Quatresooz, P.; van den Heuvel, B.; a kol. Zvýšené vnútorné starnutie kože pri nefropatickej cystinóze hodnotené optickou koherentnou tomografiou s vysokým rozlíšením. J. Invest. Dermatol. 2019, 139, 2242–2245. [CrossRef]

14. Besouw, MT; Kremer, JA; Janssen, MC; Levtchenko, EN Stav plodnosti u mužov s cystinózou liečených cysteamínom. Fertil. Sterilné. 2010, 93, 1880–1883. [CrossRef]

15. Veys, KR; D'Hauwers, KW; van Dongen, A.; Janssen, MC; Besouw, MTP; Goossens, E.; van den Heuvel, LP; Wetzels, A.; Levtchenko, EN Prvé úspešné počatie vyvolané mužským pacientom s cystinózou. JIMD rep. 2018, 38, 1–6. [CrossRef] [PubMed]

16. Rohayem, J.; Haffner, D.; Cremers, JF; Huss, S.; Wistuba, J.; Weitzel, D.; Kliesch, S.; Hohenfellner, K. Testikulárna funkcia u mužov s infantilnou nefropatickou cystinózou. Hum. Reprod. 2021, 36, 1191–1204. [CrossRef] [PubMed]

17. Blakey, H.; Proudfoot-Jones, J.; Knox, E.; Lipkin, G. Tehotenstvo u žien s cystinózou. Clin. Oblička J. 2019, 12, 855–858. [CrossRef]

18. Dogulu, CF; Tsilou, E.; Rubin, B.; Fitzgibbon, EJ; Kaiser-Kupper, MI; Rennert, OM; Gahl, WA Idiopatická intrakraniálna hypertenzia pri cystinóze. J. Pediatr. 2004, 145, 673-678. [CrossRef] [PubMed]

19. Dixon, P.; Christopher, K.; Chauhan, A. Potenciálna úloha stromálneho kolagénu pri kryštalizácii cystínu u pacientov s cystinózou. Int. J. Pharm. 2018, 551, 232–240. [CrossRef]

20. Katz, B.; Melles, RB; Schneider, JA; Rao, NA Hrúbka rohovky pri nefropatickej cystinóze. Br. J. Ophthalmol. 1989, 73, 665-668. [CrossRef] [PubMed]

21. Nesterová, G.; Gahl, WA Cystinóza: Vývoj liečiteľného ochorenia. Pediatr. Nephrol. 2013, 28, 51–59. [CrossRef] [PubMed]

22. Ariceta, G.; Giordano, V.; Santos, F. Účinky dlhodobej liečby cysteamínom u pacientov scystinóza. Pediatr. Nephrol. 2019, 34, 571–578. [CrossRef] [PubMed]

23. Gilbert, MJ; Zerulla, TC; Tierney, KB Zebrafish (Danio rerio) ako model pre štúdium starnutia a cvičenia: Fyzické schopnosti a trénovateľnosť sa s vekom znižujú. Exp. Gerontol. 2014, 50, 106–113. [CrossRef] [PubMed]

24. Gerhard, GS; Kauffman, EJ; Wang, X.; Stewart, R.; Moore, JL; Kasales, CJ; Demidenko, E.; Cheng, KC Dĺžka života a senescentné fenotypy v dvoch kmeňoch Zebrafish (Danio rerio). Exp. Gerontol. 2002, 37, 1055-1068. [CrossRef]

25. Saftig, P.; Klumperman, J. Biogenéza lyzozómov a lyzozomálne membránové proteíny: Obchodovanie sa stretáva s funkciou. Nat. Mol. Cell Biol. 2009, 10, 623–635. [CrossRef]

26. Cherqui, S.; Sevin, C.; Hamard, G.; Kalatzis, V.; Sich, M.; Pequignot, MO; Gogát, K.; Abitbol, ​​M.; Broyer, M.; Gubler, MC; a kol. Intralyzozomálna akumulácia cystínu u myší bez cystinózy, proteínu defektného pri cystinóze. Mol. Bunka. Biol. 2002, 22, 7622-7632. [CrossRef]

27. Raggi, C.; Luciani, A.; Nevo, N.; Antignac, C.; Terryn, S.; Devuyst, O. Dediferenciácia a aberácie endolyzozomálneho kompartmentu charakterizujú skoré štádium nefropatickej cystinózy. Hum. Mol. Genet. 2014, 23, 2266–2278. [CrossRef]

28. Hard, GC Niektoré napomáhajú histologickému rozpoznaniu hyalínovej kvapôčkovej nefropatie v deväťdesiatdňových štúdiách toxicity. Toxicol. Pathol. 2008, 36, 1014–1017. [CrossRef]

29. Sakarčan, A.; Timmons, C.; Baum, M. Intracelulárna distribúcia cystínu v cystínom naplnených proximálnych tubuloch. Pediatr. Res. 1994, 35, 447-450. [CrossRef]

30. Kroeger, PT, Jr.; Wingert, RA Použitie zebrafish na štúdium genézy podocytov počas vývoja a regenerácie obličiek. Genesis. 2014, 52, 771–792. [CrossRef]

31. Sumayao, R.; McEvoy, B.; Newsholme, P.; McMorrow, T. Akumulácia lyzozomálneho cystínu podporuje mitochondriálnu depolarizáciu a indukciu redox-senzitívnych génov v ľudských obličkových proximálnych tubulárnych bunkách. J. Physiol. 2016, 594, 3353–3370. [CrossRef]

32. Chiaverini, C.; Sillard, L.; Flori, E.; Ito, S.; Briganti, S.; Wakamatsu, K.; Fontas, E.; Berard, E.; Cailliez, M.; Chat, P.; a kol. Cystinozín je melanozomálny proteín, ktorý reguluje syntézu melanínu. FASEB J. 2012, 26, 3779–3789. [CrossRef]

33. Adelmann,CH;Traunbauer,AK;Chen,B.;Condon,KJ;Chan,SH;Kunchok,T.;Lewis,CA;Sabatini,DMMFSD12 sprostredkúva import cysteínu do melanozómov a lyzozómov. Príroda 2020, 588, 699–704. [CrossRef]

34. Leal, MC; Cardoso, ER; Nobrega, RH; Batlouni, SR; Bogerd, J.; Franca, LR; Schulz, RW Histologické a stereologické hodnotenie spermatogenézy zebričiek (Danio rerio) s dôrazom na spermatogoniálne generácie. Biol. Reprod. 2009, 81, 177–187. [CrossRef] [PubMed]

35. Sansanwal, P.; Sarwal, MM Abnormálna mitochondriálna autofágia pri nefropatiicystinóza. Autofágia 2010, 6, 971–973. [CrossRef] [PubMed]

36. Bellomo, F.; Signorile, A.; Tamma, G.; Ranieri, M.; Emma, ​​F.; De Rasmo, D. Vplyv atypickej mitochondriálnej hladiny cyklického AMP pri nefropatickej cystinóze. Bunka. Mol. Life Sci. 2018, 75, 3411–3422. [CrossRef] [PubMed]

37. De Rasmo, D.; Signorile, A.; De Leo, E.; Polishchuk, EV; Ferretti, A.; Raso, R.; Russo, S.; Polishchuk, R.; Emma, ​​F.; Bellomo, F. Mitochondriálna dynamika proximálnych tubulárnych epitelových buniek v nefropatickej cystinóze. Int. J.Mol. Sci. 2019,21,192. [CrossRef]

38. Kalatzis, V.; Serratrice, N.; Hippert, C.; Payet, O.; Arndt, C.; Cazevieille, C.; Maurice, T.; Hamel, C.; Malecaze, F.; Antignac, C.; a kol. Očné anomálie na zvieracom modeli cystinózy napodobňujú patogenézu ochorenia. Pediatr. Res. 2007, 62, 156–162. [CrossRef]

39. Romero-Ferrero, F.; Bergomi, MG; Hinz, RC; Heras, FJH; de Polavieja, GG idtracker.ai: Sledovanie všetkých jedincov v malých alebo veľkých kolektívoch neoznačených zvierat. Nat. Metódy 2019, 16, 179–182. [CrossRef]